UNIVERSIDAD NACIONAL DE CORDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS ESCUELA PARA GRADUADOS INSTITUTO DE REPRODUCCIÓN ANIMAL CÓRDOBA (IRAC)

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE CORDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS ESCUELA PARA GRADUADOS INSTITUTO DE REPRODUCCIÓN ANIMAL CÓRDOBA (IRAC) EFECTO DE PGF2 α AL INICIO DE UN PROTOCOLO DE SINCRONIZACIÓN A TIEMPO FIJO SOBRE EL TAMAÑO FOLICULAR, MANIFESTACION DE CELO Y EL PORCENTAJE DE PREÑEZ EN VAQUILLONAS BOS INDICUS X BOS TAURUS Ing. Agr. Marcos Zenobi Trabajo Final Para optar al Título de Especialista en Reproducción Bovina Córdoba, 2014 i P ág i n a

2 AGRADECIMIENTOS Agradecimientos especiales al Dr. Ricardo Tribulo, Paula Tribulo, Andrés Tribulo y Eduardo Vaschuck por su colaboración en la recolección de datos y asistencia en el análisis de la información. 1 P á g i n a

3 RESUMEN El objetivo de este experimento fue evaluar las tasas de preñez en vaquillonas cruzas tratadas con PGF2 α al momento de iniciar un protocolo de IATF. El experimento se llevó a cabo en un establecimiento ubicado al norte de la provincia de Córdoba. Se utilizaron 89 vaquillonas cruzas Bos indicus x Bos taurus, entre 17 y 24 meses de edad, con una condición corporal entre 2,5 y 3 (escala de 1 a 5). Vaquillonas con presencia de cuerpo lúteo (CL) al momento de inicio del protocolo de sincronización fueron aleatoriamente divididas en Grupo 1 y 2 mientras vaquillonas sin presencia de CL fueron asignadas al Grupo 3. Vaquillonas del Grupo 1 (n=35) recibieron en el D0, 2 mg de benzoato de estradiol (Zoovet, Argentina) junto con la aplicación de un dispositivo intravaginal de 0,75 gr de progesterona (Pro-Ciclar, Zoovet, Argentina) y 75 µg de D(+) Cloprostenol (Ciclar, Zoovet, Argentina). Por otra parte las vaquillonas del Grupo 2 (n=35) y 3 (n=19) solo recibieron 2 mg de benzoato de estradiol (Zoovet, Argentina) junto con la aplicación de un dispositivo intravaginal de 0,75 gr de progesterona (Pro ciclar; Zoovet, Argentina) el D0. En el D7 se removieron los dispositivos y se administró 150 µg de D(+) Cloprostenol (Ciclar, Zoovet, Argentina) y 1 mg de cipionato de estradiol (Cipiosyn, Syntex, Argentina) por vía IM. En el D9 todas las vaquillonas fueron inseminadas a tiempo fijo (56 58 h post retiro de dispositivo intravaginal). Los datos fueron analizados por regresión logística. No se encontraron diferencias significativas debidas al semen utilizado o a la condición corporal. No se detectaron diferencias en las tasas de preñez (P=0.30), expresión de celo (P=0.07), ni tamaño folicular a la IATF (P=0.12) entre grupos. Las vaquillonas que presentaban CL al D0 independientemente del tratamiento, tuvieron mayor proporción de folículos >9 mm de diámetro al día de la IATF (P=0.04). Contrariamente, hubo una tendencia en vaquillonas tratadas con PGF2 α el D0 en la expresión de celo (P=0.07; 82, 58, 56%; Grupo 1, 2 y 3 respectivamente). Cuando se analizaron solo las vaquillonas con presencia de CL al inicio del tratamiento (Grupo 1 vs 2) se observó mayor manifestación de celo en el grupo que recibió PGF2 α (P=0.04) al inicio del tratamiento (Grupo 1) comparado con el grupo sin PGF2 α el D0. Estos resultados demuestran que el uso de PGF2 α al inicio de un tratamiento de sincronización de celo a tiempo fijo mejora la manifestación de celo y consecuentemente incrementaría la tasa de preñez. 2 P á g i n a

4 INTRODUCCIÓN Existe consenso entre la comunidad científica y profesionales dedicados a la reproducción bovina que la técnica de inseminación artificial (IA) es una herramienta importante para acelerar la evolución genética de los rodeos. Obstáculos para su uso generalizado están relacionados con el manejo y la ineficiencia en la detección de celos de los animales. A partir del conocimiento detallado de la dinámica folicular (Ginther y Pierson, 1988; Savio et al., 1988; Fortune y Sirois, 1988) es posible el desarrollo de tratamientos hormonales que controlan la foliculogenesis y la fase luteal del ciclo estral como así también el momento de ovulación, lo que permite la implementación de inseminación artificial a tiempo fijo (IATF). La IATF incrementó notablemente la cantidad de animales incluidos en estos programas (Bó et al., 2005; Baruselli et al., 2003). En Argentina, estos tratamientos se basan en la utilización de distintas sales de estradiol y progestágenos (Bó et al., 1995a, Bó et al., 1995b). Existen muchos protocolos hormonales que resultan en tasas de preñeces de alrededor del 50-60% (Baruselli et al., 2004). Sin embargo, no se han desarrollado programas específicos para incrementar los porcentajes de preñez obtenidos en vaquillonas ya que esta es la categoría en la que generalmente se espera una mayor tasa de preñez comparado con vacas con cría al pie. Una de las posibles causas de que las tasas de preñeces no superen fácilmente este rango, es el hecho de que altos niveles de progesterona (P4) circulantes durante la sincronización generan una retroalimentación negativa sobre el eje hipotalámicohipofisario y por lo tanto suprimen la frecuencia y amplitud de los hormona luteinizante (LH) (Bergfeld et al., 1995; Burke et al., 1996; Callejas et al., 2006). Esto deriva en un menor crecimiento del folículo dominante (Carvalho et al., 2008) que probablemente contribuyen a falla de ovulación, ovulación retrasada, área de CL más pequeña y menor capacidad esteroidogénica por lo que afectaría negativamente las tasas de preñez. En animales jóvenes, como es el caso de vaquillonas, esta problemática se acentúa 3 P á g i n a

5 debido a una menor tasa de clivaje para eliminar progesterona tanto secretada por un CL funcional, dispositivo intravaginal o la combinación de ambos. La tasa de clivaje está positivamente relacionada a ingesta de materia seca (Sangsritavong et al., 2002). En general, estos animales se encuentran en pasturas de mediana calidad, por lo que en muchas ocasiones el consumo es limitado. En estas circunstancias, vaquillonas cíclicas seleccionadas para un programa de IATF tendrán niveles de P4 elevados como consecuencia de P4 endógena y exógena. Como resultado de este proceso se produce un crecimiento más lento del folículo dominante (Callejas et al., 2006), tasas más bajas de ovulación (Carvalho et al., 2008) y consecuentemente de concepción. Por lo tanto, el uso de dispositivos intravaginales con menores cantidades de progesterona, o mecanismos que puedan reducir los niveles circulantes de progesterona, como uso de PGF2 α al comienzo del protocolo de sincronización, podría mejorar el desarrollo folicular resultando en mayores tasas de ovulación y por ende de preñez. El uso de dispositivos con diferentes concentraciones de P4 ha sido estudiado, y contrario a lo esperado, no resultó en diferencias significativas en tasa de ovulación y preñez (Martins et al., 2014; Uslenghi et al., 2014). Sin embargo, el uso de PGF2 α al D0 (día de la inserción del dispositivo intravaginal con progesterona) en protocolos IATF reduce los niveles circulantes de progesterona, lo que lleva a un mayor crecimiento del folículo dominante y mayores tasas de ovulación comparado a un tratamiento sin PGF2 α el D0 (Carvalho et al., 2008). La hipótesis de este trabajo fue que una dosis anticipada de prostaglandina aumenta la tasa de preñez comparado con aquellos animales que no recibieron PGF2α al inicio del tratamiento. El objetivo general de este trabajo fue evaluar el efecto del uso de prostaglandina al inicio de un protocolo de sincronización de celo con IATF a base de progestágenos (0.75 g of P4) y estradiol sobre el tamaño folicular, manifestación de celo y el porcentaje de preñez en vaquillonas Bos indicus x Bos taurus. 4 P á g i n a

6 MATERIALES Y MÉTODOS Este ensayo se llevó a cabo en el establecimiento comercial Don Luis, en las cercanías de la localidad de Sebastián Elcano en el departamento Río Seco, provincia de Córdoba, Argentina. Se encuentra situado sobre la ruta provincial (RP) 21, aproximadamente a 170 km de la ciudad de Córdoba. Se utilizaron 89 vaquillonas Bos indicus x Bos taurus, con una condición corporal de 2.96 ± 0.2 (media + desvió standard) en una escala de 5 puntos donde 1 = delgada y 5 = gorda (Edmonson et al., 1989). Al momento del ensayo los animales se encontraban pastoreando Panicum maximum cultivar Gatton panic con suplementación acorde a los requerimientos nutricionales de dicha categoría. Las vaquillonas fueron seleccionadas por estatus reproductivo (presencia de un cuerpo lúteo o folículo >10 mm por medio de ultrasonografía transrectal) y desarrollo del tracto genital (palpación y ultrasonografía transrectal). Tratamientos e IATF Las vaquillonas fueron divididas en dos grupos de acuerdo a estructuras ováricas, ya sea CL o No CL al momento de iniciar el protocolo de sincronización. A su vez las vaquillonas con presencia de CL (n=70) fueron aleatoriamente subdivididas en dos grupos; uno que fue posteriormente tratado con PGF2 α al momento del inicio de la sincronización (Grupo 1) y otro que no (Grupo 2 control negativo) mientras que las vaquillonas con ausencia de CL al momento de inicio de la IATF fueron asignadas al Grupo 3 (n=19). Todos los animales (Grupo 1, 2 y 3) recibieron al D0 un dispositivo intravaginal impregnado de progesterona (Pro-Ciclar; 0,75 g de progesterona, Zoovet, Argentina) y 2 mg de BE (Benzoato de Estradiol; Zoovet, Argentina) por vía intramuscular profunda (IM). El D7, los dispositivos intravaginales fueron retirados y las vaquillonas fueron inyectadas con 150 μg de D(+) Cloprostenol (Ciclar, Zoovet, Argentina) y 1 mg de CPE (Cipionato de Estradiol; Cipiosyn, Syntex, Argentina) como inductor de ovulación, por vía IM. Los animales en el Grupo 1 fueron inyectados con media dosis de PGF2 α (75 μg de D(+) Cloprostenol; Ciclar, Zoovet, Argentina) al D0 (Figura 1). 5 P á g i n a

7 Figura 1 Tratamiento utilizados: A) Las vaquillonas del grupo1 (n=35) recibieron en el Día 0, 2 mg de benzoato de estradiol (Zoovet, Argentina) junto con la aplicación de un dispositivo intravaginal de 0,75 gr de progesterona (Zoovet, Argentina) y 75 µg de D(+) Cloprostenol (Ciclar, Zoovet, Argentina). B) Grupo 2 (n=35) y 3 (n=19) solo recibieron 2 mg de benzoato de estradiol (Zoovet, Argentina) junto con la aplicación de un dispositivo intravaginal de 0,75 gr de progesterona (Pro ciclar; Zoovet, Argentina) el D0. En el D7 se removieron los dispositivos y se administró 150 µg de D(+) Cloprostenol (Ciclar, Zoovet, Argentina) y 1 mg de cipionato de estradiol (Cipiosyn; Syntex, Argentina) por vía IM. En el D9 todas las vaquillonas fueron inseminadas a tiempo fijo (56 58 h post retiro de dispositivo intravaginal de 0,75 gr de progesterona). Las vaquillonas (Grupo 1, 2 y 3) fueron inseminadas artificialmente a tiempo fijo el D9 (56 58 h posteriores al retiro de dispositivo intravaginal) por un mismo técnico. Para la IATF se utilizó semen congelado/descongelado de dos toros que fueron aleatoriamente asignados. Se colocaron parches a nivel de la grupa como ayuda en la detección de celo al momento de retirar el dispositivo liberador de P4. Los mismos fueron leídos al momento de la inseminación. 6 P á g i n a

8 Todas la vaquillonas fueron examinadas por ultrasonografía transrectal (Honda 101 V, 5.0 Mhz) para evaluar las estructuras presentes en ambos ovarios al D0 y el D9. Las estructuras reportadas al D0 fueron CL y folículos mientras que al D9 folículos fueron clasificados por su diámetro de la siguiente manera: folículos grandes (FG; >9mm de diámetro); medianos (FM; >6 y <8 mm de diámetro) y chicos (Fch; entre >3 y <6 mm de diámetro). La manifestación de celo se evaluó por medio del grado de despintado de los parches agrupándolos de acuerdo al grado de despintado. El criterio para formar los dos grupos fue el siguiente: grupo celo (alta + medianamente despintados) y grupo No Celo (bajo + nulo). Diagnóstico de gestación El diagnóstico de preñez se determinó por medio de ultrasonografía a los 45 días post IATF (Honda 101 V, 5.0 Mhz). Análisis Estadístico Se evaluó el efecto de los tratamientos sobre tamaño folicular al momento de la inseminación (<9 vs. >9mm de diámetro), manifestación de celo, y porcentaje de preñez. Las mismas variables fueron analizadas usando contrast, status ovárico (CL vs. Folículo) al inicio del tratamiento (Grupo 1 y 2 vs. Grupo 3) y uso de PGF2 α solo en vaquillonas con presencia de CL (Grupo 1 vs. Grupo 2). Los datos fueron analizados utilizando Proc GLIMMIX de SAS. Diferencias significativas fueron reportadas cuando valores P fueron <0.05 y tendencia entre 0.05 y <0.10. Una vaquillona perteneciente al Grupo 1 fue excluida del análisis en manifestación de celo, porcentaje de preñez y tamaño folicular por razones no vinculadas al ensayo. RESULTADOS El uso de media dosis de PGF2 α al inicio del protocolo de IATF no resultó en un mayor número de animales preñados (P=0.30). No se observaron diferencias en la proporción de folículos >9mm de diámetro entre los tratamientos (P=0.12; Tabla 1). 7 P á g i n a

9 La manifestación de celo tendió a ser mayor para el Grupo 1, intermedia para el Grupo 2 y menor para el Grupo 3 (P=0.07). Las estructuras ováricas (CL vs. No CL) presente al D0 de tratamiento de sincronización no afectó (P=0.42) la tasa de preñez (42 vs. 32%) ni la manifestación de celo (P=0.19); pero afectó el tamaño folicular al momento de la IATF (P=0.04; Tabla 1). Cuando se comparó Grupo 1 vs. Grupo 2 (CL+PGF2 α vs. CL) no se observaron diferencias en número de preñeces (P=0.19) o porcentaje de folículos ovulatorios > 9 mm (P > 0.13). Contrariamente, se observó mayor número de animales en celo (P = 0.04) en Grupo 1 comparado con el Grupo 2. Figura 2 muestra porcentaje de manifestación de Celo, preñez y folículos ovulatorios por grupo. Tabla 1: Porcentajes de preñez, animales en celo y folículos mayores a 9 mm de diámetro Tratamientos Contrasts (Valor P) CL+PGF2 α CL No CL Valor P CL+ PGF2 α vs. CL CL vs. No CL Preñadas 50% (17/34) 34% (12/35) 32% (6/19) Celo 82% (28/34) 57% (20/35) 53% (1019) Fol. > 9 mm 38% (13/34) 37% (13/35) 10% (2/19) Número de animales representado entre (). CL+PGF2 α : animales pertenecientes al Grupo 1; CL: Grupo 3; No CL: Grupo 3. 8 P á g i n a

10 Figura 2: Porcentaje de A) Manifestación de Celo, B) Preñez, C) Folículos Ovulatorios por tratamiento. DISCUSIÓN Reducida tasa de preñez puede ser resultado de fallas en la ovulación debido a un tamaño reducido del folículo dominante (FD) al momento de la inducción de la ovulación (Butler et al., 2011; 2012). Altas concentraciones de progesterona circulantes durante el tratamiento causan una retroalimentación negativa sobre el eje hipotalámico-hipofisario y por lo tanto suprimen la frecuencia y magnitud de los pulsos de LH (Bergfeld et al., 1995; Burke et al., 1996; Callejas et al., 2006). Esto deriva, en un menor crecimiento del folículo dominante y menores tasas de ovulación (Carvalho et al., 2008). Varias estrategias pueden ser utilizadas para disminuir los niveles de P4 durante la sincronización de celo. El uso de PGF2 α el D0 (día de la inserción del dispositivo intravaginal de progesterona) en el protocolo IATF redujo los niveles circulantes de progesterona (5,2 vs 3,3 ng/ml), lo que llevó a un mayor crecimiento del folículo dominante (0,9 vs. 1,2 mm/día) y mayores tasas de ovulación (52,7 vs 79,4%) comparado a un tratamiento sin PGF2 α el D0 en vaquillonas Bos indicus x Bos taurus (Carvalho et al., 2008). A pesar de los resultados positivos en el desarrollo folicular, en este ensayo no se midió porcentaje de preñez. 9 P á g i n a

11 El presente estudio falló en demostrar que el uso de PGF2 α al comienzo de un protocolo de sincronización a base de progestágenos y estradiol es una alternativa viable para aumentar el número de preñeces logradas. Estos resultados deben ser interpretados con cautela debido al reducido número de animales utilizados para el tipo de variable medida. El porcentaje de preñez en vaquillonas con presencia de CL combinado con el uso de PGF2 α al comienzo de un protocolo de sincronización (Grupo 1) fue del 50% mientras que en los restantes grupos fue solamente del 34 y 32% (Grupo 1 vs 2, respectivamente). Tampoco se detectaron diferencias en el tamaño folicular al momento de la IATF (Tabla 1). Estos resultados se deben no solo al reducido número de animales utilizados para el tipo de variable medida sino que también a la forma de medición (> 9 mm vs. exacto diámetro). Los folículos adquieren capacidad ovulatoria con un diámetro de aproximadamente 9 a 10 mm, cuando expresan receptores de LH. Varios cambios fisiológicos, incluyendo aumento de las concentraciones circulantes de estradiol, son coincidentes con esta capacidad adquirida (Martínez et al, 1999; Sartori et al, 2001). La presencia de folículos grandes cerca del momento de la IATF resulta en mayor expresión de estro en vacas (Sá Filho et al., 2010). Esto se debe a una mayor concentración de estrógeno la cual está asociada positivamente al tamaño del folículo dominante (Sanches et al., 1995). A pesar de que no se encontraron diferencias en el tamaño folicular al momento de la IATF, el uso de PGF2 α al comienzo de la sincronización tendió a incrementar el número de animales que manifestaron celo observado al momento de la ITAF (82 vs. 57; Grupo 1 vs. 2, respectivamente). Resultados de sucesivos experimentos confirman (Peres et al., 2009; Vasconcelos et al., 2001) que el tamaño del folículo al momento de la IATF tiene una relación positiva con concentraciones de P4 durante el subsiguiente diestro, que a su vez se traduce en una mayor fertilidad. Concentraciones fisiológicas de P4 durante el diestro son importantes para la fertilidad (Peres et al., 2009; Vasconcelos et al., 2001; Perry et al., 2005), debido a la estimulación de las secreciones endometriales 10 P á g i n a

12 (Garret et al., 1988), el desarrollo embrionario (Garret et al., 1988; Clemente et al., 2009), y el reconocimiento materno, junto con el establecimiento y mantenimiento de la preñez (Mann et al., 1999). La madurez folicular ha sido relacionada tradicionalmente con tamaño folicular. Sin embargo, recientemente se informó que la madurez folicular asociada a la fertilidad en ganado bovino es multifactorial y no está predeterminada por una sola característica (Bridges et al., 2010). La acumulación de efectos como la duración del proestro, la producción de estradiol durante el proestro, el diámetro folicula r, la edad folicular y la producción de progesterona por el CL resultante, son algunos de los factores involucrados (Bridges et al., 2010). A pesar que durante este ensayo no se analizó ninguna hormona, creemos que la aplicación de PGF2 α el D0 disminuyó la concentración de P4, incrementando la frecuencia de pulsos de LH. Esto permitiría mayor desarrollo del folículo preovulatorio, posiblemente explicando la mayor manifestaron de celo en este grupo de animales lo que resultaría en mayor número de preñeces. El momento en que se realiza la inseminación es muy importante. En tal sentido, considerando que la ovulación se produce en promedio a las 70 h post retiro de los dispositivos (Bó et al., 2002), se determina que la IATF podría realizarse 8 a 20 h antes de la ovulación, lo que equivale a un rango horario de 50 a 62 h post retiro de los dispositivos. Comúnmente se obtienen buenos resultados de preñez inseminando a las h post retiro, utilizando el tratamiento tradicional (Fernandes et al., 2001). Se ha reportado un mayor intervalo desde la remoción de dispositivos liberadores de P4 y ovulación en vaquillonas con mayores niveles de P4 (Martins et al., 2014). Esto puede ser consecuencia de una mayor proporción de folículos inmaduros al momento del retiro del dispositivo debido a pulsatibilidad de LH suprimida por P4. Por lo tanto LH no solo es responsable del crecimiento folicular, pero también podría causar un incremento en receptores de LH en el FD (Lopez., 2005). Así, altas concentraciones de P4 podrían disminuir la frecuencia de pulsos de LH, resultando en un retrasó de la expresión de los receptores de LH en el FD y consecuentemente interrumpiendo la ovulación. 11 P á g i n a

13 A su vez, durante este ensayo se utilizó cipionato de estradiol como inductor de la ovulación. Este permite reducir el número de encierre de animales comparado con un tratamiento que utiliza BE como inductor de la ovulación. Sin embargo, hay cierta evidencia que en animales tratados con CPE al retiro del dispositivo, algunas ovulaciones se producen antes del momento de la IATF, lo que podría afectar negativamente la preñez (Colazo et al., 2004). Basado en los resultados reportados por Martins (2014) y Colazo (2004) se hipotetizo que la alta frecuencia de folículos no ovulatorios al momento de la IATF se pudo haber debido a un adelantamiento del momento de la ovulación. Al momento de la IATF se observó un 68% de folículos menores a 9 mm de diámetro (folículos chicos (25%) y medianos (43%)). De acuerdo a la información disponible y resultados observados, se decidió realizar una nueva IATF usando 53 vaquillonas cíclicas. Para esta sincronización no se tuvo en cuenta el estatus ovárico al comienzo del protocolo, pero si se midió el tamaño folicular al momento de la IATF. Se utilizó un solo protocolo (PGF2 α al momento del inicio del tratamiento), por lo que no se ha evaluado estadísticamente. El tiempo desde el retiro del dispositivo a la IATF se redujo a 48 h. La Tabla 2 compara los resultados de preñez y tamaño folicular entre diferentes momentos de inseminación (56-58 vs. 48 h). Tabla 2: Porcentaje de folículos por tamaño y preñeces a diferentes momentos de IATF Momento de Inseminación h 48 h Chico 26% 7% Mediano 43% 21% Grande 31% 72% Preñadas 40% 60% Vacías 60% 40% Folículos grandes (>9mm de diámetro); medianos (>6 y <8 mm de diámetro) y folículos chicos (entre >3 y <6 mm de diámetro). n=87 para ensayo 1 (56-58 h); n=53 para ensayo 2 (48 h) 12 P á g i n a

14 Como puede observarse en la Tabla 2, los porcentaje de preñez (40 vs 60%) y de folículos > 9 mm (31 vs. 72%) incrementaron cuando se anticipó la IATF a 48 h pos-retiro del dispositivo. Estos resultados coinciden con los reportados por Martins (2014) quien concluyó que la proporción de vaquillonas con folículos pequeños (<10.7 mm) es la principal limitante para la obtención de altas tasas de preñez en programas de IATF. Por lo tanto, el uso de PGF2 α al comienzo del protocolo de vaquillonas podría mejorar la tasa de preñez. Esto, combinado con el uso de ECP e inseminación a las 48 h post retiro del dispositivo de progesterona podría contribuir a obtener mejores resultados reproductivos con menores encierres lo que facilitaría la aplicación de estas tecnologías. CONCLUSIÓN La utilización de PGF2 α demostró ser eficiente para aumentar el número de animales que manifestaron celo y por ende mejorar la tasa de preñez en programas de IATF para vaquillonas Bos indicus x Bos taurus. En el futuro deberían realizarse más estudios para determinar tasas de preñez utilizando un mayor número de animales y analizar el momento de IATF cuando se utiliza cipionato de estradiol como inductor de la ovulación. 13 P á g i n a

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