Objetivos del tema. El alumno... Conocimiento. Comprensión. Aplicación V. METABOLISMO DEL DNA

Transcripción

1 Objetivos del tema V. METABOLISMO DEL DNA 3. Reparación del DNA El alumno... Revisará los diferentes procesos metabólicos en los que el DNA es la molécula central, i.e., la replicación, la reparación y la recombinación. Describirá la enzimología de los diferentes procesos y destacará la importancia de la fidelidad de la replicación y de la necesidad de conservar la estructura y función del DNA Describirá los daños que causan agentes químicos y físicos al DNA Comprenderá los mecanismos que conducen a una mutación cuando el DNA dañado no es reparado Describirá los principales mecanismos de reparación del DNA (fotoreactivación, reparación por escisión de bases, reparación por escisión de nucleótidos) Reconocerá la importancia de la síntesis de DNA y de las enzimas replicativas en los procesos de reparación del DNA Conocerá la respuesta SOS en bacterias y la función de la reparación sujeta a errores Distinguirá los mecanismos generales de reparación (reparación global del genoma y reparación acoplada a transcripción) en eucariontes Conocerá algunas enfermedades asociadas a defectos en los sistemas de reparación del DNA. X X X X X X X Conocimiento Comprensión Aplicación

2 Reparación del DNA El DNA puede ser dañado de muchas maneras, pero este daño solamente conduce a una mutación cuando NO es reparado. Daño: cambios químicos en el DNA Mutación: cambios en la secuencia de bases del DNA

3 MUTACIONES EN EL DNA Mutaciones espontáneas ( ) Mutaciones inducidas (por mutágenos) Mutaciones puntuales Mutaciones: Adiciones o deleciones de bases Substitución de base: transición (A G; G A) transversión (C G; C A; T G; T A)

4 Tipos de mutaciones de pares de bases Transición (T-A por C-G) CATCCACCTGTACCA GTAGGTGGACATGGT CATTCACCTGTACCA GTAAGTGGACATGGT Transversión (T-A por G-C) CATGCACCTGTACCA GTACGTGGACATGGT Sustituciones de pares de bases transición: pirimidina por pirimidina o purina por purina transversión: pirimidina por purina o purina por pirimidina Deleción o eliminación CATCACCTGTACCA GTAGTGGACATGGT Secuencia silvestre Inserción CATGTCACCTGTACCA GTACAGTGGACATGGT

5 Repercusión a nivel de proteína Mutación sinónima Mutación de error Conservativa No conservativa Mutación sin sentido Mutación de marco

6 Tipos de Daño al DNA. Rayos X y rayos gamma. Ionizan moléculas que rodean al DNA generando radicales libres, algunos de estos contienen oxígeno que tienen un electrón desapareado. Son especies altamente reactivas y pueden atacar la molécula del DNA causando rupturas en una o en las dos cadenas. También pueden modificar quimicamente una base, como la guanina. Generación de 8-oxoguanina. Causa transversiones: GC -> TA

7 Tipos de Daño al DNA. Radiación UV. Formación de dímeros de timina. Entrecruzamiento covalente de pirimidinas adyacentes en la misma cadena de DNA. Generalmente son timinas.

8 Dímeros de timina Exposición a radiaciones ultravioleta

9 Tipos de daño: Alteraciones espontáneas en el DNA

10 Depurinación y desaminación de bases 5000 al día 100 al día

11 Desaminaciones

12 Tipos de Daño al DNA. Desaminación por ácido nitroso. Desaminación de citosina genera uracilo Desaminación de 5- metil citosina genera

13 Depurinaciones Introduction to Genetic Analysis Anthony Griffiths, VIII Ed.

14 Mutágenos Etil Metano Sulfonato: Mutágeno Agente alquilante Transición de base

15 Tipos de Daño al DNA. Alquilación. Metilación o acetilación de las bases en los átomos (O/N) que participan en la formación de puentes de H, desestabiliza la doble hélice de DNA y hace esa zona susceptible a mutación. La presencia de estas regiones dañadas puede causar detención de la replicación, o si ésta continúa, está sujeta a errores.

16 Metabolismo celular Exposición Luz UV Radiación ionizante Exposición Química Errores en replicación Activación Punto de control Ciclo celular Activación Programa transcripcional Reparación de DNA: Reversión directa Excisión de base Excisión de nucleótido Reparación de error Reparación por Recombinación homóloga Apoptosis

17 Cuando los daños no son reparados, se pueden generar cambios en las secuencia de las bases durante la replicación, produciendo una mutación. REPARACIÓN Corrección directa del DNA dañado. Eliminación de la región dañada del DNA y relleno con DNA recién sintetizado.

18 MECANISMOS DE REPARACIÓN 1. Fotoreactivación: ruptura de dímeros de pirimidinas por acción de una fotoliasa (phr) activada mediante luz visible. 2. Reparación por Escisión de bases (BER): DNA glicosilasa (fpg) reconoce el nt dañado, intervienen exo III (xth), endo IV (nfo), de nucleótidos (NER): necesita la otra hebra como molde (hasta 30 bp), intervienen las endonucleasas uvra,b,c y la helicasa uvrd 3. Reparación post- replicativa Reparación de apareamiento erróneo de bases ( mismatch ): una metilasa reconoce DNA recientemente replicado (dam) e intervienen las proteínas mut (helicasas, etc) Reparación por recombinación

19 Reparación Directa de Daños al DNA Fotoreactivación Sistema de reparación que se activa en presencia de luz. Fotoliasa. Detecta al DNA dañado y se une a éste. La enzima absorbe luz azul y se activa. Rompe los enlaces covalentes entre los dímeros de timina. La enzima se disocia y se separa del DNA. Reacción dependiente de FADH

20 Acción de la fotoliasa (fotoreactivación) Reversión directa dímeros de pirimidinas Solo se activa por luz visible

21 Reparación de DNA por Escición Implica la remoción del DNA dañado incluyendo algunas secuencias adyacentes. BER: Base excision repair NER: Nucleotide excision repair

22 Reparación de DNA por Escición de Bases (BER) Cuando una base dañada en el DNA es reconocida, una glicosilasa actúa y rompe el enlace N-glicosídico entre la base y el azúcar. Esto deja un sitio AP (apurínico/ apirimidínico). Una endonucleasa AP reconoce este hueco e hidroliza los enlaces fosfodiéster adyacentes. La DNA pol I repara degradando el DNA (5 ->3 ) y sintetiza DNA nuevo. DNA ligasa sella el último enlace.

23 Las DNA glicosilasas reconocen bases dañadas Reparación por escisión de base BER

24 Reparación de DNA por Escición de Nucleótidos (NER) Escinucleasa uvrabc realiza este tipo de reparación en dímeros de timina, otros fotoproductos y bases dañadas. Escinucleasa (246 kda) está compuesta por tres subunidades (A, B y C) UvrA se une al DNA en la región dañada. UvrB/UvrC tienen actividad de endonucleasa y corta en los lados adyacentes de la cadena liberando un oligonucleótido de unos nts de largo. La región vacía es rellenada por una DNA polimerasa I y sellada por una DNA ligasa.

25 Reparación por escisión de nucleótido NER uvrabc: exinucleasa uvrd: helicasa

26 Reparación por escisión de nucleótidos en bacterias y en humanos

27 BER NER

28 Mismatch repair MutS MutL MutH Cómo se identifica a la cadena molde cuando se repara un error? MutH corta la cadena NO metilada

29 Mismatch repair

30 A pesar de la alta fidelidad que exhiben las DNA polimerasas y de su actividad correctora, pueden cometer errores, dejando las dos cadenas desapareadas. Cómo distingue el sistema de reparación cuál de las dos cadenas debe reparar? Las cadenas parentales están metiladas (-GATC-). Sistema de reparación MUTATOR: Identificación del sitio de desapareamiento y unión al DNA. Corte de la cadena de DNA no metilada. Eliminación del DNA de cadena sencilla. DNA pol III rellena el hueco DNA ligasa sella el último enlace. (NER) Mismatch Repair

31 Mecanismos de reparación postreplicativos

32 La respuesta SOS en E. coli En células sin daño en el DNA, LexA reprime la síntesis de LexA, reca, uvrabc y de otras proteínas involucradas en la respuesta SOS. LexA es una proteína de 22 kda que se une a las regiones operadoras.

33 La respuesta SOS en E. coli Cuando hay daño en el DNA, se activa RecA al unirse al DNA de cadena sencilla y estimular la auto-proteólisis de LexA en un enlace Ala-Gly. Ocurre transcripción de los genes de las proteínas encargadas de la reparación del DNA. Algunos de los mecanismos de reparación regulados por SOS son susceptibles a errores ( error prone ).

34 Genes y proteínas que participan en la Respuesta SOS Nombre del gen Proteína o función en la reparación de DNA Genes de función conocida polb (dina) uvra uvrb umuc umud sula reca dinb Subunidad polimerasa de la DNApol II requerida para comenzar la replicación durante la reparación del DNA en recombinación Subunidades UvrA y UvrB en ABC de la excinucleasa DNA pol V Proteína que inhibe la división celular para dar tiempo a reparación del DNA Proteína RecA requerida para la reparación en recombinación DNA pol IV Genes involucrados en metabolismo de DNA pero de función desconocida en reparación ssb uvrd hima recn Proteína SSB DNA helicasa II Recombinación sitio específica, replicación, transposición, regulación de la expresión Reparación en recombinación

35 Reparación sujeta a errores Cuando se expone E. coli a altos niveles de radiación o a un mutágeno, ocurre un daño extensivo en el DNA. La célula responde induciendo la vía SOS de reparación. Se activan los genes umuc y umud cuyos productos componen las subunidades de la DNA polimerasa V. DNA PolV replica el DNA, aún en regiones donde hay daño y es muy propensa a cometer errores. Se observa una alta tasa de mutación Cepas de E. coli nulas en umuc son inmutables.

36 Reparación de DNA por Recombinación I. Durante la replicación, se brinca la región frente al dímero. + III. Se completa la síntesis de la cadena que sufrió intercambio. El dímero se quedó sin reparar. II. Ocurre intercambio entre las cadenas y recombinación +

37 Reparación por escición de nucleótidos en eucariontes 1. Reparación global de genoma. El heterodímero XPChHR23B localiza lesiones que distorsionan a la doble hélice de DNA. 2. Reparación acoplada a la transcripción. La RNA polimerasa identifica el daño en el DNA. Se detiene la transcripción.

38 Reparación por escición de nucleótidos en eucariontes Una vez que se ha reconocido el daño, participan las mismas proteínas en la reparación. TFIIH (XPB + XPD) que tiene actividad de helicasa es reclutado. XPA y RPA contribuyen a mantener abierta la doble hélice de DNA. XPA guía a las endonucleasas para realizar el corte del DNA. Endonucleasa XPG corta el DNA en el lado 3. El complejo ERCC1-XPF corta del lado 5 de la cadena dañada. El oligonucleótido (24-32nts) con la región dañada es liberado. El hueco es rellenado por la DNA polimerasa o.

39 Enfermedades humanas asociadas con defectos en la replicación o reparación del DNA Asociadas con una alta frecuencia de mutaciones en cromosomas y genes. Algunas se asocian a una alta predisposición a tumores. Xeroderma pigmentosum Mutaciones en genes involucrados en reparación por escición de nucleótidos. Melanoma Ataxia telangiectasia Mutaciones en genes que detectan daño al DNA. Riesgo incrementado a rayos X. Anemia de Fanconi Mutación en gene involucrado en reparación al DNA. Síndrome de Bloom Mutación en una helicasa de DNA. Hipersusceptibilidad a rayos X y a la luz solar. Síndrome de Cockayne (CSA/CSB) Defecto en reparación acoplada a transcripción. Susceptibilidad a luz solar. Síndrome de Werner Mutación en un gen de DNA helicasa. Envejecimiento prematuro.