EFECTO DEL MÉTODO DE SINCRONIZACIÓN DE CELOS Y MANEJO DEL SEMEN CONSERVADO SOBRE LA FECUNDIDAD OVINA. RESUMEN

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1 EFECTO DEL MÉTODO DE SINCRONIZACIÓN DE CELOS Y MANEJO DEL SEMEN CONSERVADO SOBRE LA FECUNDIDAD OVINA. Fernández Abella D. 1, 2,Bonilla Riera, C. 2, Irabuena, O. 3, Sterla, S. 3 RESUMEN Fernández Abella D., Bonilla Riera, C., Irabuena, O., Sterla, S. (2003). Efecto del método de sincronización de celos y manejo del semen conservado sobre la fecundidad ovina. Producción Ovina (16): El principal objetivo de este estudio fue incrementar la fertilidad y la fecundidad obtenidas con semen conservado vía inseminación artificial intrauterina. Se realizaron 3 experimentos, utilizando en total 1279 ovejas y 10 carneros de la raza Merino Australiano. Se evaluaron distintas dosis de de ecg (PMSG), administradas al retirar los pesarios en ovejas sincronizadas con esponjas de MAP (60 mg) y la administración de diferentes dosis de GnRH (5 y 10 µg de Buserelina) administradas 35 horas después de retirados los pesarios. Se determinó el momento de ovulación, tasa ovulatoria y porcentaje de ovejas ovulando. In VITRO se realizaron distintos manejos del semen fresco y evaluación de diferentes diluyentes para la conservación del semen refrigerado (4-5º C). En semen congelado se evaluaron diferentes tratamientos previos al congelamiento (centrifugación, Percoll, swim-up), así como el agregado de estimulantes espermáticos (ácido hialurónico, pentoxifilina). El método clásico de sincronización (ecg sin GnRH) y las mejores combinaciones de ecg y GnRH fueron evaluadas a través de inseminaciones con semen refrigerado y congelado en inseminaciones de primavera y otoño. En primavera el agregado de GnRH (10 µg de Buserelina) al método clásico de sincronización permite mejorar la fecundidad obtenida. En cambio en otoño no se observaron diferencias en la fecundidad utilizando GnRH, salvo cuando la calidad espermática fue mejorada a través del uso de un diluyente específico (Fiser) en semen refrigerado o con el agregado de pentoxifilina al semen descongelado. Otros aspectos tales como forma de conservación del semen refrigerado (pajuelas vs. tubo de ensayo), volumen de dosis utilizando semen congelado son analizados. 1 Secretariado Uruguayo de la Lana (SUL), Rbla Baltasar Brum 3764, Montevideo 11800, Uruguay. ferabe@sul.org.uy 2 Dpto. de Producción Animal y Pasturas, Estación Experimental de la Facultad de Agronomía en Salto , Uruguay. 3 Laboratorio de Inmunología. Facultad de Química. Universidad de la República. Regional Norte. Salto

2 Términos clave: ovinos, fertilidad, método de sincronización, semen refrigerado, semen congelado, GnRH, pentoxifilina. SUMMARY Effects of the oestrus synchronization method and the manipulation of stored semen on sheep fecundity. The main objective of this study was to increase the fertility and the fecundity obtained with stored semen by intrauterine artificial insemination. Three experiments using 1279 ewes and 10 rams of Merino Australian breed were conducted. Different doses of ecg (PMSG), administered at sponge removal in ewes synchronized with MAP (60 mg) and the administration of different doses of GnRH (5 and 10 µg of Busereline) at 35 hours after sponge removal were evaluated. Ovulation time, ovulation rate and percentage of ewes ovulating were determined. Different management of fresh semen and evaluation of different extenders for the conservation of the chilled semen (4-5º C) were done in vitro. Different semen processing were evaluated before cryopreservation (centrifugation, Percoll, swim-up), as well as the addition of stimulating substances (hialuronic acid, pentoxifylline). The classical method of synchronization (ecg without GnRH) and the best combinations of ecg and GnRH were evaluated in inseminations with chilled semen and frozen-thawed semen in spring and autumn. The aggregate of GnRH (10 µg of Busereline) to the classical method of synchronization improved the fertility in spring. In autumn, however no differences in fertility were observed by the use of GnRH except when the chilled semen was stored of Fiser extender or when the sperm quality was improved by the aggregate of pentoxifylline to the thawed semen. Other aspects such as conservation type of the chilled semen (straws vs. tube, volume of dose utilizing frozen-thawed semen are analyzed. Key words: sheep, fertility, oestrus synchronization method, chilled semen, frozenthawed semen, GnRH, pentoxifylline. 2

3 INTRODUCCION En los ovinos, la inseminación artificial (IA.) con semen congelado se realiza por vía laparoscópica en oveja sincronizadas con progesterona o progestágenos. La técnica creada a principios de la década de los 80 (Killeen et al.,1982), determina porcentajes de preñez variables entre 30 y 65%, según la calidad espermática (Azzarini y Valledor, 1988, Tervit et al., 1994, Cueto y Gibbons, 1996). Estos valores son inferiores y muy variables, respectos a los obtenidos por I.A. por la misma vía (intrauterina) con semen fresco (75-85%) o refrigerado (4-5º C) (55-65%) (Maxwell et al., 1993, Fernández Abella et al., 1998). La congelación y la descongelación del semen causan daños ultraestructurales, bioquímicos y funcionales a un porcentaje significativo de espermatozoides, lo que con0lleva a pérdidas de fertilidad (Salamon y Maxwell, 1995). Por otra parte, la metodología de sincronización de celos utilizadas (esponja con progestágenos + gonadotropina coriónica equina (ecg) no es precisa en la sincronización de las ovulaciones, lo que determina que un número variable de ovejas sea inseminado en un momento menos oportuno para lograr la fecundación (Cueto et al., 1994). El principal objetivo de este trabajo fue mejorar la fecundidad obtenida (corderos nacidos / hembras tratadas) por inseminación intrauterina, utilizando semen conservado; definiendo una metodología de trabajo adaptada a las condiciones existentes en el país. Esto determinó el estudio del momento de ovulación y su sincronía, con distintos métodos de sincronización del celo, así como la mejora en la calidad del semen pre y/o post-conservación. Evaluándose la fertilidad obtenida de distintos tratamientos en el semen conservado en interacción con los distintos métodos de sincronización. MATERIALES Y MÉTODOS Ubicación y animales experimentales Los ensayos de campo (inseminaciones artificiales) fueron realizados en el establecimiento Saudades, ubicado en el departamento de Salto (31,25 de latitud sur). Se utilizaron un total de 10 carneros y ovejas de la raza Merino Australiano, pertenecientes a los establecimientos El Totoral y Saudades, respectivamente. Para alcanzar los objetivos fueron planteados tratamientos de manejo del semen conservado (refrigerado y congelado), y por otro lado métodos de sincronización del celo que mejoraran la fertilidad de las ovejas. La evaluación de los mejores tratamientos fueron evaluados a través de la inseminación intrauterina (fertilidad y fecundidad). Manejo del semen Las muestras de semen obtenidas de 10 carneros adultos de la raza Merino Australiano, previamente seleccionados para participar en el ensayo, fueron evaluadas a nivel de campo y de laboratorio. A nivel de campo se determinaron los siguientes parámetros: color, motilidad masal, concentración por fotocolímetro. A nivel de laboratorio se realizó la evaluación de: -Concentración de espermatozoides por recuento en cámara de Makler (Makler, 1978). -Estudio de la motilidad de los espermatozoides de acuerdo a las categorías A, B, C y D en microscopio, 3

4 -Viabilidad de los espermatozoides inmóviles por tinción con eosina (Elliasson y Treinchl, 1971) -Estudios de supervivencia espermática a las 24 y 48 horas en semen conservado y post- descongelación en semen congelado. En los ensayos de conservación de semen se utilizaron diferentes condiciones variando: medios, suplementos, diluciones, atmósferas de incubación entre otros. Medios conservación: a) FISER modificado (leche descremada -citrato de trisódico)+ yema de huevo al 20 % (Fernández Abella et al., 1998), b) HTF % SSS + 20 % yema de huevo, en atmósfera al 5 % en CO 2 (HTF: Human Tubal Fluid) (SSS: Suero sintético sustituto), c) HAM-F % SSS + 20 % yema de huevo en atmósfera al 5% en CO 2 d) HAM-HEPES+ 7.5% SSS+ 20% yema de huevo. Temperatura de conservación: 4-5 º C. Diluciones ensayadas: 1:3, 1:5, 1:7, 1: 2, 1:4 y 1:6, todas ellas por duplicado (I, II). I) Con centrifugación a 500g. II) Sin centrifugación. A las diluciones que fueron centrifugadas se les extrajo el sobrenadante y a las pajuelas se los resuspendió en el medio fresco suplementado (FISER, HTF y HAM respectivamente) llevándolos al volumen original. Las muestras así conservadas fueron colocadas en tubos de ensayo cónicos estériles. Se realizó un pequeño ensayo utilizando en el caso de los medios cuyo ph son dependientes de la concentración de CO 2 (HTF y HAM) conservación en pajuelas que no permiten intercambio gaseoso con el medio (pajuela experimental I.M.V, L Aigle, Francia). La congelación de semen para el grupo testigo fue realizada según Colas et al. (1975). Con el objetivo de mejorar la calidad del semen se ensayaron modificaciones pre y postcongelamiento. Pre-congelamiento se realizaron lavados por centrifugación a velocidad fija, a velocidad oscilante y en gradientes de densidad (Percoll) (Sharma et al. 1997, Ozornek et al. 1994, Larson et al. 1997) para eliminar espermas muertos, detritus, productos de degradación entre otros. También se realizó la técnica de swim-up según García López et al Las muestras así procesadas fueron luego congeladas y los resultados con ellas obtenidos fueron comparados con el grupo testigo. Post-descongelamiento fueron agregados estimulantes de la actividad espermática como lo son el ácido hialurónico y la pentoxifilina (Aribag et al. 1994, Sharma et al. 1996). Se ensayaron distintas concentraciones, tiempos y temperaturas de incubación así como relación de volúmenes adicionados al semen descongelado. Se eligió de acuerdo a los resultados obtenidos trabajar con pentoxifilina a la concentración 2,5 mm. Métodos de sincronización Se analizaron 5 métodos de sincronización, realizándose laparoscopias seriadas cada 6 horas (4 por día) hasta la hora 70 de retirada las esponjas, para evaluar el reclutamiento folicular, momento y tasa ovulatoria. Dicha evaluación se realizó en 2 épocas (Diciembre y Abril), utilizando 11 a 15 ovejas Merino por tratamiento (en 2 repeticiones). Asimismo se introdujeron machos a 24 horas de retiradas las esponjas y se evaluó el número de hembras en celo a la hora 35. Los métodos se basaron en la utilización de esponjas vaginales de 4

5 medroxiprogesterona (60mg, Syntex, Lab. Universal) insertas durante días. Cuando se administró PMSG (ecg, Novormón, Syntex, Lote 0301; Lab. Universal)) se realizó al momento de retirar las esponjas. Mientras que la GnRH (Receptal, Intervet Alemania, Lote 01C21A, Lab. Universal) se aplicó 35 horas después de retiradas las esponjas (Fernández Abella y Villegas, 2002). Los métodos fueron: T1. MAP o 300 U.I. PMSG (Diciembre y Abril, respectivamente) TESTIGO (metodología usada en el MERCOSUR). T2. MAP o 300 U.I. PMSG (Diciembre y Abril, respectivamente) + 10 μg de buserelina (GnRH). T3. MAP + 10 μg de buserelina (GnRH). T4. MAP U.I. PMSG + 10 μg de buserelina (GnRH). T5. MAP U.I. PMSG + 5 μg de buserelina (GnRH). Evaluación de la fertilidad y fecundidad Se evaluaron la fertilidad (la tasa de preñez a los 45 días) y la fecundidad, en inseminaciones intrauterinas realizadas en fin de primavera (Diciembre) y en otoño (Abril). Dicha evaluación se efectúo en ovejas sincronizadas por 3 de los 5 métodos de sincronización analizados (T1, T2 y T5). En el primer año se evaluaron los mejores medios y condiciones de conservación de semen refrigerado, realizando inseminaciones a las 24 y 48 horas de conservación. Se utilizaron 251 y 240 ovejas Merino en Diciembre y Abril, respectivamente, distribuidas en de 33 tratamientos: Cuadro 1. Tratamientos realizados utilizando semen refrigerado a 5º C. Métodos de sincronización PMSG (U.I.) GnRH (μg buserelina) DILUYENTES 24 HORAS 48 HORAS FISER PAJUELA PAJUELA FISER TUBO HAM PAJUELA PAJUELA HAM TUBO con 5% CO2 TUBO con 5% CO2 HAM-HEPES PAJUELA PAJUELA HAM-HEPES TUBO TUBO Las ovejas fueron inseminadas por vía intrauterina con 20 millones de espermatozoides totales, entre las horas de retiradas las esponjas. Al año siguiente ( ) se evaluaron los mejores tratamientos de manejo del semen congelado (precongelación y pos-descongelación), utilizándose 260 y 318 ovejas respectivamente, agrupadas en 12 tratamientos: Cuadro 2. Tratamientos realizados utilizando semen congelado MÉTODOS DE SINCRONIZACIÓN PMSG (U.I.) GnRH (μg buserelina) DILUYENTES PRIMAVERA OTOÑO TESTIGO SI SI SWIM-UP SI SI CENTRIFUGACIÓN SI NO PENTOXIFILINA 0,4 * SI SI PENTOXIFILINA 0.25 NO SI Pentoxifilina 0.4: 2.5 mm pentoxifilina, relación semen descongelado/solución de pentoxifilina 1:1, volumen de dosis 0.4 cc Pentoxifilina 0.25: 2.5 mm pentoxifilina, relación semen descongelado/solución de pentoxifilina 2:1, volumen de dosis 0.25 cc La inseminación se realizó por vía intrauterina con 40 millones de espermatozoides totales, entre las horas de retiradas las esponjas. Análisis estadístico Las diferencias en porcentaje de ovejas en celo y porcentaje de preñez fueron evaluadas a través de la pruebas no paramétricas utilizando el paquete estadístico SYSTAT 7.0 (SPSS Inc, Francia, 1997). 5

6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Manejo del semen in Vitro Se seleccionaron tres medios como diluyentes en la conservación de semen refrigerado de acuerdo a los resultados obtenidos in vitro. La centrifugación ensayada a nivel de laboratorio no produjo mejoras en la calidad del semen por lo que no se utilizó dicho procedimiento en las muestras de semen utilizadas para los ensayos de campo. De los medios dependientes de CO2 para el mantenimiento del ph se eliminó el HTF ya que no produjo resultados superiores al HAM y el precio era mayor por lo que por razones económicas fue suprimido para los ensayos de campo. Además para la preparación del medio FISER modificado se utilizó leche descremada larga vida (U.H.T.), ya que luego de ensayar con diferentes leches en polvo descremadas fue la de mejor rendimiento. Así mismo los mejores resultados de laboratorio en la conservación de semen fueron obtenidos con dicho medio. Resultados similares son reportados por Maxwell y Salamon (1993) utilizando leche U.H.T. En cuanto a los ensayos a nivel de laboratorio con semen congelado, los tratamientos seleccionados precongelación fueron: swim-up y centrifugación. El primero fue el de mejores resultados a nivel de laboratorio, a pesar de esto no se vieron mejoras en los ensayos in vivo. En cuanto a los tratamientos post-congelación el agregado de estimulantes rindió buenos resultados tanto a nivel de laboratorio como in vivo, siendo la pentoxifilina a la concentración 2,5 mm la que produjo un significativo incremento en la fecundidad. Métodos de sincronización Se utilizaron 2 grupos para realizar los 5 tratamientos en 2 repeticiones, teniendo en cuenta la posibilidad de la existencia de cualquier factor adverso, especialmente precipitaciones, que pudiera afectar la realización de los trabajos. Esto no sucedió y la reproducibilidad de los resultados fue muy elevada, lo cual reafirma las observaciones realizadas (Cuadro 3). En primavera no se observan diferencias en el momento de ovulación respecto al retiro de la esponja, coincidiendo con lo citado en la literatura (58-60 horas) (Romano et al, 2001). No obstante en el método T1 la variabilidad del momento de ovulación es mayor, lo cual limita la elección de un momento óptimo para realizar la inseminación. En el otoño T3 y T4 mostraron una tendencia a adelantar la ovulación (54-55 horas), mientras que el método T2 presentó una variabilidad del momento de ovulación marcadamente inferior (coeficiente de variación de 2.6%), lo cual determina que al inseminar a tiempo fijo, se lo esté haciendo en el momento óptimo de la mayoría de las ovejas lo cual estaría favoreciendo la fertilidad (Figuras 1 y 2). En primavera el porcentaje de ovejas que ovulan en el T1 es bajo (46%), lo cual indica que la mitad de las ovejas no son fértiles, y estamos perdiendo en costos de sincronización y semen al realizar este método. Es de destacar que el método es utilizado actualmente y fue utilizado como testigo. El método T3, si bien la GnRH induce la ovulación, al existir un bajo reclutamiento folicular, (por efecto de la época: fotoperíodo) un 25% de las hembras no ovulan. Asimismo en este 6

7 método las ovejas no manifiestan celo (escaso crecimiento folicular) lo cual limitaría la fertilidad del mismo. T2 respecto a T4, no logra diferencias importantes, siendo T4 de menor costo. Tal vez la fertilidad sea superior. T5, a un costo similar al testigo, logra tener mayor porcentaje de ovejas que ovulan. En el otoño el porcentaje de ovejas que ovulan es similar en todos los métodos y acorde con la época del año, salvo en T3 y T4, se alcanzó el 100% de ovejas ovulando dentro de las 70 horas de retirada la esponja. En T3, si bien la GnRH induce la ovulación, al no inducir al reclutamiento folicular (sin PMSG) un 10% de las hembras no ovulan. Al compararse el número de cuerpos lúteos con relación a la totalidad de ovejas tratadas se tornan casi idénticos, debido a la presencia de ovulaciones dobles en T2, T3 y T4, En otoño el número de ovejas en celo a las horas de retiradas las esponjas, es similar en los 5 métodos. La tasa ovulatoria no fue diferente de acuerdo a las estaciones, explicándose esto por el uso de PMSG y/o GnRH. No obstante el porcentaje de ovejas que ovulan fue marcadamente determinado por efecto época, especialmente en el T1. Asimismo, en primavera en el T3 el número de ovejas en celo fue nulo, lo que indicaría el retraso muy marcado en su inicio, lo que determinaría pérdidas importantes en la fertilidad. Por lo expuesto anteriormente, T3 y T4 se descartaron para su uso en los ensayos de fertilidad. Fertilidad y fecundidad Semen refrigerado Los resultados muestran diferencias importantes de acuerdo al diluyente utilizado, así como del método de sincronización. En primavera, el método 5 determinó una menor fertilidad y fecundidad, mientras que el método 2 es el que brinda los mejores resultados en el otoño. Los diluyentes Fiser y HAM Hepes fueron los que permitieron una mejor conservación del semen a 4-5 º C. En ambas estaciones el diluyente Fiser mostró una interacción positiva con el método de sincronización 2 (T2). Por otra parte la utilización de HAM Hepes determina el menor descenso de fecundidad cuando el semen es conservado por 48 horas (24 vs. 48 horas). Las distintas formas de conservación del semen (pajuelas vs. tubo) no mostraron diferencias significativas, esto evitaría la utilización de pajuelas impermeables al O 2, lo cual sólo incrementa el manipuleo y costos de conservación. No existieron diferencias entre primavera y otoño, en parte por ser animales sincronizados con distintas dosis de PMSG (350 vs 300), pero parte de esto fue debido a las altas precipitaciones ocurridas en torno a la inseminación en el otoño (34 mm vs 260 mm, Diciembre y Abril, respectivamente). Semen congelado Los resultados obtenidos son concordantes con los obtenidos utilizando semen refrigerado (AÑO 2). En la primavera el método de sincronización afecta la fertilidad, observándose diferencias entre la utilización de GnRH + PMSG versus PMSG. La administración de GnRH con dosis menores de PMSG no mejora la fertilidad (T5). En otoño la diferencia entre los 2 primeros tratamientos desaparecen (diferencias no significativas). No obstante existe una interacción tipo de tratamiento y método de sincronización. El uso de 7

8 pentoxifilina (2,5 mm) agregado al semen después de la descongelación mejora estadísticamente la fecundidad, especialmente cuando se utiliza el método de sincronización T2 (Cuadro 7). Esto concuerda con lo obtenido con semen refrigerado, donde el mejor diluyente de semen refrigerado (Fiser) mejora la fertilidad, especialmente en interacción con este método de sincronización de celo. La utilización de pentoxifilina en las inseminaciones de fin de primavera-verano, no tuvo resultados positivos (significativos) dado el alto volumen de la dosis utilizada (0, 4 cc), respecto a la utilizada en el otoño (0,25 cc). No obstante, en otoño se realizó un tratamiento testigo con dicho volumen de dosis (0,4cc-pentoxifilina) para confirmar su baja fertilidad. En otras especies, el uso de la pentoxifilina ha determinado mejoras en la calidad del semen cuando es agregada después de su descongelación. (canina: Koutsarova, Todorov y Koutsarov, 1997; equina: Gradil y Ball, 2000; humana: Stanic, Sonicki y Suchanek, 2002). En el presente estudio se ha puesto de manifiesto su efectividad en la especie ovina. El manejo del semen previa congelación a través del método que mejor se desarrolló en el laboratorio (swim-up) no determinó mejoras en la fecundidad del semen. Esto puede deberse a un mayor manipuleo del semen previo a la congelación. CONCLUSIONES Estos resultados permiten concluir que: En primavera, el agregado de GnRH (a las 35 horas después de retiradas las esponjas) (T2) al método clásico de sincronización de celos (T1), permite mejorar la fecundidad obtenida en inseminaciones artificiales intrauterinas. En el otoño la fecundidad es similar utilizando los métodos T1 y T2, salvo cuando la calidad del semen es muy buena o se mejora con la utilización de un diluyente específico: Fiser en semen refrigerado, agregado de Pentoxifilina en semen descongelado. El aumento del volumen de la dosis inseminante (0,4 vs. 0,25), reduce marcadamente la fertilidad. Agradecimientos Se agradece a las Sras. Ofelia Piegas y Ma Ofelia Preve (Saudades) y al Sr. Jorge E. Grasso (El Totoral) por haber colaborado con los animales e infraestructura necesarios para este trabajo. Se agradecen los aportes realizados al protocolo experimental por el Dr. Y. Cognié (INRA-Nouzilly, Francia). Este trabajo fue financiado por el Proyecto LIA-INIA-BID 031. REFERENCIAS 1. AZZARINI, M., VALLEDOR, F Inseminación intrauterina o cervical con semen congelado o fresco en ovejas en celo natural. Producción Ovina 1: ARIBAG, A., JETSAWANGSRI, U., SUKCHAROEN, N., CHANPRASIT Y., NGEAMVIJAWAT J Effects of pentoxifylline on sperm motility characteristics and motility longevity of postthaw cryopreserved semen using computer-assisted semen analysis. J. Med. Ass. 77: COLAS, G. et al Effect of initial freezing temperature, addition of glycerol and dilution on the survival and fertilizing ability of deep frozen semen. J. Reprod. Fert. 42:

9 4. CUETO, M. et al Efecto de la dosis de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG) y momento de inseminación artificial intrauterina con semen congelado sobre la fertilidad de ovejas Merino Australiano. Rev. Arg. Prod. Anim. 13: CUETO, M., GIBBONS, A Inseminación artificial intrauterina en ovejas Merino. Rev. Arg. Prod. Anim. XIV Reunión Latinoamericana de Prod. Anim. 15: ELLIASSON, R., TREINCHL, L Supravital staining for human spermatozoa. Fert. Ster. 22: FERNÁNDEZ ABELLA, D., VILLEGAS, N., BELLAGAMBA, M Comparación de la fertilidad obtenida con semen conservado a 5º C utilizando diferentes diluyentes y métodos de inseminación. Producción Ovina 11: FERNÁNDEZ ABELLA, D., VILLEGAS, N Efecto del momento de administración de GnRH sobre la tasa de concepción de hembras sincronizadas con progestágenos. Producción Ovina 15: GARCÍA-LÓPEZ, N., OLLERO, M., MUIÑO-BLANCO, T., CEBRIAN-PEREZ, J.A A dextran swim-up procedure for the separation of higly motile and viable ram spermatozoa from seminal plasma. Theriogenology 46: GRADIL, C.M., BALL, B.A The use of pentoxifylline to improve motility of cryopreserved equine spermatozoa. Theriogenology 54: KILLEEN, I.D., CAFFERY, G., HOLT, N Fertility of ewes following intrauterine insemination with the aid of a laparoscope. Proc. Austr. Soc. Reprod.Biol. 14: KOUTSAROVA, N., TODOROV, P., KOUTSAROV, G Effect of pentoxifylline on motility and longevity of fresh and thawed dog spermatozoa. J. Reprod. Fert. Suppl. 51: LARSON, J.M. McKINNEY, K.A., MIXON,B.A., BURRY, K.A., WOLF, D.P An intrauterine insemination-ready cryopreservation method compared with sperm recovery after conventional freezing and post.thaw processing. Fert. Ster. 78: MAKLER, A A new chamber for rapid sperm count and motility estimation. Fertility 30: MAXWELL WMC, SALAMON S Liquid storage of ram semen: a review. Reprod Fertil Dev. 5: MAXWELL WMC, et al Fertility of superovulated ewes after uterine or oviducal insemination with low numbers of fresh or frozen-thawed spermatozoa. Reprd. Fert. Dev. 5: ROMANO, J.E., FERNANDEZ ABELLA, D., VILLEGAS, N Effect of the presence of rams on estrus onset, estrus duration and ovulation time in ewes estrus synchronized during the breeding season. App. Anim. Behav.Sci. 73: OZORNEK, M.H., BIELFELD, P., JEYENDRAN, R.S Increased recovery of viable spermatozoa through oscillating centrifugation. Fert. Ster. 70: SALAMON, S., MAXWELL, W.M.C Frozen storage of ram semen. II. Causes of low fertility after cervical insemination and methods of improvement. Review. Anim. Reprod. Sci. 38: SHARMA, R.K., TOLENTINO M.V., THOMAS A.J. AND AGARWAL A Optimal dose and duration of exposure to artificial stimulants in cryopreserved human spermatozoa. The Journal of Urology. 155: SHARMA,R.K., VEMULAPALLI, S., KOHN S., AGARWAL A., Effect of centrifuge speed, refrigeration medium and sperm washing medium on cryopreserved sperm quality after thawing. Arch. Andrology 39: STANIC, P., SONICKI, Z., SUCHANEK, E Effect of pentoxifylline on motility and membrane integrity of cryopreserved human spermatozoa. Int. J. Androl. 25:

10 23. TERVIT, H.R. et al The inseminations of sheep with fresn or frozen semen. Proc. N. Z. Soc. Anim. Prod. 44:

11 Cuadro 3. Momento de ovulación, tasa ovulatoria, porcentaje de ovejas que ovulan y manifiestan celo. PRIMAVERA MÉTODO DE SINCRONIZACION Retiro esponja-ovulación GRUPO (8.08) 58.6 (4.09) 60.2 (2.68) 59.4 (3.7) 56.6 (2.2) (horas) (MEDIA Y DESVÍO ESTÁNDAR) GRUPO (5.03) 59.2 (4.6) 60 (4.9) 60 (3.1) 59 (3.3) TOTAL 58.7 (6.1) 58.9 (4.1) 60.1 (3.6) 59.9 (3.1) 57.9 (2.8) Porcentaje de ovejas que GRUPO ovulan GRUPO TOTAL 46.2 a 83.3 b 75 b 91.7 b 84.6 b Tasa ovulatoria Nivel ovulatorio 054 a 1.00 b 0.75 b 1.00 b 0.93 b Ovejas que manifiestan celo horas (%) 75.0 a b 0 c 25.0 b 41,7 b a vs. b: P < 0.01 OTOÑO MÉTODO DE SINCRONIZACION Retiro esponja-ovulación (horas) (MEDIA Y DESVÍO ESTÁNDAR) Porcentaje de ovejas que ovulan GRUPO 1 58 (8.25) (1.36) (9.26) 55.4 (5.10) (2.12) GRUPO 2 61 (6.27) 57.4 (1.53) (6.32) 55.3 (4.43) 55 (4.54) TOTAL 59.5 (7.0) 57.5 (1.5) 57.1 (7.3) 55.4 (4.4) 54.1 (4.5) GRUPO GRUPO TOTAL Tasa ovulatoria GRUPO GRUPO TOTAL Nivel ovulatorio Ovejas que manifiestan celo horas (%)

12 Cuadro 4. Comparación entre primavera y otoño del momento de ovulación, tasa ovulatoria, porcentaje de ovejas que ovulan y manifiestan celo según método. METODOS RETIRO ESPONJA- PRIMAVERA 58.7 (6.1) 58.9 (4.1) 60.1 (3.6) 59.9 (3.1) 57.9 (2.8) OVULACIÓN (HORAS Y MINUTOS) (MEDIA Y DESVIÓ ESTÁNDAR) OTOÑO 59.5 (7.0) 57.5 (1.5) 57.1 (7.3) 55.4 (4.4) 54.1 (4.5) Porcentaje de ovejas PRIMAVERA 46.2 a 83.3 b 75 b 91.7 b 84.6 b que ovulan OTOÑO Tasa ovulatoria PRIMAVERA Tasa ovulatoria considerando el total de ovejas tratadas OVEJAS QUE MANIFIESTAN CELO HORAS (%) Diferentes letras dentro de una misma fila P< 0.01) OTOÑO PRIMAVERA 0.54 a 1.00 b 0.75 b 1.00 b 0.93 b OTOÑO PRIMAVERA 75,0 a 33,3 b 0 c 25,0 b 41,7 b OTOÑO 50,0 58,3 50,0 58,33 40,0 12

13 Figura 1. Intervalo retiro de la esponja -momento de ovulación según método de sincronización (PRIMAVERA) (media + desvío estándar) horas Tratamiento de sincronización Figura 2. Intervalo retiro de la esponja -momento de ovulación según método de sincronización (OTOÑO) (media + desvío estándar) horas Tratamiento de sincronización 13

14 CUADRO 5. Efecto del tipo de diluyente en la fertilidad y fecundidad obtenida con semen refrigerado (4-5º C). PRIMAVERA 2001& OTOÑO 2002 TRATAMIENTO PMSG PMSG +10 µg GnRH PMSG + 5 µg GnRH PROMEDIO n DILUYENTE FERT FEC FER FEC FERT FEC FERT FEC T FF 53,9 xy 61,5 XY 75,0 x 81,3 X 53,9 xy 61,5 XY 61,9 a 69,0 A 42 FP24 61,5 xy 69,2 XY 76,9 x 84,6 X 31,3 yz 56,3 XY 52,4 a 69,0 A 42 FP48 21,4 z 21,4 Z 46,7 y 46,7 Y 43,8 y 50,0 Y 37,8 b 40,0 B 45 HP24 23,1 z 30,8 YZ 41,2 y 47,1 Y 31,25 yz 37,5 YZ 32,6 b 39,1 B 46 HP48 14,3 z 21,1 Z ,7 z 40,0 Y 13,3 c 20,0 C 45 HT24 35,7 y 35,7 Y 46,7 y 46,7 Y 25,0 z 31,3 z 35,6 b 37,8 B 45 HT48 25,0 z 25,0 Z 43,8 y 43,8 Y 26,7 z 26,7 z 31,9 b 31,9 B 47 HHP24 38,5 y 53,8 XY 50,0 xy 71,4 XY 33,3 yz 40,0 YZ 40,5 ab 54,8 AB 42 HHP48 18,8 z 25,0 Z 28,6 z 35,7 YZ 17,6 z 17,6 Z 21,3 c 25,5 C 47 HHT24 53,3 xy 66,7 XY 53,3 xy 60,0 XY 35,7 yz 35,7 YZ 47,7 a 54,6 A 44 HHT48 21,4 z 28,6 Z 43,8 y 43,8 Y 37,5 yz 37,5 YZ 34,8 b 39,1 B 46 PROMEDIO 32,9 y 39,4 Y 44,9 y 50,3 Y 32,5 yz 39,6 YZ 36,9 b 43,2 B n A (a) vs. B (b) : p < 0.05 ; X (x) vs. Y (y) : p < 0.1 CUADRO 6. Efecto de las horas de conservación del semen refrigerado sobre la fertilidad y la fecundidad. HORAS DE CONSERVACIÓN PMSG PMSG + 10 µg GnRH PRIMAVERA 24 53,5 r 60,5 53,2 r 59,6 (43) (47) 48 25,0 t 27,8 (36) OTOÑO 24 43,6 r 51,3 (39) 48 13,5 t 18,9 (37) r vs. t : p < 0.05 ; y vs. z : p < ,8 t 33,3 (39) 56,1 r 65,9 (41) 32,5 t 35,0 (40) PMSG + 5 µg GnRH 38,3 t 42,5 (47) 28,2 t 28,2 (39) 31,0 t 40,5 (42) 29,3 t 36,6 (41) PROMEDIO 49,6 y 54,0 (137) 28,1 z 29,8 (114) 43,4 y 52,5 (122) 25,4 z 30,5 (118) 14

15 CUADRO 7 Efecto del método de sincronización y tratamiento del semen congelado sobre la fertilidad, la prolificidad y fecundidad. PRIMAVERA 2002 MÉTODO DE SINCRONIZACIÓN PMSG PMSG PMSG + 10 µg GnRH + 5 µg GnRH PROMEDIO FERTILIDAD 29,8 37,4 34,1 33,8 PROLIFICIDAD 1,2 1,15 1,07 1,15 FECUNDIDAD 35,8 43,0 36,5 38,9 n TRATAMIENTO ESPERMÁTICO PENTOXIFILINA 0.4 SWIM-UP CENTRIFUG. TESTIGO PROMEDIO FERTILIDAD 34,4 a 34,4 a 16.4 b 46,8 a 33,8 PROLIFICIDAD 1,14 1,05 1,20 1,16 1,15 FECUNDIDAD 39,3 b 36,1 b 19.7 c 54,5 a 38,9 n PENTOXIFILINA 0.4 SWIM-UP CENTRIFUG. TESTIGO FER FEC FER FEC FER FEC FER FEC PMSG 28,6 33,3 30,0 30,0 14,6 22,7 45,5 54, PMSG + 10 µg GnRH 40,0 45,0 33,3 33,3 15,8 21,0 51,6 61, PMSG + 5 µg GnRH 35,0 40,0 40,0 40,0 19,0 19,0 41,2 45,8 n

16 OTOÑO 2003 MÉTODO DE SINCRONIZACIÓN PMSG PMSG + 10 µg GnRH PMSG + 5 µg GnRH PROMEDIO FERTILIDAD 46,6 48,3 33,3 42,9 PROLIFICIDAD 1,21 1,12 1,35 1,23 FECUNDIDAD 56,6 54,2 45,0 52,8 n TRATAMIENTO ESPERMÁTICO PENTOXIFILINA 0.25 SWIM-UP TESTIGO PENTOXIFILINA 0.4 FERTILIDAD 47,5 35,0 43,2 43,3 PROLIFICIDAD 1,31 1,14 1,2 1,07 FECUNDIDAD 62,3 a 40,0 b 51,8 a b 46,3 b P<0.10 PENTOXIFILINA 0.25 n PMSG PMSG + 10 µg GnRH FERTILIDAD 41,5 58,0 PROLIFICIDAD 1,29 1,27 FECUNDIDAD 53,7 73,7 n P<