REPORTE FINAL DE ACTIVIDADES

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1 REPORTE FINAL DE ACTIVIDADES Estancia en la Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa financiada con beca mixta CONACYT 2 de septiembre de de febrero de 2014 Análisis termodinámico del proceso de encapsulamiento del ácido ferúlico con ciclodextrinas, y la elucidación estructural de los complejos. PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 1

2 RESUMEN En este documento se presentan los resultados generados durante la estancia de trabajo que se realizó en la Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, del 2 de septiembre de 2013 al 28 de febrero de El objetivo general de dicha estancia fue evaluar los parámetros termodinámicos del proceso de encapsulamiento del ácido ferúlico (AF) con las α, β y γ ciclodextrinas, y la elucidación estructural de los complejos formados. Las técnicas que se emplearon para lograr el objetivo planteado fueron la calorimetría de titulación isotérmica (ITC), la espectroscopía de fluorescencia, la resonancia magnética nuclear (RMN), la termogravimetría (TGA) así como la calorimetría diferencial de barrido (DSC). Se obtuvieron los valores de la constante de acomplejamiento (K a ) así como de los parámetros termodinámicos de este proceso (ΔH a, ΔS a y ΔG a ) a 25 C y en solución acuosa a ph 9.0, además de la estructura de los complejos formados entre AF y las ciclodextrinas (α, β, γ). Los valores de!g a mostraron que el proceso de encapsulamiento del AF con las tres ciclodextrinas se lleva a cabo de manera espontánea y está entálpicamente dirigida; adicionalmente, en el caso de la βcd y la γcd el termino entrópico también es favorable. El análisis comparativo del valor de la constante de acomplejamiento nos mostró que la βcd fue la más afín, seguido de la γcd y por último la αcd; lo cual se corroboró por estudios de fluorescencia. Estos resultados permitieron hacer el análisis de las fuerzas intermoleculares que gobiernan el proceso de inclusión del AF en las diferentes CD estudiadas en el presente trabajo, así como información estructural de dichos complejos. Los resultados obtenidos por RMN para el complejo formado con γcd mostraron cambios en los desplazamientos químicos, que indican que se llevo a cabo el acomplejamiento. El estudio del complejo con αcd presentó el inconveniente de que la molécula de ácido trimetilsilil propiónico (TSP, usada como estándar interno) comenzó a introducirse en al cavidad de la ciclodextrina de tal manera que se generó competencia entre esta y el AF. Adicionalmente, se hizo un simulación computacional del acoplamiento molecular (docking) para poder dar una posible explicación a nivel molecular de los resultados obtenidos por las técnicas experimentales. Los resultados obtenidos del docking mostraron que el AF se introduce en la cavidad de la molécula de la CD quedando el ácido carboxílico interaccionando con la entrada más ancha de la ciclodextrina, el anillo del benceno se ubicó en el centro de la cavidad de la misma, y el fenol del AF se encontró en contacto con la entrada más estrecha de la ciclodextrina. PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 2

3 La metodología y los resultados son presentados en este documento en el orden de cada una de las metas comprometidas en el plan de trabajo a desarrollar durante la estancia en la UAM-Iztapalapa (Tabla 1). Tabla 1. Metas propuestas para la estancia de investigación, que consistió en un periodo de seis meses. Meta 1 Meta 2 Meta 3 Determinar los parámetros termodinámicos propios del proceso de acomplejamiento del ácido ferúlico (AF) con las ciclodextrinas (α, β, γ) mediante calorimetría de titulación isotérmica (ITC). Determinar la contante de acomplejamiento (Ka) mediante una titulación fluorométrica para contar con una medición alternativa. Obtener la estructura de los complejos del AF con las diferentes ciclodextrinas. META 1. Determinar los parámetros termodinámicos propios del proceso de acomplejamiento del ácido ferúlico con las ciclodextrinas (α, β, γ) mediante calorimetría de titulación isotérmica (ITC). Metodología Se utilizó un calorímetro de titulación isotérmica MicroCal itc200, que consta de un sistema de inyecciones automático, una celda de muestra de 200 "L y una pipeta de 40 "L. Para llevar a cabo la titulación calorimétrica tanto el AF como las ciclodextrinas (CD) fueron disueltas en amortiguador de fosfatos 50 mm, ph "L de la solución del AF fueron colocados en la celda del equipo a una concentración de 3.5 mm, dicha concentración fue establecida en experimentos previos con la finalidad de poder obtener mediciones de calor por encima del limite de detección del calorímetro. El volumen total de ciclodextrinas con el que se tituló a la solución de AF fue de 38.4 "L a una concentración de 130.0, 16.5 y mm de la αcd, βcd y γcd, respectivamente. El programa de inyecciones usado consistió en una primera inyección de 0.4 "L y de 19 inyecciones subsecuentes de 2 "L, con un intervalo de tiempo entre cada inyección de 180 s. Las condiciones en el equipo fueron temperatura de 25 ºC, velocidad de agitación de 1000 rpm y una señal de referencia de 11.4 "cal/s. También se midió el calor de dilución, para lo cual se tituló amortiguador con cada una de las ciclodextrina bajo las mismas condiciones experimentales ya mencionadas. Mediante el software del calorímetro se realizó la integración del área bajo la curva de cada pico, tanto de la reacción de acomplejamiento como la del calor de dilución, a cuyos valores se les restó el calor de dilución, obteniendo de este modo el valor que fue graficado generando la curva de titulación; los datos experimentales fueron ajustados mediante una regresión no lineal, y de esta manera se obtuvieron los valores de la constante de acomplejamiento (K a ), de la entalpía (!H a ) así como de la estequiometría de unión (n). PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 3

4 Posteriormente se calculó la energía libre de Gibbs (!Ga) y la entropía (!Sa) a partir de los parámetros anteriores, con las siguientes ecuaciones: G! = RTlnK! S! = H! G! T Resultados Las titulaciones calorimétricas del acomplejamiento del ácido ferúlico con cada una de las ciclodextrinas (αcd-af, βcd-af y γcd-af) a 25 C estudiadas en el presente trabajo se muestran en la Figura 1. A B C Figura 1. Titulaciones calorimétricas a 25 C de AF con αcd (A), βcd (B) y γcd(c) a ph 9.0. PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 4

5 Las titulaciones calorimétricas mostraron que la formación de los complejos αcd- AF, βcd-af y γcd-af son procesos exotérmicos. Por otro lado, los calores de dilución de las ciclodextrinas fueron endotérmicos los cuales fueron restados de los calores obtenidos en las titulaciones del AF con las ciclodextrinas. Los valores de los parámetros termodinámicos obtenidos mediante calorimetría de titulación isotérmica para el proceso de acomplejamiento del ácido ferúlico con cada una de las ciclodextrinas estudiadas en le presente trabajo se muestran en la Tabla 2. Tabla 2. Parámetros termodinámicos obtenidos por ITC para la formación de los complejos αcd-af, βcd-af y γcd-af. Complejo K a (M -1 )!H a (kj/mol) ln K a!s a (J/mol K)!G a (kj/mol) αcd-af βcd-af γcd-af αcd-af: Complejo alfa ciclodextrina con ácido ferúlico, βcd-af: Complejo beta ciclodextrina con ácido ferúlico, γcd-af: Complejo gama ciclodextrina con ácido ferúlico. Los valores de!g a mostraron que el proceso de encapsulamiento del AF con las tres ciclodextrinas se lleva a cabo espontáneamente a ph 9.0, debido a una entalpia favorable, y en el caso de las β y γ ciclodextrinas además por una entropía de acomplejamiento también favorable. El análisis comparativo del valor de K a mostró que la βcd tuvo mayor afinidad por el ácido ferúlico, seguido de la γcd y por último la αcd, siendo las dos primeras ciclodextrinas las más recomendables para encapsular al AF. PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 5

6 META 2. Determinar la contante de acomplejamiento (K a ) mediante una titulación fluorométrica para contar con una medición alternativa. Metodología Se prepararon soluciones concentradas en amortiguador de fosfatos 50 mm a ph 9.0, tanto de AF (3.5 mm) como de las ciclodextrinas α (130.0 mm), β (16.5 mm) y γ (197.3 mm). Las máximas longitudes de onda de excitación y de emisión para la solución del ácido ferúlico fueron 340 y 445 nm, respectivamente. Estos valores fueron determinados a partir de los espectro correspondientes. El valor de la intensidad de fluorescencia del AF para cada adición de CD utilizada en el programa de titulación fue obtenido a partir del promedio de 83 intensidades registradas durante s. El volumen inicial de AF en la celda fue de 2500 "L a una concentración de mm. El número y volumen de cada una de las inyecciones de la solución de ciclodextrina fue establecido primeramente mediante una simulación basada en estimaciones de la constante de unión. Los datos de intensidad de fluorescencia (F) de cada complejo AF-CD fueron corregidos restándole el promedio de la F del amortiguador. A partir de los valores de la F obtenidos para los complejos se obtuvo el dato de la variable Y mediante la siguiente fórmula: Y = F F! 1 El valor de Y fue graficado contra la concentración de CD, y el valor de K a fue obtenido ajustando los datos experimentales con la siguiente ecuación: Donde A T es la concentración del ácido ferúlico alcanzada en cada adición de titulante. K d es la constante de disociación del complejo. X es la concentración de la ciclodextrina alcanzada en cada adición de titulante. PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 6

7 Resultados En la Figura 2 se presentan los espectros de fluorescencia del AF a diferentes grados de saturación (#) con la CD correspondiente. El grado de saturación del sistema se obtuvo dividiendo la concentración del complejo formado entre la concentración total de AF. En el caso de la αcd se observó un incremento de la fluorescencia, mientras que para las βcd y γcd la fluorescencia disminuyó. Se estableció usar un valor mínimo de # igual a 0.8, con la finalidad de obtener un valor confiable de K a en las curvas de titulación. Figura 2. Espectros de emisión de fluorescencia de los complejos αcd-af, βcd-af y γcd-af. PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 7

8 En la figura 3 se muestran los ajustes de los datos experimentales de obtenidos por ITC, para el complejo αcd-af, βcd-af y γcd-af, a partir de los cuales se obtuvo K a. A B C Figura 3. Ajustes de los datos experimentales generado por titulación fluorométrica, para los complejos αcd-af (A), βcd-af (B) y γcd-af (C). PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 8

9 A partir de los ajustes mostrados en la figura 2, se obtuvieron los valores de K a para cada complejo formado (Tabla 3). Tabla 3. Valores de Ka obtenidos por titulación fluorométrica para el proceso de formación de los complejos αcd-af, βcd-af y γcd-af. Complejo Concentración Ciclodextrina (mm) Kd (M) Ka (M -1 ) αcd-af X βcd-af X γcd-af X αcd-af: Complejo alfa ciclodextrina con ácido ferúlico. βcd-af: Complejo beta ciclodextrina con ácido ferúlico. γcd-af: Complejo gama ciclodextrina con ácido ferúlico. El análisis termodinámico del proceso de acomplejamiento por fluorescencia mostró que la mayor afinidad para encapsular al AF corresponde a la βcd, seguida de la γcd y la de menor afinidad fue la αcd, lo cual concuerda con los resultados obtenidos por la técnica de calorimetría de titulación isotérmica. Por otro lado se observó que la intensidad de fluorescencia aumentó solo para el complejo formado por la αcd, mientras que los complejos formados por la βcd y γcd tuvieron un descenso de la misma. Es importante señalar que para poder graficar los datos experimentales de los complejos formados por la βcd y la γcd se tuvo que modificar la ecuación de (F/FT)-1 a 1-(F/FT), debido a que el valor obtenido era negativo por el decremento en la intensidad de fluorescencia. PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 9

10 META 3. Obtener la estructura de los complejos del ácido ferúlico con las diferentes ciclodextrinas. Resonancia Magnética Nuclear 1 H Metodología Para elucidar la estructura de los complejos AF-CD se utilizó la técnica de Resonancia Magnética Nuclear de protón (RMN 1 H) utilizando un equipo Bruker de 500 MHz a 11.4 T. Para obtener los espectros de RMN las moléculas de AF ciclodextrina se pretrataron manejando pesos iguales (10 mg) y se disolvieron en 60 "l de una solución amortiguadora de fosfato deuterada a ph 9 (50 mm de NaH 2 PO 4, 0,05% de 3-(trimetilsilil)-propionato-2,3- d4 (TSP) de sodio). El experimento se llevo a cabo a una temperatura de 25 ºC y el TSP fue utilizado como referencia para realizar una mejor asignar los desplazamientos químicos, ya que la señal del TSP aparece a 0 ppm. Para la formación del complejo se mezcló 0.5 g de AF con 1 g de CDs en 50 ml de metanol, se mantuvo en agitación constante la solución por 24 horas en frascos de vidrio color ambar, esto a temperatura ambiente. Una vez transcurrido este tiempo se evaporó el metanol 45 ºC y en vacío utilizando un rotavapor. El complejo formado se retiro de las paredes del matraz y se colocó en capsulas de porcelana y se introduce en una estufa a temperatura de 60 ºC durante 18 horas para terminar de retirar el vapor y agua contenidos en la muestra. Finalmente se retira el polvo de las capsulas de obteniendo el complejo en forma de polvo Los espectros de RMN 1 H de las ciclodextrinas y el AF presentaron desplazamientos químicos característicos de estas estructuras debido a los acoplamientos de los protones; mientras que, los espectros de RMN 1 H para las ciclodextrinas acomplejadas con el AF presentaron desplazamientos químicos diferentes a las moléculas precursoras, debido a que los complejos tienen acoplamientos entre el AF y la correspondiente ciclodextrina. Resultados Los desplazamientos químicos observados a partir de los espectros de RMN, obtenidos para el complejo γcd-af y para el AF en forma libre se presentan a continuación. Ubicación del protón en el AF Desplazamiento químico de los protones del AF formando el complejo Desplazamiento químico de los protones del AF sin formar el complejo A B C D E PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 10

11 En la figura 4 están identificados con letras los protones en los que se observó un desplazamiento químico. A E C D B Figura 4. Molécula de AF, ubicando a los protones con desplazamiento químico. Los acoplamientos entre protones vecinos resultaron en desplazamientos químicos específicos para las ciclodextrinas (Figura 5a), el AF mostró una serie de señales debidas a los protones del anillo aromático, mientras que la señal esperada para el protón ácido no apareció ya que, la molécula se logró acomplejar entre ella misma a través de dicho protón (Figura 5b); como puede apreciarse en las figuras 5c y d, las interacciones por puentes de hidrógeno en los complejos generados entre la molécula de AF con la γcd (Figura 5c). A B C D Figura 5. Espectros de RMN de γcd (A), AF (B), complejo αcd-af (B), y del complejo γcd-af (C). PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 11

12 Para el complejo formado con γcd se observaron cambios en los desplazamientos químicos, los cuales indican que se llevo a cabo el acomplejamiento. El estudio del complejo con αcd presentó el inconveniente de que la molécula de TSP comenzó a introducirse en la cavidad de la ciclodextrina de tal manera que se generó competencia entre esta y el AF (figura 5). Lo anterior se pudo observar debido a que la intensidad en la señal del TSP era muy baja, y no había manera que esto ocurriera a menos que algunas moléculas del TSP presentes se introdujera en la cavidad de la ciclodextrina. Se aumentó la temperatura de estudio (30, 35 y 40 ºC), para obligar a la molécula TSP a que se desplazara fuera de la cavidad, sin embargo, la intensidad de TSP fue insuficiente para considerarse como de referencia. El hecho de que el complejo formado con αcd tuviera la facilidad de desprender al AF e introducir al TSP corrobora la mayor afinidad que presenta por encapsular la γcd al AF que el αcd, bajo las condiciones de ph 9, esto concuerda con lo observado por los valores de las contantes de acomplejamiento obtenidas por fluorescencia y calorimetría de titulación isotérmica. Los análisis del estudio del complejo formado con γcd y αcd mostraron que había un exceso molar de AF, esto se observó al momento de realizar las integraciones de las intensidades respectivas en los espectros de protón. El exceso molar presentado fue de 6.8 y 1.4 para el complejo formado por la γcd y la αcd. Se consideró realizar nuevos análisis en los cuales no se presente el inconveniente de la sustitución de la molécula de referencia en alguna de la cavidades de las ciclodextrinas, que se mantenga una relación molar la cual permita mostrar las interacciones entre el AF y cada una de las ciclodextrinas. También establecer las condiciones adecuadas de ph y concentraciones de cada una de las moléculas para obtener resultados donde los desplazamientos químicos se den por la interacción entre AF y ciclodextrinas y no por efecto de dilución. Estudio de las propiedades térmicas del complejo mediante DSC y TGA. Metodología El análisis de las propiedades térmicas mediante Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) y Análisis Termogravimétrico (TGA), se realizó con el equipo NETZSCH. Para ambas pruebas los pesos de las muestras utilizados fueron de 5 a 10 mg. Cada una de las muestras se colocaron en el porta-muestras y fue llevada de manera automática al interior del equipo para incrementar la temperatura gradualmente (5ºC/min), se considero flujo de nitrógeno para evitar que el oxígeno ambiental interfiriera en el proceso, la computadora conectada al equipo registró la pérdida de peso en porcentaje, durante el proceso de calentamiento en un intervalo de temperatura de 0 a 500 C. El estudio térmico de DSC y TGA se realizó para el AF puro, las α, β y γ ciclodextrinas, así como para cada uno de los complejos AF-CD. PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 12

13 Resultados En el análisis de los complejos se encontró que hay un exceso molar de AF, este hecho también fue observado por los experimentos de RMN. El exceso molar no permitió obtener resultados en los cuales se pueda afirmar que hubo un acomplejamiento entre ciclodextrinas y el AF. Mediante los gráficos del análisis térmico se corroboró el exceso molar de AF en los complejos αcd, βcd y γcd elaborados el día 27 de agosto del 2013 ya que el gráfico de DSC indica un pico endotérmico que coincide con el punto de fusión del AF (177 ºC), pero el TGA en ese mismo intervalo de temperatura no presentó ningún escalón indicativo de pérdida de peso, por lo que este pico endotérmico se debió a la transición de fase térmica que se observó en el AF puro, lo cual sugiere que la muestra complejada cuenta con un exceso de AF libre. Por lo anterior, se decidió realizar el análisis de los complejos en una relación molar 1:1 de AF con las ciclodextrinas. Termogramas de los complejos formados por el AF con cada una de las ciclodextrinas α, β y γ, en una relación molar 1:1. Figura 6. Termogramas de DSC de los diferentes complejos de AF con las α, β y γcd en una relación molar 1:1. Complejo αcd Complejo βcd Complejo γcd PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 13

14 y γcd Figura 7. Termogramas de TGA de los de los diferentes complejos de AF con las α, β Complejo αcd Complejo βcd Complejo γcd Los análisis de DSC y TGA de los complejos formados con una relación molar 1:1 de AF y la αcd, βcd y γcd, muestran que en todos los casos se formó el complejo, lo cual se PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 14

15 dedujo en base a los cambios observados en las bandas de los termogramas y a las pérdidas de peso en el estudio de TGA. Estos cambios se puntualizan a continuación. 1.- No se observó ninguna banda endotérmica a la temperatura de fusión del AF, lo que indica que no existe AF libre, pero existen moléculas de AF en la cavidad de la ciclodextrina. Se sugiere que el hidrógeno del AF genera interacciones por puentes de hidrógeno dando como resultado curvas de TGA y DSC que no coinciden con la materias primas puras. 2.-Los puntos de fusión de cada una de las ciclodextrinas están por debajo de los 300 ºC, y se observó que una vez formado el complejo estos puntos de fusión se incrementaron por arriba de los 300 ºC. 3.-El estudio de TGA indicó que las pérdidas de peso que presentaron las materias primas y los complejos de AF-ciclodextrina ocurrió en diferentes intervalos de temperatura. Los porcentajes de pérdida de peso no coincidieron entre complejos y materias porque está asociada con la pérdida de moléculas de agua, lo cual demuestró que hubo diferencia en las interacciones y enlaces formados por el agua con el complejo y con la ciclodextrina sola. Estudio del acomplejamiento entre β CD y AF mediante simulación computacional (Docking). Metodología Se utilizó el programa Molecular Operating Environment (MOE) para el modelado molecular del proceso de acomplejamiento entre el AF con la βcd. De la base de datos Protein Data Bank ( se tomó la estructura de la βcd, y la molécula de AF se construyó con el programa mencionado. Para obtener las condiciones similares en cuanto el estado de protonación del AF en las pruebas experimentales, se desprotonó al ácido carboxílico de la molécula de AF. Para llevar a cabo la simulación se utilizó un campo de fuerza MMFF94x, empleado regularmente para simulaciones con moléculas orgánicas pequeñas. También se estableció una constante dieléctrica con valor de 4. Una vez construidas y parametrizadas ambas moléculas se realizó una minimización de energía y se inició el proceso de acoplamiento (docking). Resultados Del proceso de acoplamiento se obtuvo una base de datos de las posibles formas en las cuales el AF se introdujo en la cavidad de la βcd, así como las interacciones que presentan cada una de estas. En la Figura 8 se muestran tres posibles formas en representación de varillas y bolas, en las cuales el AF (color verde, azul y rosa) se introdujo en la cavidad de la βcd, los carbonos se muestran en color gris y los oxígenos en color rojo. PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 15

16 Figura 8. Representación de tres posibles formas de interacción del AF con la βcd. Hasta el momento, los resultados obtenidos mostraron que el AF se introduce en la cavidad de la molécula de la ciclodextrina quedando el ácido carboxílico interaccionando con la parte más ancha de la cavidad de la ciclodextrina, el anillo del benceno se ubicó en el centro de dicha cavidad, y finalmente, el fenol del AF se observó en contacto con la parte más estrecha de la mencionada cavidad de la ciclodextrina (Figura 9 y 10). Figura 9. AF, en color azul, dentro de la cavidad de la ciclodextrina representada en color gris con rojo. Figura 10. AF, en color gris con rojo, dentro de la cavidad de la ciclodextrina representada en color azul. Conclusiones Al término de la estancia se cumplió en general con la metas comprometidas. Los ensayos con RMN 1 H, se realizarán nuevamente modificando las condiciones de concentración, para tener resultados confiables. Agradecimientos A la empresa Wacker Mexicana S.A. de C.V., por la donación de las ciclodextrinas comerciales. Armando Torralba González fue financiado con una beca de CONACyT (No ) y con la Beca Mixta aprobada en la Convocatoria 2013-marzo PROCESO DE ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS 16