6.1 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACION MINIMA. En la siguiente tabla se pueden observar las absorbancias de los cultivos de K.
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- Guillermo Gallego Olivera
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1 6. RESULTADOS. 6.1 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA DE CADMIO. (C.M.I.). En la siguiente tabla se pueden observar las absorbancias de los cultivos de K. pneumoniae y B. subtlis adicionados de diferentes concentraciones de cadmio. En este primer experimento se puede notar un crecimiento similar en las dos cepas usadas y en las cinco concentraciones probadas. Concentración Cadmio (ppm) Absorbancia (620nm) K. pneumoniae B. subtilis Tabla 6.1. Absorbancias para K. pneumoniae y B. subtilis cultivadas en medio V-B con glucosa, adicionado con diferentes concentraciones de cadmio después de un período de incubación de 5 días. En un segundo experimento se adicionó tiosulfato de sodio para poder establecer si la tolerancia de las bacterias al cadmio se debía a un proceso de precipitación como sulfuro de cadmio, y los resultados se indican en la tabla
2 Concentración Cadmio (ppm) Absorbancia (620nm) Sin tiosulfato Absorbancia (620nm) Con tiosulfato K. pneumoniae B. subtilis K. pneumoniae B. subtilis Tabla 6.2. Absorbancias para K. pneumoniae y B. subtilis en presencia y ausencia de tiosulfato de sodio. Se puede observar que el B. subtilis es más sensible al cadmio que K. pneumoniae cuando no se adiciona tiosulfato, sin embargo cuando el medio contiene tiosulfato el comportamiento es muy similar en las dos bacterias. La concentración mínima inhibitoria para ambas cepas se estableció en 25 ppm de cadmio. Además de este análisis, las muestras fueron procesadas para la medición del cadmio utilizando el Espectrofotómetro de Absorción atómica de flama, obteniéndose los resultados siguientes: 40
3 K. pneumoniae B. subtilis inicial (ppm) final (ppm) inicial (ppm) final (ppm) Tabla 6.3. Concentraciones iniciales y finales de cadmio medidas en el sobrenadante de los cultivos en ambas cepas después de un período de incubación de 5 días. En la tabla 6.3 se observa que para ambas cepas el porcentaje de del cadmio es muy similar. Conforme aumenta la concentración de cadmio en el medio, el porcentaje de va disminuyendo, de este modo entre menor es la concentración de cadmio, la capacidad de de las cepas es mayor. Por otro lado los porcentajes de de ambas cepas para las concentraciones de 10, 15 y 20 ppm, con y sin tiosulfato, se presentan en las tablas 6.4 y
4 K. pneumoniae inicial (ppm) Cadmio final (ppm) Sin tiosulfato Cadmio final (ppm) Con tiosulfato Tabla 6.4. Concentraciones iniciales y finales de cadmio para K. pneumoniae medidas en el sobrenadante de los cultivos después de un periodo de incubación de 5 días. Para Bacillus subtilis se observó lo siguiente: B. subtilis inicial (ppm) Cadmio final (ppm) Sin tiosulfato Cadmio final (ppm) Con tiosulfato Tabla 6.5. Concentraciones iniciales y finales de cadmio para B. subtilis medidas en el sobrenadante de los cultivos después de un periodo de incubación de 5 días. Como puede apreciarse en las tablas 6.4 y 6.5, ambas cepas se comportan de manera muy similar, debido a que la reducción del cadmio soluble es mayor cuando el tiosulfato de sodio se adiciona al medio, sobre todo a concentraciones de 10 y 15 ppm. 42
5 6. 2 DETERMINACION DE CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO. Tomando en cuenta los resultados anteriores se decidió trabajar con 2 ppm de cadmio ya que son las máximas concentraciones que se han encontrado en los suelos que se quieren biorremediar, además de que a ésta concentración el crecimiento de las bacterias fue más rápido. En las tablas 6.6 y 6.7 se muestran las lecturas de absorbancia de los cultivos de B. subtilis y K. pneumonia en ausencia y presencia de cadmio. Absorbancia (620nm) sin cadmio Tiempo (hrs) K. pneumoniae B. subtilis ambas cepas Tabla 6.6. Absorbancia medida para K. pneumoniae, B. subtilis y ambas cepas a tiempos determinados, en ausencia de Cadmio. 43
6 Absorbancia (620nm) con cadmio Tiempo (hrs) K. pneumoniae B. subtilis ambas cepas Tabla 6.7. Absorbancia medida para K. pneumoniae, B. subtilis y ambas cepas a tiempos determinados, en presencia de Cadmio. A partir de estos resultados, se presenta a continuación el gráfico donde se muestran las comparaciones entre las curvas de crecimiento bacteriano de K. pneumoniae, en presencia y ausencia de cadmio. 44
7 0.15 Absorbancia (620 nm) Tiempo (hrs) Sin cadmio Con cadmio Gráfico 6.1. Curvas de crecimiento para la cepa K. pneumoniae en presencia y ausencia de Cadmio. En la curva de crecimiento para K. pneumoniae en ausencia del metal, mostradas en el gráfico 6.1, se observa una curva clásica de crecimiento bacteriano, con una fase lag de 4 horas, seguida de una etapa exponencial a que dura aproximadamente 21 horas y una fase estacionaria que se mantiene hasta las 80 horas. Por otra parte, en este mismo gráfico se presenta la curva de crecimiento de K. pneumoniae en presencia de Cadmio, en donde se aprecia una fase lag a partir de las 4 horas de crecimiento, seguida de una fase exponencial que dura cerca de 18 horas, desde las 4 hasta las 22 horas aproximadas de la inoculación, y posteriormente una fase estacionaria. 45
8 De este modo se aprecia claramente que la cepa K. pneumoniae presenta una curva de crecimiento muy similar tanto en presencia como en ausencia de cadmio, a partir de la inoculación, con una fase lag bien caracterizada; se alcanza el punto máximo de la fase exponencial en un mismo tiempo, a partir del cual se observa una clara fase estacionaria. Al graficar los valores de las tablas 6.6 y 6.7 obtenidos para B. subtilis en ausencia y presencia de cadmio, puede observarse la comparación entre cada una de las curvas como se muestra a continuación: 0.12 Absorbancia (620) Tiempo (hrs) Sin cadmio Con cadmio Gráfico 6.2. Curvas de crecimiento para la cepa B. subtilus en presencia y ausencia de Cadmio. 46
9 En la curva sin cadmio, se aprecia que la cepa presenta una fase lag de 6 horas, y llega a una fase exponencial hasta las 26 horas aproximadas de inoculación, posteriormente comienza una ligera reducción en el crecimiento bacteriano, denotada por un decremento en la absorbancia leída en el medio. Así mismo se observa que B. subtilis, en presencia de cadmio, sufre una notable disminución en la absorbancia leída, por lo que dicha cepa no forma una curva de crecimiento típica, si no al contrario, desde el momento de la inoculación se observa un fase lag de aproximadamente 4 horas a partir del cual, se aprecian disminuciones severas en la curva de crecimiento con ligeras fluctuaciones. Por lo tanto, como se ha mencionado, B. subilis se ve claramente influenciada por el cadmio presente en el medio, debido a que en presencia de éste las células mueren inmediatamente después de las 4 horas. Finalmente, para los matraces que contenían tanto K. pneumoniae como B. subtilis, el gráfico respectivo que muestra la comparación de las curvas de crecimiento bacteriano en ausencia y presencia de cadmio muestra lo siguiente: 47
10 0.19 Absorbancia (620) Tiempo (hrs) Sin cadmio Con cadmio Gráfico 6.3. Curvas de crecimiento de un cultivo mixto de K. pneumoniae y B. subtillis en presencia y ausencia de Cadmio. Se observa que la fase exponencial se alcanza a partir de las 3.5 horas aproximadas posterior a la fase lag, con una duración aproximada de 20.5 horas en donde se llega a una fase estacionaria. Al estar el metal presente, se observó claramente una curva de crecimiento bacteriana típica, con una fase lag de 3.5 horas, alcanzando la fase exponencial después de este tiempo y manteniéndose hasta las 22 horas aproximadas desde la inoculación, logrando una posterior fase estacionaria. En el gráfico 6.4 se comparan de las curvas de crecimiento de K. pneumoniae, B. subtilis y el cultivo mixto en un medio sin cadmio. 48
11 0.18 Absorbancia (620 nm) Tiempo (hrs) K. pneumoniae B. subtillis K. pneumoniae y B. subtillis Gráfico 6.4. Curvas de crecimiento bacteriano de K. pneumoniae, B. subtilis y del cultivo mixto cuando crecieron sin cadmio. Aquí apreciamos que la cepa K. pneumoniae y el cultivo mixto presentan un comportamiento muy similar, mientras que B. subtilis, a pesar de presentar una curva de crecimiento representativa, muestra una fase exponencial mas corta y una fase estacionaria con una ligera disminución en el número de células presentes. 49
12 Las comparaciones entre las curvas de crecimiento de K. pneumoniae, B. subtilis y el cultivo mixto crecidas en medio con cadmio se muestran a continuación: Absorbancia (620 nm) Tiempo (hrs) K. pneumoniae B. subtillis K. pneumoniae y B. subtillis Gráfico 6.5. Curvas de crecimiento bacteriano de K. pneumoniae, B. subtilis y el cultivo mixto en medio con cadmio. Igual que el caso anterior, K. pneumoniae y el cultivo mixto se comportan de manera muy similar, no así B. subtilis en el cual se aprecia una marcada sensibilidad al cadmio, ya que las células bacterianas mueren inmediatamente después de entrar en contacto con el metal. 50
13 6.3 DETERMINACION DE CINETICAS DE INMOVILIZACION DEL CADMIO BAJO CONDICIONES DE LABORATORIO. En la tabla 6.8 pueden observarse las concentraciones finales de cadmio, así como el porcentaje de respectivo, presentados para K. pneumoniae, B. subtilis y el cultivo mixto. B. subtilis K. pneumoniae ambas cepas Tiempo (hrs) Tabla 6.8. Concentraciones de cadmio determinadas en el sobrenadante de los cultivos y porcentaje de para B. subtilis, K. pneumoniae y el cultivo mixto. En la gráfica siguiente, puede apreciarse una comparación en las curvas de de cadmio representadas para estas cepas. Como se observa las tres curvas 51
14 de presentan un comportamiento muy similar, representando un decremento importante en la primera media hora, a partir de las cuales hay un ligero incremento y posteriores fluctuaciones pequeñas Concentración cadmio (ppm Tiempo (hrs) K. pneumoniae B. subtillis K. pneumoniae y B. subtillis Gráfico 6.6. Curvas de de cadmio para K. pneumoniae, B. subtilis y el cultivo mixto. 52
15 6.4 CORRELACION ENTRE ABSORBANCIA Y NUMERO DE CELULAS La tabla 6.9 muestra los datos de número de células y absorbancia para la cepa K. pneumoniae, tomadas en tres diferentes tiempos. Klebsiella pneumoniae Tiempo (hrs) Absorbancia (620 nm) Número de células x x x 10 7 Tabla 6.9. Datos de número de células y absorbancia para K. pneumoniae Graficando los valores de la tabla 6.9, se obtiene el gráfico mostrado a continuación: Número de células Millones Absorbancia (620 nm) Gráfico 6.7. Correlación entre absorbancia y número de células para K. pneumoniae 53
16 Graficando absorbancia contra el número de células, se observa una recta común dada por tres puntos, que va a servir para obtener los valores del número de células respectivos a cada una de las absorbancias medidas para K. pneumoniae en ausencia de cadmio. En la siguiente tabla se observan los valores de absorbancia y número de células, que se obtuvieron extrapolando los valores de absorbancia en la gráfica 6.7, así como el valor para el logaritmo del número de células. Klebsiella pneumoniae Tiempo (hrs) Absorbancia (620 nm) Número de células Logaritmo No. Células x x x x x x x x Tabla Valores de Absorbancia, Número de Células y logaritmo de Número de células para K. pneumoniae en tiempos determinados en ausencia de cadmio. 54
17 La siguiente gráfica muestra la curva de crecimiento para K. pneumoniae, graficando el número de células contra el tiempo. Número de células Millones Tiempo (hrs) Gráfico 6.8. Curva de crecimiento de K. pneumoniae Analizando la fase exponencial de esta curva de crecimiento se pudo obtener el tiempo de generación para esta cepa bajo las condiciones de cultivo ya especificadas, el cual fue de 1 hora y 30 minutos aproximadamente. 55
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