INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS EVALUACIÓN IN VITRO DEL QUITOSANO E ISOTIOCIANATOS EN EL DESARROLLO Y MORFOLOGÍA DE Fusarium oxysporum SHELECHT f. sp. gladioli (MASSEY) SNYDER & HANSEN TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS EN MANEJO AGROECOLÓGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES PRESENTA BIOL. PAOLA ROSSY GARCÍA SOSA YAUTEPEC, MORELOS, ENERO DE 2010

2 El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Fitopatología del departamento de Interacciones Planta-Insecto del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la Dra. Silvia Bautista Baños. Para la realización de los estudios se contó con el apoyo económico de la beca CONACYT (215856), beca del programa institucional de investigadores (PIFI) y beca por parte del programa de becas institucionales. La investigación fue realizada con el financiamiento económico del proyecto de la Secretaria de Investigación y Posgrado SIP ( ).

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6 AGRADECIMIENTOS Al Instituto Politécnico Nacional y al Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi), por haberme aceptado en su programa de maestría y por todo el apoyo y las facilidades que me brindaron durante mi estancia. Al grupo de Fitopatología-Postcosecha del Departamento de Interacción Planta-Insecto del CeProBi por aceptarme como parte del mismo, especialmente a la Dra. Silvia Bautista Baños, por la amistad, el gran apoyo académico y personal que me brindo durante mis estudios. A los profesores del programa de MAPE del CeProBi.

7 DEDICATORIAS Con infinito amor a mi mamá Carmen Sosa Huerta, excelente amiga en las buenas y en las malas. Un honor haber crecido en tu regazo. Te amo. A Jesús J. Vidal García, por la enseñanza y amor que genero en nuestros corazones. A mi hija Paula Yolcelick Pérez García, mi gran regalo esperado. A mi padre Ventura García y a mis hermanos, mis apoyos incondicionales. A mi compañero, esposo y amor Cuauhtémoc Pérez V., por ser mi poste en todo momento.

8 CONTENIDO Páginas ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE CUADROS RESUMEN ABSTRACT i iv vi viii 1. INTRODUCCIÓN 1 2. ANTECEDENTES Generalidades de la gladiola Importancia económica Enfermedades fungosas Control de F. oxysporum f. sp. gladioli en cormos Control químico Alternativas no químicas en el control de hongos Hidrotermia Quitosano Isotiocianatos JUSTIFICACIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS Resumen experimental 19

9 5.2 Obtención del microorganismo Efecto del quitosano en el desarrollo in vitro de F. oxysporum f.sp. gladioli Preparación del quitosano Aplicación de los tratamientos Variables evaluadas Crecimiento micelial Germinación de conidios en medio líquido Efecto de los isotiocianatos de bencilo, 2-feniletilo y fenilo en el desarrollo in vitro de F. oxysporum f. sp. gladioli Isotiocianatos Aplicación de los isotiocianatos Variables evaluadas Crecimiento micelial Germinación de conidios en discos de PDA Efecto de la combinación quitosano e isotiocianatos Efecto del quitosano e isotiocianatos en la integridad de la membrana de F. oxysporum f. sp. gladioli Colorante Preparación de colorante Evaluación de la integridad de la membrana

10 5.7 Efecto del quitosano e isotiocianato de fenilo en la morfología de las 28 hifas y conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli Estudios de microscopia electrónica de barrido (MEB) Análisis estadístico RESULTADOS Fusarium oxysporum Shlecht Efecto del quitosano en el desarrollo in vitro de F. oxysporum f. sp. 31 gladioli Crecimiento micelial Germinación de conidios Efecto de los isotiocianatos de bencilo, 2-feniletilo y fenilo en el desarrollo in vitro de F. oxysporum f. sp. gladioli Isotiocianato de bencilo Crecimiento micelial Isotiocianato 2-feniletilo Crecimiento micelial Isotiocianato de fenilo Crecimiento micelial Germinación de conidios 6.4 Efecto de la combinación quitosano e isotiocianatos Crecimiento micelial Quitosano e isotiocianato de bencilo

11 Quitosano e isotiocianato 2-feniletilo Quitosano e isotiocianato de fenilo 6.5 Efecto del quitosano e isotiocianatos en la integridad de los conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli 6.6 Efecto del quitosano e isotiocianato de fenilo en la morfología de las hifas y conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli Estudio de microscopia electrónica de barrido (MEB) DISCUSIÓN CONCLUSIONES PERSPECTIVAS LITERATURA CITADA 74

12 ÍNDICE DE FIGURAS Páginas Figura 1. Sintomatología de cormos infectados con F. oxysporum f. sp. gladioli 6 Figura 2. Estructura química del quitosano 9 Figura 3. Diagrama experimental 19 Figura 4. Crecimiento de Fusarium oxysporum f. sp. gladioli en cámaras húmedas 20 Figura 5. Tratamientos con quitosano y el control 22 Figura 6. Medición del crecimiento micelial 23 Figura 7. Incubación de conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli para evaluar 24 la germinación con quitosano Figura 8. Preparación de los tratamientos con isotiocianatos 25 Figura 9. Incubación de conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli para evaluar la germinación con los isotiocianatos 26 Figura 10. Estructuras reproductoras de F. oxysporum 3o Figura 11. Cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli en presencia de diferentes concentraciones de quitosano 32 Figura 12. Crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli en medio PDA incubado en diferentes concentraciones de quitosano 32 Figura 13. Cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli incubado en diferentes concentraciones del isotiocianato de bencilo 37 i

13 Figura 14. Cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli 40 en presencia de diferentes concentraciones del isotiocianato 2-feniletilo Figura 15. Cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli en presencia de diferentes concentraciones del isotiocianato de fenilo 44 Figura 16. Crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli en medio PDA en presencia de diferentes isotiocianatos de: bencilo (I);2-feniletilo (II); fenilo (III) 48 Figura 17. Cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli en presencia de concentraciones de quitosano y del isotiocianato de bencilo 50 Figura 18. Crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli en medio PDA en presencia de concentraciones de quitosano-bencilo al término del periodo de incubación 51 Figura 19. Cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli en presencia de diferentes concentraciones de quitosano y del isotiocianato de 2-feniletilo 52 Figura 20. Crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli en medio PDA con diferentes concentraciones de quitosano isotiocianato de 2-feniletilo al término del periodo de incubación 53 Figura. 21. Cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli en presencia dediferentes concentraciones de quitosano y del isotiocianato de fenilo 56 ii

14 Figura 22. Crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli en medio PDA con diferentes concentraciones de quitosano-fenilo al término del periodo de 57 incubación Figura 23. Viabilidad de conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli 60 Figura 24. Microfotografía de hifas de F. oxysporum f. sp. gladioli, incubado en PDA 61 Figura 25. Microfotografía de hifas de F. oxysporum f. sp. gladioli, incubadas con quitosano 62 Figura 26. Microfotografía de hifas de F. oxysporum f. sp. gladioli tratadas con el isotiocianato de fenilo 63 Figura 27. Microfotografía de conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli tratadas con quitosano e isotiocianato de fenilo 64 iii

15 ÍNDICE DE CUADROS Páginas CUADRO 1. Efecto del quitosano en el crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli durante 11 días de incubación 34 CUADRO 2. Tasa de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli inoculado con quitosano 35 CUADRO 3. Efecto del isotiocianatos de bencilo en el crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli durante 12 días de incubación 38 CUADRO 4. Tasa de crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli inoculado con el isotiocianato de bencilo 39 CUADRO 5. Efecto del isotiocianato 2-feniletilo en el crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli durante 12 días de incubación 42 CUADRO 6. Tasa de crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli inoculado en el isotiocianato de 2-feniletilo 43 CUADRO 7. Efecto del isotiocianatos de fenilo en el crecimiento micelial de F. oxyspoum f. sp. gladioli durante 12 días de incubación 46 CUADRO 8. Tasa de crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli inoculado con el isotiocianato de fenilo 47 CUADRO 9. Efecto de la combinación quitosano 2-feniletilo en el crecimiento micelial de F. oxyspoum f. sp. gladioli al término del periodo de incubación 54 CUADRO 10. Tasa de crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli inoculado en la combinación quitosano-2-feniletilo 55 iv

16 CUADRO 11. Efecto de la combinación quitosano-fenilo en el crecimiento micelial de F. oxyspoum f. sp. gladioli al término del periodo de incubación 58 CUADRO 12. Tasa de crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli inoculado en la combinación quitosano-fenilo 59 v

17 RESUMEN Una de la enfermedades más importantes del gladiolo es la pudrición del cormo, ocasionada por Fusarium oxysporum f. sp. gladioli. Una práctica común para controlar esta enfermedad es la desinfección por fungicidas químicos. Sin embargo, se continúa en la búsqueda de otras alternativas de manejo como es el uso del quitosano e isotiocianatos. El quitosano es un compuesto biodegradable y no tóxico. Los isotiocianatos son substancias producidas por plantas pertenecientes a la familia Brassicaceae. Ambos compuestos han surgido como una alternativa de control ya que son fácilmente biodegradables y se ha comprobado su potencial en el control del crecimiento y desarrollo de hongos fitopatógenos. El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto antifúngico del quitosano e isotiocianatos sobre el desarrollo y morfología de F. oxysporum f. sp. gladioli. Para ello se evaluó el efecto del quitosano en concentraciones de 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mg ml -1 y de los isotiocianatos de bencilo, fenilo y 2-feniletilo a 0.01, 0.025, 0.05 y 0.1 mg ml -1, sobre el crecimiento micelial y germinación de F. oxysporum f. sp. gladioli. Además, también se evaluó el efecto de la combinación quitosano e isotiocianatos sobre éstas dos variables por lo que se procedió a realizar estudios de integridad de membrana mediante la aplicación del colorante fluorecente Ioduro de propidio, y finalmente, se realizaron observaciones en el microscopio electrónico de barrido (MEB) sobre el efecto del quitosano e isotiocianato de fenilo en la morfología del hongo. El tratamiento con quitosano a 2.0 mg ml -1 inhibió el crecimiento en un 82.3 % e inició su crecimiento al quinto día de incubación. Sólo el tratamiento con el isotiocianato de fenilo a 0.5 y 1.0 mg ml -1 inhibieron el crecimiento micelial en 51.6 y 65.5%, respectivamente. El crecimiento micelial inició al tercer y quinto día. Todos los tratamientos de quitosano e isotiocianatos fueron efectivos en inhibir la germinación de conidios. Todas vi

18 las combinaciones quitosano-isotiocianatos inhibieron el crecimiento micelial. Con la técnica del ioduro de propidio no se observó apropiadamente la fluorescencia de los conidios. Con la MEB no se observaron conidios, conidióforos y clamidosporas del hongo tratado con quitosano a 1.5 mg ml -1, además hubo enrollamiento e hinchazón en las puntas terminales de las hifas. Con el isotiocianato de fenilo a 0.1 mg ml -1, se observó un adelgazamiento en la hifa y nula formación de estructuras características del hongo. Asimismo, se observó deshidratación de los conidios tratados con quitosano y el Isotiocianato de fenilo. vii

19 ABSTRACT One of the main important diseases of gladioli is that originated by Fusarium oxysporum f. sp. gladioli. A common practice to control the corms rots is by disinfection through chemical fungicides. Nevertheless, the search of other handling alternatives such as the use of chitosan and isothiocyanates continues. The chitosan is a biodegradable and non toxic compound. The isothiocyanates are substances produced by plants that belong to the Brassicaeae family. Both compounds have surged as an alternative because they are easily biodegradable and their potential to control the growth and development of phytopathogenic microorganisms have been tested. The objective o this investigation was to evaluate the fungicidal effect of these compounds; chitosan and isothiocyanates over the development and morphology of F. oxysporum f. sp. gladioli. The effect of the chitosan at the concentrations of 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 mg ml -1 and the isothiocyanates of benzyl, phenyl and 2-phenylethyl at concentrations of 0.01, 0.025, 0.05 and 0.1 mg ml -1 was evaluated on mycelial growth and germination. In addition, the combination of these two compounds was also tested on these two variables. Further studies of membrane integrity by the application of the fluorescent colorant propidium of iodide and observations in the scanning electronic microscopy (SMB) were carried out. The treatment of chitosan at 2.0 mg ml -1 inhibited the growth of F. oxysporum f. sp gladioli about 83.3%, starting to growth by the fifth day of incubation. Only the treatment with phenyl isothiocyanate at the concentrations of 0.5 and 1.0 mg ml -1 inhibited the mycelial growth in 51.6 and 65.5 %, respectively. The mycelial growth initiated by the third and fifth day. All treatments with chitosan and isothiocyanates were effective to inhibit the conidial germination. All the combinations chitosanisothiocyanates inhibited the mycelial growth. The technique of propidium of iodide, did not viii

20 allowed the properly observation of the membrane fluorescence of the conidia. It was observed through the SEM, the absence of conidia, conidiophores, and clamidiospores of the treated fungi by chitosan at 1.5 mg ml -1 and the zero formation of the typical structures of the fungi. Similarly, it was observed the dehydration of the conidia treated with chitosan and the phenyl isothiocyanate. ix

21 1. INTRODUCCIÓN El gladiolo (Gladiolus spp.) se encuentra ubicado entre las diez especies más importantes como flor de corte a nivel mundial (De Hertogh y Lee, 1993). Las plagas, maleza y enfermedades son factores que afectan a cormos y flores, tanto en condiciones de campo como en el almacén (Palacios, 1992). Una de la enfermedades más importantes en el estado de Morelos es la ocasionada por Fusarium oxysporum f. sp. gladioli, el daño que provoca se le conoce como pudrición café, o fusariosis y causa pérdidas del 40-60% durante el almacenamiento, en el que el hongo puede sobrevivir en los cormos o el suelo por muchos años. Fusarium oxysporum es un hongo cosmopolita, coloniza partes aéreas y subterráneas de la planta. Los fungicidas comerciales que se usan con mayor frecuencia contra F. oxysporum f. sp. gladioli son: Benlate, Captan y Tiabendazol. El uso excesivo de éstos químicos ha provocado la generación de resistencia y daños a la salud humana por lo que se continúa en la búsqueda de otras alternativas de control como es la aplicación de compuestos naturales tales como el quitosano e isotiocianatos. El quitosano es un compuesto biodegradable y no tóxico. Sus cargas positivas le confieren numerosas propiedades fisiológicas y biológicas, con un gran potencial y amplio intervalo de uso en la industria farmacológica, médica y agrícola (Bautista-Baños et al., 2006; Rinaudo, 2006). Este compuesto, posee propiedades antifúngicas relacionadas con la inhibición del crecimiento micelial, esporulación y germinación. Por otro lado, los isotiocianatos son sustancias producidas por plantas pertenecientes a la familia Brassicaceae. Se han llevado a cabo algunos experimentos para evaluar su 1

22 potencial fungicida en el control del crecimiento y desarrollo de hongos fitopatógenos (Fahey et al., 2001). En este trabajo de investigación, en el primer capítulo se revisó la producción del gladiolo a nivel nacional, la importancia del hongo F. oxysporum f. sp. gladioli y su sintomatología en los cormos de gladiolo, el control tradicional de este hongo y las alternativas reportadas al uso de agentes químicos. En el capítulo de materiales y métodos se detalló la metodología, equipos y materiales que se usaron para evaluar el quitosano y los isotiocianatos sobre el hongo F. oxysporum todo ello para su posible replicación y cumplir los objetivos planteados. Los resultados del efecto de estos dos compuestos naturales sobre el desarrollo y morfología de F. oxysporum se describen en diferentes figuras y cuadros en el siguiente capítulo. La discusión resalta los resultados más significativos y se da una posible explicación de estos basándose en previas evidencias científicas. Finalmente, se concluyó lo más relevante del trabajo. 2

23 2. ANTECEDENTES 2.1 Generalidades del gladiolo El nombre de Gladiolus es diminutivo de gladius, que significa espada y refiere a la forma de la hoja lanceolada (termina en punta), siendo la flor el símbolo de la victoria en épocas romanas (Larson, 1992). El gladiolo (Gladiolus spp.) es una especie originaria de latitudes africanas y euroasiáticas. Comprende 180 especies nativas de África, Arabia, Europa, Madagascar y Oeste de Asia, aunque pocas son de interés para la horticultura ornamental; algunas sólo se han utilizado en trabajos de hibridación. Es una planta herbácea perteneciente a la familia Iridaceae y se desarrolla a partir de botones axilares de un tallo modificado subterráneo llamado cormo que funciona como una estructura sólida de reserva y se encuentra cubierto por hojas escamosas (catáfilos), con un axis interior de crecimiento. Actualmente se cultivan diferentes variedades, dominando las de color rojo ( Valeria, Victoria, Sans, Peterpears ) y blanco ( Borrega, China, Limón, etc), ofreciendo una diversidad de colores, formas y tamaños. Se utiliza como planta de paisaje en el jardín y como flor para corte (Palacios, 1992). 2.2 Importancia económica El gladiolo se encuentra ubicado entre las diez especies más importantes como flor de corte a nivel mundial (De Hertogh y Lee, 1993). En México los estados de mayor producción del país son: Puebla (Atlixco, San Martin Texmelucan), México (Villa Guerrero, Chalma, Malinalco y Valle de Bravo), Morelos (Yautepec, Cuautla y Tepoztlán), Michoacán y 3

24 Veracruz. (Leszczyñska y Borys, 1994). Esta ornamental a nivel nacional ocupa el tercer lugar en producción y se cultiva una superficie de ha, que corresponde a una producción de t. En el estado de Morelos la superficie cultivada es de ha, y contribuye con una producción de t (SAGARPA, 2007). 2.3 Enfermedades fungosas Las plagas, maleza y enfermedades, son factores que afectan a cormos y flores tanto en condiciones de campo como en el almacén (Palacios, 1992). Los principales organismos de tipo fungoso que las afectan son: Fusarium oxysporum f.sp. gladioli, Penicillium gladioli, Botrytis gladiolorum, Curvularia trifolli f. sp. gladioli, Stromatinia gladiolo y Uromyces transversalis. Dentro de éstas, la ocasionada por F. oxysporum f. sp. gladioli es de las más importantes, el daño que provoca se le conoce como pudrición café, o fusariosis y ocasiona daños del 40-60% durante el almacenamiento. El hongo puede sobrevivir en los cormos o el suelo por muchos años (CESVMOR, 2006). Fusarium oxysporum Shlecht Fusarium oxysporum es un Deuteromyceto de la clase de los Hyphomycetos. Es un hongo cosmopolita, coloniza partes aéreas y subterráneas de la planta y ha sido reportado como el hongo de mayor importancia económica. En medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) presenta un crecimiento rápido y produce abundante micelio algodonoso con tonalidades de blanco, rosado o púrpura. Produce abundantes microconidios hialinos que emergen del micelio aéreo o en microconidióforos (monofialides), generalmente 4

25 unicelulares de forma elipsoidal-ovalada. Asimismo, presenta macroconidios multiseptados (3-7) con pared celular delgada, alargados en forma de media luna producidos en esporodoquios, micelio aéreo y macroconidioforos (monofialides). No se conoce el estado sexual de esta especie por lo que es también llamado hongo imperfecto. Las clamidosporas son estructuras de resistencia, de forma esférica, con paredes lisas o rugosas y se forman individualmente, en pares o cadenas, por lo regular se encuentran en el micelio aéreo. (Nelson et al., 1983; Booth, 1971; Leslie y Summerell, 2006). Fusarium oxysporum Shlecht f. sp. gladioli (Massey) Snyder & Hansen En 1912, en Estados Unidos se observaron síntomas de la pudrición de gladiolo causada por Fusarium sin embargo, Masey en 1926 reportó a F. oxysporum f. sp. gladioli como agente causal del daño al cultivo convirtiéndose en una de las enfermedades más importantes de los cormos de esta especie ornamental, las lesiones en los cormos al momento de la cosecha son pequeñas pudriciones húmedas, irregulares, circulares y alargadas, generalmente sobre los lados de la parte media basal. Estas en un principio rojizas y pequeñas, tornándose café-negruzcas cuando dañan al cormo completamente. El daño más característico de esta enfermedad es la presencia de cordoncillos concéntricos en las lesiones las cuales son hundidas debido al rápido secado y contracción de los tejidos (Figura 1). En México, al daño causado por F. oxysporum f. sp. gladioli se le conoce como pudrición café, marchitez o fusariosis del gladiolo, siendo una de las enfermedades más destructivas en este cultivo. No obstante, F. oxysporum f sp. gladioli no sólo afecta el cultivo de gladiolo, sino también a especies de la familia Iridaceae, como son: Babiana sp., Crocus sp., Freesia sp., Iris sp. Ixia sp., Sparaxis sp. Streptanthera sp., Tritonia sp. y Watsonia sp. (Booth, 1971). 5

26 Figura 1. Sintomatología de cormos infectados con F. oxysporum f. sp. gladioli (Heimann & Worf, 1997) 2.4 Control de F. oxysporum f. sp. gladioli en cormos Control químico Magie, (1975) observó que al sumergir cormos de gladiolo en benomilo durante 15 min en un periodo de 30 meses, F. oxysporum toleró alrededor de 20 veces más éstas inmersiones en comparación con los aislados de F. oxysporum que no habían sido tratados con este fungicida, por lo que concluyeron que el patógeno desarrolló tolerancia a benomilo por el uso frecuente. Ram et al. (2004), reportaron el uso de soluciones de fungicidas con benomilo y Captan en el control de F. oxisporum f. sp. gladioli aunque se uso por separado no dieron resultados satisfactorios debido a las cantidades inadecuadas para matar al patógeno. Estos autores incrementaron la eficacia de los fungicidas modificando el ph de la solución usando 6

27 ác. acético y ác. ascórbico en la que se observó una incidencia de 9.3 % de la enfermedad en los cormos tratados, en comparación con los no tratados (23%). En el Estado de Morelos los fungicidas reportados que mayormente se usan contra F. oxysporum son: (CESVMOR, 2006) a) Benlate Metil-1-(butilcarbamoil)-2-bencimidazol-carbamato; principio activo: benomilo. b) Captan 1, 2, 3, 6-tetrahydro-N (trichloromethylthio)phthalimide); principio activo: ftalimida. c) Mertect 500 SC, 2-(tiazol-4-il) benzimidazol; principio activo: tiabendazol. Se ha comprobado que el uso de estos fungicidas químicos daña al ambiente debido a su alta persistencia en el (403 días aproximadamente) ya que afectan a la salud humana (afectación del sistema nervioso central, hepatotóxicos y efectos tóxicos en la reproducción humana). Debido a esto se ha incrementado la búsqueda de métodos alternativos que contrarresten los efectos negativos del uso de fungicidas sintéticos Alternativas no químicas en el control de hongos Hidrotérmia Una de las alternativas evaluadas, es la aplicación de los tratamientos hidrotérmicos que inhiben directamente el crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli, activando la resistencia natural del hospedero. Estos tratamientos consistieron en sumergir los cormos 7

28 en agua caliente a temperaturas que oscilaron entre C durante intervalos de tiempo de 15, 30, 60 ó 90 min. Sin embargo, los cormos al ser sometidos a altas temperaturas con tiempos prolongados ocasionaron la no germinación y/o la muerte del cormo. Villanueva y García (1987), observaron que al aplicar este método a cormelos de la variedad White Friendship a 80 C durante 30 s provocó su muerte. Por otra parte, Sharma y Tripathi (2008), reportaron un incremento en la muerte de los cormos cuando se aplicaron tratamientos a temperaturas de 55 C durante 60 y 90 min y también a 60 y 65 C en varios tiempos de exposición Quitosano El quitosano es un compuesto biodegradable y no tóxico. Es un polímero policatiónico que contiene más de 5000 unidades de glucosamina, es un compuesto derivado de la quitina en forma parcialmente desacetilada 2-amino2-deoxy-β-D-glucosa (Pastor de Abram 2004) (Figura 2). Sus cargas positivas le confieren numerosas propiedades fisiológicas y biológicas, con un gran potencial y amplio intervalo de uso en la industria farmacológica, médica y agrícola (Liu et al., 2004, Bautista-Baños et al., 2006; Rinaudo, 2006 y Lárez-Velásquez, 2008). Este compuesto posee propiedades antifúngicas, ya que en previos estudios in vitro se observó que inhibió el crecimiento micelial, esporulación y germinación de varios hongos. Otros estudios, también reportaron que el quitosano no sólo afectó el crecimiento y desarrollo del patógeno, sino que también indujo cambios morfológicos, alteraciones estructurales y desorganización molecular de las células de algunos hongos fitopatógenos (El Ghaouth et al., 1997; Ait Barka et al., 2004). La interacción de quitosanomembrana genera afectaciones en la integridad de membrana e inclusive se ha observado 8

29 en bicapas de lípidos y provoca la formación transitoria de agujeros por donde podrían liberarse proteínas (Hong et al., 2006; Guerra-Sánchez et al., 2009). Figura 2. Estructura química del quitosano (Lárez-Velásquez, 2003). Efecto del quitosano en estudios in vitro En estudios in vitro se reportó que el quitosano inhibió varias especies de hongos. Se observó que a concentraciones elevadas (6.0 mg ml -1 ) se inhibió la germinación y elongación del tubo germinal de Rhizopus stolonifer (Ehrenberg: Fries) y Botrytis cinerea (Pers.:Fr.) en un 75 y 90%, respectivamente (El Ghaouth et al., 1992a). Bautista-Baños et al. (2003), demostraron el efecto fungicida del quitosano sobre Colletotrichum gloeosporioides (Penz. & Sacc) y se reportó que el crecimiento micelial se inhibió completamente a las concentraciones de 2.5% y 3.0% durante un periodo de incubación de siete días. 9

30 Ben-Shalom et al. (2003), evaluaron el efecto del quitosano y oligomeros de quitina sobre la germinación de conidios de B. cinerea y se observó que el quitosano a bajas concentraciones de μg ml -1 inhibió parcialmente la germinación de los conidios, mientras que, a 50 μg ml -1 hubo una completa inhibición. Elquitosano redujo la elongación del tubo germinativo después de 24 h de incubación en 10 μg ml -1 de quitosano, sólo se alcanzó 2 μm de crecimiento. Los oligomeros de quitina no afectaron la germinación de esporas ni la elongación del tubo germinal. Plascencia-Jatomea et al. (2003), demostraron el efecto fungistático del quitosano sobre Aspergillus niger (Tieghem), después de 24 h incubación en medio con 3 y 5 g l -1 de quitosano. Los autores reportaron una fuerte inhibición del crecimiento radial hasta de 73%. Sin embargo, el efecto fungistático del quitosano disminuyó gradualmente con el tiempo de incubación. Después de 96 h de inoculación el máximo porcentaje de inhibición de crecimiento miceial fue aproximadamente de 50%. Por otra parte, Bautista-Baños et al. (2004), demostraron el efecto inhibitorio del quitosano sobre el crecimiento micelial, esporulación y morfología de tres hongos postcosecha: Penicillium digitatum (Sacc.), F. oxysporum y R. stolonifer aislados de frutos de papaya. Los autores reportaron que a concentraciones mayores de 0.5%, el crecimiento micelial de F. oxysporum disminuyó hasta lograr su total inhibición. Estos autores, demostraron que el quitosano a 1.5 % redujo en más del 50% el desarrollo de estos hongos. Asimismo, se reportó que existe una alta correlación entre la concentración de quitosano aplicada y la inhibición fúngica, además del peso molecular del compuesto. De 10

31 acuerdo a Chien y Chou (2006), la acción fungicida del quitosano dependió del peso molecular (92.1 kda y kda; con 94.2% de acetilación) y concentración para causar una inhibición en el crecimiento micelial de Penicillium digitatum y P. italicum hasta del 90% después de cinco días de ser cultivados. Liu et al. (2007), reportaron que el quitosano a concentraciones de %, inhibió mejor la germinación de conidios de P. expansum que la de los conidios de B. cinérea. Sin embargo, la elongación del tubo germinal de ambos patógenos se inhibió significativamente a una concentración de 0.01%. En este mismo estudio, se observó que el crecimiento micelial de B. cinerea fue más sensible al quitosano (100% inhibición) a la concentración de 0.5% comparado con el crecimiento de la colonia de Penicillium expansum. Hernández-Lauzardo et al. (2007), reportaron que el quitosano a la concentración de 2.0 mg ml -1 inhibió en un 67% el crecimiento micelial de R. stolonifer, mientras que, en el caso de Mucor spp. el menor crecimiento micelial se obtuvo con la concentración de 2.0 mg ml -1 con una inhibición del 52%. Respecto a la germinación de esporas de R. stolonifer, el quitosano inhibió la germinación a partir de la concentración de 1.0 mg ml -1, donde el menor porcentaje de germinación fue con la concentración de 2.0 mg ml -1 (54.5%). Un patrón muy similar siguió Mucor spp con la misma concentración la cual inhibió la germinación de esporas en un 31.5 %. Xu et al. (2007), evaluaron el efecto de oligoquitosano sobre el crecimiento micelial de nueve hongos fitopatógenos (Alternaria solani, B. cinerea, Colletotrichum orbiculare, Exserohilum turcicum, Fusarium graminearum, F. oxysporum, Phytophthora capsici, 11

32 Verticillium dahliae y Pyricularia oryzae). Los autores observaron que P. capsici fue el más sensible al oligoquitosano con una concentración inhibitoria de 50% del crecimiento con 100 μg ml -1. Efecto del quitosano en la morfología de hongos El Ghaouth et al. (1992b), reportaron que 3 mg ml -1 de quitosano con 7.2% de desacetilación provocó cambios morfológicos en R. stolonifer. Estos cambios fueron: una profunda erosión en la pared celular y una reducción del tamaño de la hifa junto con un crecimiento anormal. Ait-Barka et al. (2004), demostraron que el quitosano ( quitogel ) no sólo fue efectivo al restringir el crecimiento radial de Botrytis cinerea en un 64% cuando se cultivó en medio nutritivo con quitosano al 1.75% sino también, demostró la inducción de cambios morfológicos y severas alteraciones estructurales en las células de este hongo como coagulación del citoplasma caracterizado por la presencia de pequeñas vesículas y desorganización celular. Otros autores demostraron que el quitosano afectó la integridad de la membrana plasmática de los conidios de P. expansum y B. cinérea, al incrementar el tiempo de incubación en medio caldo papa dextrosa adicionado con 0.5% de quitosano. En este estudio, se demostró que la viabilidad de P. expansum fue menor en presencia de quitosano que la de B. cinerea. El porcentaje de viabilidad de P. expansum fue de 48.2% en 12

33 comparación con 82.5% que presentó B. cinerea después de 2 h de incubación con quitosano a concentraciones de 0.5% (Liu et al., 2007). Por otro lado, se demostraron cambios en la ornamentación de esporas mediante el uso de microscopia electrónica de barrido (MEB) y en donde se observó que las crestas de Rhizopus stolonifer fueron numerosas y profundas en los tres tipos de quitosano probados (bajo, medio y alto peso molecular) y en diferentes concentraciones usadas (1.0, 1.5 y 2.0 mg ml -1 ) en comparación con las esporas no tratadas con quitosano (Hernández-Lauzardo et al., 2008) Isotiocianatos Los isotiocianatos son sustancias producidas por varias plantas pertenecientes a la familia Brassicaceae, Capparaceae y Caricaceae como un sistema de defensa en contra del ataque por patógenos. Son producto de la hidrólisis de los glucosinolatos por la enzima mirosinasa en presencia de agua para la obtención de nitrilos, tiocianatos y varias formas de isotiocianatos volátiles. Químicamente un isotiocianato (R-N=C=S) es formado por la sustitución del sulfuro por un oxigeno en el grupo isotiocianato (Wittstock y Halkier, 2002). Estos compuestos han surgido como una alternativa de control ya que son fácilmente biodegradables y no generan resistencia en microorganismos. Además, se han llevado a cabo algunos experimentos para evaluar su potencial en el control de crecimiento y desarrollo de hongos fitopatógenos (Fahey et al., 2001). 13

34 Efecto de los isotiocianatos en estudios in vitro En estudios realizados por Smolinska y Horbowicz (1999), se evaluó el efecto del tejido de Sinapis alba cv. Borowska, Sinapis alba cv. Nakielska y Brassica juncea (mostaza parda) sobre la germinación de clamidosporas de F. oxysporum f. sp. radicis lycopersici donde se obtuvo un 100% de inhibición. En este mismo estudio, se asoció el efecto fúngicida a la presencia de diferentes concentraciones de los isotiocianatos 2-propenilo, bencilo y feniletilo en los tejidos de estas plantas probadas. Smith y Kirkegaard (2002), evaluaron el efecto del isotiocianatos de 2-feniletilo en el crecimiento de 75 cepas de diferentes microorganismos de suelo. Estos autores encontraron que el hongo Trichoderma spp fue el más sensible ya que se inhibió hasta un 90% con la concentración de 4.89 mm. Por otro lado, Smolinska et al. (2003), evaluaron el efecto de cinco isotiocianatos (propenilo, etilo, butilo, feniletilo y bencilo) a la concentración de 0.3 μl sobre F. oxysporum proveniente de diferentes cepas de suelo (9051C, 9312F, 9321A Y 9243G). Estos autores reportaron efectos fungistáticos en el crecimiento micelial. En la cepa 9321A tratada con los isotiocianatos de fenilo y butilo se observó un 90 % y 63 % de germinación respectivamente; mientras que en la cepa 9312F sólo el 38 % de los conidios de F. oxysporum germinaron con el isotiocianato de butilo. En otros bioensayos, se reportó el efecto del isotiocianato de 2-propenilo mezclado con medio PDA sobre el crecimiento micelial de Rhizoctonia solani. Los resultados mostraron 14

35 que a las concentraciones de 50, 75, 150 y 200 μl no se registró ningun crecimiento del hongo (Dhingra et al., 2004). Troncoso-Rojas et al. (2005a), evaluaron el uso potencial de extractos de hojas de Brassica olaraceae var. capitata (col) como posible control de Alternaria alternata. Mediante la hidrólisis de los glucosinolatos obtuvieron los isotiocianatos de alilo, bencilo fenilo y 2- feniletilo, los cuales aplicaron en A. alternata. Además, probaron un tratamiento mezclando compuestos comerciales (Sigma Chemical Co., St. Louis y Alfa Aesar, Johnson Matthey Co) basados en los isotiocianatos anteriormente encontrados. Los autores concluyeron que el crecimiento micelial A. alternata fue más sensible a la mezcla que a la aplicación de los compuestos solos. Se observó una inhibición del 100% de este hongo en el crecimiento micelial con la concentración de 0.03 mg ml -1. En otros estudios llevados a cabo por Troncoso-Rojas et al. (2005b), el hongo A. alternata aislado de frutos de jitomate e inoculado con diferentes concentraciones del isotiocianato de bencilo (0.025, 0.05, 0.1, 0.2 y 0.4 mg ml -1 ), reportaron que a la concentración de 0.05 mg ml -1 hubo una inhibición del crecimiento micelial hasta un 80% y a partir de la concentración 0.1 mg ml -1 se obtuvo un 100% de inhibición durante todo el experimento que fue de 96 h de incubación. Sellam et al. (2007), reportaron un mayor efecto inhibitorio del crecimiento micelial en Alternaria brassicae que en A. brassicicola, con la aplicación de los isotiocianatos de bencilo y alilo causando una inhibición del 50% en el diámetro de la colonia utilizando una concentración media de 0.2 y 0.6 mm respectivamente. La inhibición del 50% de la 15

36 elongación del tubo germinativo en ambas especies de hongos fue efectiva, observándose que en A. brassicae con ambos isotiocianatos la concentración media efectiva fue de 0.06 mm y en A. brassicicola el isotiocianato de bencilo causó el mismo efecto inhibitorio a una concentración media de 0.65 mm. Este estudio concluyó que estos isotiocianatos probados fueron más efectivos en la inhibición del tubo germinal que en el crecimiento micelial y la germinación de conidios en ambos fitopatógenos. 16

37 3. JUSTIFICACIÓN El gladiolo es una de las flores de corte más importantes en México, sin embargo, el culltivo es afectado por diferentes enfermedades fungosas. Destacando la ocasionada por Fusarium oxysporum f. sp. gladioli que afecta alrededor del 40-60% de los cormos durante su almacenamiento. Actualmente la investigación se ha enfocado en aplicar productos que no sean dañinos al ser humano así como al ambiente y que no generen resistencia a microorganismos. Dentro de las probables alternativas de manejo de este patógeno se encuentra el uso de compuestos biodegradables y no tóxicos como el quitosano y los isotiocianatos. 17

38 4. OBJETIVOS Objetivo general Evaluar el efecto antifúngico de quitosano e isotiocianatos sobre el desarrollo in vitro y morfología de F. oxysporum f. sp. gladioli. Objetivos específicos Evaluar el efecto del quitosano en las concentraciones de 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mg ml -1 sobre el crecimiento micelial, germinación, integridad de membrana y morfología de Fusarium oxysporum f. sp. gladioli. Evaluar el efecto de los isotiocianatos de fenilo, 2-feniletio y bencilo en las concentraciones de 0.01, 0.025, 0.05 y 0.1 mg ml -1 sobre el crecimiento micelial, germinación, integridad de membrana y morfología de Fusarium oxysporum f. sp. gladioli. Evaluar el efecto de la combinación quitosano e isotiocianatos sobre el crecimiento micelial y germinación de Fusarium oxysporum f. sp. gladioli. 18

39 5. MATERIALES Y METODOS 5.1 RESUMEN EXPERIMENTAL La parte experimental realizada en este trabajo se dividió en tres etapas (Figura 3). La primera consistió en la obtención, identificación y aislamiento del organismo. En la segunda se realizó la evaluación in vitro del quitosano, isotiocianatos y su combinación sobre el desarrollo de F. oxysporum f. sp. gladioli y en la tercera, se procedió a realizar estudios de integridad de membrana (IM) y microscopia electrónica de barrido (MEB) a los tratamientos que tuvieron mejores efectos inhibitorios. Identificación y aislamiento de Fusarium oxysporum f. sp. gladioli. Estudios in vitro Efecto de quitosano en el desarrollo de F. oxysporum Preparación de quitosano: 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mg ml -1 Efecto de los isotiocianatos en el desarrollo de F. oxysporum Aplicación de los isotiocianatos de: bencilo, fenilo 2-feniletilo: 0.01, 0.025, 0.5 y 0.1 mg ml -1 Efecto de la combinación quitosano e isotiocianatos en el desarrollo de F. oxysporum Evaluación de la Integridad de Membrana (IM) Cuantificación de conidios viables y no viables. Cambios morfológicos en conidios y micelio MEB Variables a evaluadas: 1. Crecimiento micelial 2. Germinación de conidios Análisis Estadístico Figura 3. Diagrama experimental 19

40 5.2 Obtención del microorganismo Fusarium oxysporum f. sp. gladioli fue aislado de cormos infectados de gladiolo variedad Blanca espuma provenientes de Cuautla, Morelos. Los cormos se colocaron en cámaras húmedas durante 48 h (Figura 4). Posteriormente se tomó una muestra de micelio y se observó al microscopio para su identificación siguiendo las claves de Nelson et al. (1983); Booth (1971); Leslie y Summerell (2006). Posteriormente de su aislamiento y purificación se corroboro la especie mediante una secuenciación y se comparo con un banco de datos arrojando un 99.6 % de similitud de la región ITS1. Las muestras que presentaron conidios característicos de F. oxysporum se sembraron en el centro de cajas de Petri en medio de cultivo PDA incubándose a una temperatura de 25+2 C hasta la reaparición de micelio. Se reinoculó en cormos libres de enfermedad para observar la sintomatología y confirmar la presencia de F. oxysporum. Figura 4. Crecimiento de Fusarium oxysporum f. sp. gladioli en cámaras húmedas. 20

41 5.3 Efecto del quitosano en el desarrollo in vitro de F. oxysporum f. sp. gladioli Preparación del quitosano Se preparó una solución stock de 10 mg ml -1, para lo cual se adicionaron 2 g de quitosano de bajo peso molecular (Sigma-Aldrich), 100 ml de agua destilada, 2 ml de ácido acético en agitación constante durante 24 h. Se ajustó a un ph de 5.6 con una solución de NaOH 1 N, se aforó a 200 ml y se esterilizó en autoclave (Marca AESA MOD. CV 250), a una presión de 15 lb/pulg 2 durante 15 min. Se tomaron alícuotas para obtener las concentraciones de 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mg ml -1 (Hernández-Lauzardo et al., 2008) Aplicación de los tratamientos Se preparó medio PDA el cual fue esterilizado a una presión de 15 lb/pul 2 durante 15 min, para finalmente mezclarse con las diferentes concentraciones de quitosano previamente esterilizadas en matraces Erlenmeyer de 250 ml, los cuales se dejaron enfriar a temperatura ambiente. Antes que el medio PDA se solidificará, se vació en cajas Petri de 10 cm de diámetro en una campana de flujo laminar (Marca VECO). Las cajas se taparon, etiquetaron y sellaron con cinta Plastipack para su uso posterior. El tratamiento control no contenía quitosano (Figura 5). 21

42 Figura 5. Tratamientos con quitosano y el control Variables evaluadas Crecimiento micelial En el centro de la caja Petri se sembró un pequeño disco de 5 mm de diámetro con F. oxysporum f. sp. gladioli. Las cajas se etiquetaron y sellaron. Se llevaron a cabo seis repeticiones por tratamiento. Se evaluó el crecimiento micelial cada 24 h con un Vernier durante un periodo de incubación a 25+2 C. El bioensayo se detuvo cuando el micelio el tratamiento control alcanzó el borde final de la caja Petri (11 días) (Figura 6). 22

43 Figura 6. Medición del crecimiento micelial Germinación de conidios en medio líquido Se colocaron alícuotas de 50 μl de una suspensión de esporas (1x10 6 ) en tubos Eppendorf con 500 μl de medio Caldo Papa Dextrosa (CPD) con las diferentes concentraciones de quitosano referidas anteriormente. Las muestras se incubaron a 25+2 C durante 6, 7, 8 y 9 h (Figura 7). Con un microscopio óptico (40x) (NIKON Mod.YS2) se determinó el número de conidios que germinaron de un total de 100 (Hernández-Lauzardo et al., 2007). Se consideró un conidio germinado cuando el tubo germinal sobresalió en 20% del tamaño del conidio. El tratamiento control no contenía quitosano. Se llevaron a cabo seis repeticiones por tratamiento. 23

44 Figura 7. Incubación de conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli en medio líquido con quitosano 5.4 Efecto de los isotiocianatos de bencilo, 2-feniletilo y fenilo en el desarrollo in vitro de F. oxysporum f. sp. gladioli Isotiocianatos Se usaron los isotiocianatos de bencilo, fenilo y 2-feniletilo con un 98% de pureza (obtenidos de Sigma-Aldrich, St. Louis U. S. A) Aplicación de los isotiocianatos Se colocaron filtros (Wattman No. 1) de 2 cm de diámetro impregnados con las diferentes concentraciones de cada uno de los isotiocianatos probados (0.010, 0.025, 0.05 y 0.1 mg ml -1 ) en la tapa de la caja Petri con PDA. Una vez sembrado el disco con F. oxysporum 24

45 en el centro de la caja Petri se sellaron y se colocaron boca abajo (Troncoso et al., 2005) (Figura 8). Figura 8. Preparación de los tratamientos con isotiocianatos Variables evaluadas Crecimiento micelial La evaluación del crecimiento micelial se realizó de forma similar a como se indicó en el inciso Germinación de conidios en discos de PDA Alícuotas de 50 μl de una suspensión de esporas (1x10 6 ) se adicionaron a discos de PDA (20 mm de diámetro) colocándolos sobre porta objetos y se colocaron filtros (Wattman No. 1) de 2 cm de diámetro impregnados con las diferentes concentraciones de cada uno de 25

46 los isotiocianatos probados e incubándose en cajas Petri a 25+2 C durante 6, 7, 8 y 9 h (Figura 9). Con un microscopio óptico (NIKON Mod.YS2) (40x) se determinó el número de esporas que germinaron de un total de 100 (Hernández-Lauzardo et al., 2007). El tratamiento control no contenía isotiocianatos. Se llevaron a cabo seis repeticiones por tratamiento. Figura 9. Incubación de conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli para evaluar la germinación con los isotiocianatos. 5.5 Efecto de la combinación quitosano e isotiocianatos Todos los tratamientos llevados a cabo con quitosano e isotiocianatos en forma individual se combinaron. Se realizaron evaluaciones (48) de crecimiento micelial y germinación como se indica en los incisos anteriores. 26

47 5.6 Efecto del quitosano e isotiocianatos en la integridad de la membrana de F. oxysporum f. sp. gladioli Colorante Se uso el colorante de ioduro de propidium (PI) (Sigma-Aldrich) Preparación de colorante El colorante, se preparó siguiendo la metodología de Liu et al. (2007) con algunas modificaciones. Se preparó una solución stock de 1 mg ml -1 de PI en agua destilada estéril y se almacenó a 4 C Evaluación de la integridad de la membrana. Se realizó una suspensión de esporas de 1x10 6 ml -1 de F. oxysporum f. sp. gladioli y se trataron con las diferentes concentraciones de quitosano e isotiocianatos. Las muestras se incubaron a 25+2 ºC durante 6, 7, 8 y 9 h. al término del periodo de incubación los conidios fueron recuperados por centrifugación a 4000 rpm durante 5 min y lavados con 50 mm de regulador de fosfato de sodio (Na HPO 4 ) ph 7.0 mono básico para remover los residuos del medio. Se aplicó 1 ml del colorante antes descrito y se dejaron las muestras en la oscuridad durante 5min a temperatura ambiente (25+2 ºC). Finalmente, los conidios fueron colectados por centrifugación (2 min a 7000 rpm) y lavados en tres ocaciones con el regulador de fosfato de sodio. Los conidios se examinaron bajo un microscopio con 27

48 epifluorescencia óptica (Nikson Eclipse E600) con filtro de excitación verde ( nm). De cada tratamiento se analizaron 200 conidios. 5.7 Efecto del quitosano e isotiocianato de fenilo en la morfología de las hifas y conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli Estudios de microscopia electrónica de barrido (MEB) Micelio de F. oxysporum f. sp. gladioli de 12 días de edad y conidios con 7 h de incubación en quitosano (1.5 mg ml -1 ) y el isotiocianato de fenilo (0.1 g ml -1 ) se fijaron con 6% de glutaraldehido durante 24 h a temperatura ambiente. Las muestras se llevaron al Laboratorio de Microscopia Electrónica de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa (UAM-I) donde se procesaron. Las muestras se lavaron tres veces con una solución buffer de fosfato a 0.02 M y se fijaron con 2% de tetraoxido de osmio durante 2 h a 20 C, y se deshidrataron con series de etanol durante cinco minutos cada una. El micelio y conidios se secaron en presencia de CO 2 y se cubrieron con oro y paladio con ayuda de una ionizadora. Las muestras se examinaron con un microscopio electrónico de barrido (Carl Zeiss DSM 940 operando a 30 kv) (Hernández-Lauzardo et al., 2008). 28

49 5.8 Análisis estadístico Los experimentos con quitosano e isotiocianatos tuvieron un arreglo completamente al azar. En los experimentos de las combinaciones se realizó un modelo bi Factorial. Para los datos generados en crecimiento micelial de todos los tratamientos se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) de medias Rrpetidas bi factorial. La comparación de medias se realizó con la prueba de intervalos múltiples de Student Newman Keuls (p<0.05). En los tratamientos que no pasaron la prueba de normalidad y homogeneidad de varianza, se realizó una ANDEVA en rangos de Friedman. La comparación de medias se realizó con la prueba de intervalos múltiples de Tukey (p<0.05). Se realizaron regresiones para determinar la velocidad de crecimiento del hongo en los diferentes tratamientos. 29

50 6. RESULTADOS 6.1 Fusarium oxysporum Shlecht En medio PDA Fusarium oxysporum presentó un micelio algodonoso con tonalidades blancas, rosas o purpuras. También, se observaron las estructuras reproductoras como son: microconidios hialinos de forma elipsoidal-ovalada de tamaños 5-12 x μ; macroconidios multiseptados (3-7) alargados en forma de media luna, célula apical atenuada en forma de gancho y célula basal en forma de pie con un intervalo de x 3-5μ y clamidosporas de forma esférica formadas individualmente, en pares o cadenas (Figura 10). Microconidios Clamidosporas Macroconidios Macroconidioforos (monofialides) Microconidioforos (monofialides) Figura 10. Estructuras reproductoras de F. oxysporum 30

51 6.2. Efecto del quitosano en el desarrollo in vitro de F. oxysporum f. sp. gladioli Crecimiento micelial En la Figura 11, se muestra la cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum con las diferentes concentraciones de quitosano probadas durante 11 días de incubación. Se observó una inhibición del crecimiento micelial en todas las concentraciones en comparación con el control. La concentración de quitosano de 2.0 mg ml -1 fue la que tuvo un efecto de mayor inhibición en comparación con los tratamientos restantes durante todo el tiempo de incubación. En la Figura 12, se observa el crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli incubado sólo en PDA el cual abarcó toda la caja Petri, en comparación con el casi nulo crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli con las diferentes concentraciones de quitosano. Las diferencias significativas (p< 0.05) entre los tratamientos probados con quitosano en F. oxysporum f. sp. gladioli se muestra en el Cuadro 1. 31

52 100 Tamaño de colonia (mm) mg ml mg ml mg ml mg ml -1 CONTROL Tiempo (Días) Figura 11. Cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli en presencia de diferentes concentraciones de quitosano. Cada punto representa la media de 6 repeticiones + error estándar. a b c d e Figura 12. Crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli en PDA con diferentes concentraciones de quitosano. Control (a); 0.5 mg ml -1 (b); 1.0 mg ml -1 (c); 1.5 mg ml -1 (d); 2.0 mg ml -1 (e). 32

53 El hongo, expuesto a la concentración de 2.0 mg ml -1 inició su crecimiento hasta el quinto día de incubación. Del segundo hasta el octavo día, los datos de los tratamientos con quitosano fueron diferentes significativamente entre sí y también respecto al control. Al final del periodo de incubación en los tratamientos con quitosano no fueron estadísticamente diferentes sin embargo, hubo diferencias respecto al tratamiento control. Respecto a la tasa de crecimiento (Cuadro 2) se observó que la velocidad máxima de crecimiento diario fue en el tratamiento control (6.9 mm), y la mínima correspondió al tratamiento con quitosano a la mayor concentración de 2.0 mg ml -1 con 0.8 mm diarios. Todos los tratamientos con quitosano tuvieron una velocidad de crecimiento menor que el tratamiento sin quitosano. 33

54 CUADRO 1. Efecto del quitosano en el crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli durante 11 días de incubación. QUITOSANO PERIODO DE INCUBACIÓN (DÍAS) Concentración CRECIMIENTO MICELIAL (mm) mg ml b 8.2e 8.6e 10.5e 11.7e 12.8e 13.8e 14.8e 15.8b 16.7b 18.2b 1.0 5b 7.3d 7.8d 8.5d 11.0d 11.4d 12.1d 12.8d 13.6b 14.1b 15.1b 1.5 5b 6.2c 6.6c 7.0c 8c 9.1c 10.3c 11.8c 13.9b 15.4b 17.7b 2.0 5b 5 b 5b 5b 6.4b 6.8b 7.2b 7.9b 8.6c 10.5c 14.7b CONTROL 14.9a 22.5a 29.8a 38.1a 45.7a 52.9a 60.7a 67.2a 74.5a 76.9a 83.0a Letras diferentes indican diferencias estadísticas (P<0.05) F=988.48; g l= 4, 250; P<0.001 TWO WAY RM ANOVA; Prueba de separación de medias de Student Newman Keuls después de transformar datos (n=6) 34

55 CUADRO 2. Tasa de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli en presencia de quitosano. Tratamientos Quitosano mg ml -1 Velocidad de crecimiento (mm * día) Coeficiente de determinación r 2 Nivel de significancia F CONTROL gl= 1, Germinación de conidios La germinación de los conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli tratados con las diferentes concentraciones de quitosano durante 6, 7, 8 y 9 h de incubación fue totalmente inhibida. En contraste el tratamiento control tuvo a las 9h de incubación hasta un 83.5% de conidios germinados Efecto de los isotiocianatos de bencilo, 2-feniletilo y fenilo en el desarrollo in vitro de F. oxysporum f. sp. gladioli Isotiocianato de bencilo Crecimiento micelial En la Figura 13, se muestra la cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli incubado en las diferentes concentraciones del isotiocianato de bencilo donde se 35

56 observó que todos los tratamientos presentaron un patrón de crecimiento similar al control. Al término del periodo de incubación, sólo la concentración de 0.1 mg ml -1 tuvo una mayor inhibición en el crecimiento micelial (13.7%) en comparación con los demás tratamientos (Figura16). Las diferencias significativas (p <0.05) entre los tratamientos probados con el isotiocianto de bencilo en F. oxysporum f. sp. gladioli se muestra en el Cuadro 3. El hongo, expuesto a la concentración de 0.1 mg ml -1 inició su crecimiento al segundo día de exposición. En el último día de incubación, los tratamientos aplicados fueron diferentes estadísticamente entre si y también respecto al control. Con respecto a la tasa de crecimiento (Cuadro 4), se observó la velocidad máxima de crecimiento en el tratamiento control con valores de 6.9 mm de crecimiento diario, mientras que la mínima velocidad correspondió al tratamiento con la concentración mayor de 0.1 mg ml -1 con 6.18 mm. Todos los tratamientos con bencilo tuvieron una velocidad de crecimiento muy similar al control. 36

57 100 Tamaño de colonia (mm) mg ml mg ml mg ml mg ml -1 CONTROL Tiempo (Días) Figura 13. Cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli incubado en diferentes concentraciones del isotiocianato de bencilo. Cada punto representa la media de 6 repeticiones + error estándar. 37

58 CUADRO 3. Efecto del isotiocianatos de bencilo en el crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli durante 12 días de incubación. BENCILO Concentración PERIODO DE INCUBACIÓN (DÍAS) CRECIMIENTO MICELIAL (mm) mg ml a 12a 18.8a 26a 32.7a 37.7edbc 44.7edc 51.6edc 57.8c 64.2c 68.2c 75.3d a 12.7a 19a 26.3a 33.4a 40dc 46.3dc 53dc 60.1c 65.3c 70.4c 75.8d a 11.5a 17.4a 24.5a 30.9b 37.4cb 43c 50.1c 56.2c 61.2b 66.3b 73.1c 0.1 5a 8.8a 13.9a 20a 28.2b 33.2b 39b 46b 53.0b 59.2b 64.2b 71.1b CONTROL 8.8a 15.3a 23.6a 31a 38.8a 45.9a 53.7a 60.4a 67.6a 73.5a 77.1a 82.4a Letras diferentes indican diferencias estadísticas (P<0.05) F=21.608; g l= 4, 264; P<0.001 TWO WAY RM ANOVA; Prueba de separación de medias de Student Newman Keuls después de transformar datos (n=6) 38

59 CUADRO 4. Tasa de crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli en presencia del isotiocianato de bencilo Velocidad de Coeficiente de Nivel de Tratamientos crecimiento determinación significancia Bencilo mg ml -1 (mm * día) r 2 F CONTROL gl= 1, Isotiocianato 2-feniletilo Crecimiento micelial En la Figura 14, se muestra la cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli en las diferentes concentraciones aplicadas del isotiocianatos de 2-feniletilo, donde se observó que todos los tratamientos presentaron un patrón de crecimiento similar al control. Sólo las concentraciones de 0.05 y 0.1 mg ml -1 fueron las que presentaron un efecto de mayor inhibición del crecimiento micelial (6.1 y 8.4% respectivamente) en comparación con los demás tratamientos. 39

60 100 Tamaño de colonia (mm) mg ml mg ml mg ml mg ml-1-1 CONTROL Tiempo (Días) Figura 14. Cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli en presencia de diferentes concentraciones del isotiocianato 2-feniletilo. Cada punto representa la media de 6 repeticiones + error estándar. Las diferencias significativas (p< 0.05) entre los tratamientos probados con el isotiocianato de bencilo en F. oxysporum f. sp. gladioli se muestran en el Cuadro 5. El crecimiento del hongo expuesto a las concentraciones de 0.05 y 0.1 mg ml -1 en el último día de incubación fue estadísticamente diferente respecto al tratamiento control. 40

61 Respecto a la tasa de crecimiento (Cuadro 6), se observó la velocidad máxima de crecimiento en el tratamiento control con valores de 6.9 mm de crecimiento diario, mientras que, la mínima velocidad correspondió al tratamiento con la concentración de 0.1 mg ml -1 con 6.3 mm diarios. Todos los tratamientos con 2-feniletilo tuvieron una velocidad de crecimiento muy similar al tratamiento control. 41

62 CUADRO 5. Efecto del isotiocianato 2-feniletilo en el crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli durante 12 días de incubación. 2-FENILETILO PERIODO DE INCUBACIÓN (DÍAS) Concentración CRECIMIENTO MICELIAL (mm) mg ml ª 14.6a 21.5a 28.8a 35.9a 42.1b 48.4a 52.9b 62.2c 70.8c 74.6b 78.1a ª 14.6a 21.9a 29.1a 35.8b 42.5a 48.5a 55.2a 62.6c 70.2c 74b 79a ª 14.5a 21.8a 28.8a 34.8b 41.8b 47.4b 54.1b 62c 68.4b 72.8b 77.4b ª 14.4a 21.6a 27.8a 34.3b 40.7b 46.9b 52.6b 59.9b 66.2b 69.4c 75.4b CONTROL 8.8ª 15.3a 23.6a 31ab 38.8a 45.9a 53.7a 60.4a 67.6a 73.5a 77.1a 82.4a Letras diferentes indican diferencias estadísticas (P<0.05) ANOVA en rangos de Friedman Comparación de medias Tukey mg ml -1 H=70.291; gl: 11; mg ml -1 = gl: 11; 0.05 mg ml -1 = gl: mg ml -1 = gl: 11; Control H = g l: 11 P<

63 CUADRO 6. Tasa de crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli incubado en el isotiocianato de 2-feniletilo Velocidad de Coeficiente de Nivel de Tratamientos crecimiento determinación significancia 2-feniletilo mg ml -1 mm * día r 2 F CONTROL gl= 1, Isotiocianato de fenilo Crecimiento micelial En la Figura 15, se muestra la cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli tratado con diferentes concentraciones del isotiocianato de fenilo, donde se observó que los tratamientos a las concentraciones de 0.05 y 0.1 mg ml -1 inhibieron el crecimiento micelial en un 51.4 y 65.4 %, respectivamente, en comparación con los demás tratamientos. Asimismo, se observó que a medida que aumentó la concentración de este isotiocianato el crecimiento micelial se inhibió. 43

64 100 Tamaño de colonia (mm) mg ml mg ml mg ml mg ml -1 CONTROL Tiempo (Días) Figura 15. Cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli en presencia de diferentes concentraciones del isotiocianato de fenilo. Cada punto representa la media de 6 repeticiones + error estándar Las diferencias significativas (p< 0.05) entre los tratamientos probados con el isotiocianato de fenilo en F. oxysporum f. sp. gladioli se muestran en el Cuadro 7. El hongo, expuesto a la concentración de 0.05 y 0.1 mg ml -1 inició su crecimiento al tercer y quinto día de exposición, respectivamente. Al último día de incubación estos dos tratamientos fueron diferentes estadísticamente respecto al tratamiento control. Respecto a la tasa de crecimiento (Cuadro 8), se observó la velocidad máxima de crecimiento en el tratamiento control con valores de 6.9 mm de crecimiento diario, mientras 44

65 que, la mínima velocidad correspondió al tratamiento con la concentración mayor de 0.1 mg ml -1 con 2.2 mm diarios. Todos los tratamientos tuvieron una velocidad menor de crecimiento a la del tratamiento control. 45

66 CUADRO 7. Efecto del isotiocianato de fenilo en el crecimiento micelial de F. oxyspoum f. sp. gladioli durante 12 días de incubación. FENILO Concentración PERIODO DE INCUBACIÓN (DÍAS) CRECIMIENTO MICELIAL (mm) mg ml b 8.7d 13.1e 18.8e 24.3e 32.2ab 38.1a 44.3a 55.5a 60a 66.7a 73.2a b 6.2c 8.2d 12.4d 18d 24b 28.5a 34.8a 42.8a 48a 51.4a 58.8a b 5b 6.7c 8.3c 11.2c 14c 17.6b 23.1b 27.3b 31.9a 35.5a 40ab 0.1 5b 5b 5b 5b 7.1b 9.3d 12.2c 16c 18.4c 21.1b 24.7b 28.1b CONTROL 8.8a 15.3a 23.6ª 31a 38.8a 45.9a 53.7a 60.4a 67.6a 73.5a 77.1a 82.4a Letras diferentes indican diferencias estadísticas (P<0.05) F=135.04; g l= 4, 252; P<0.001 TWO WAY RM ANOVA; Prueba de separación de medias de Student Newman Keuls después de transformar datos (n=6) 46

67 CUADRO 8. Tasa de crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli incubado en el isotiocianato de fenilo Velocidad de Coeficiente de Nivel de Tratamientos crecimiento determinación significancia Fenilo mg ml -1 mm * día r 2 F CONTROL gl= 1, 70 En la Figura 16, se observa el efecto de los tres isotiocianatos probados y el control sobre el crecimiento micelial de Fusarium oxysporum f. sp. gladioli. De los tres isotiocianatos aplicados, el de fenilo tuvo el mayor efecto inhibitorio. 47

68 I. a b c d e II. a b c d e III. a b c d e Figura 16. Crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli en medio PDA adicionado con diferentes isotiocianatos de: bencilo (I); 2-feniletilo (II); fenilo(iii). Control (a); 0.01 mg ml -1 (b); mg ml -1 (c); 0.05 mg ml -1 (d); 0.1 mg ml -1 (e) Germinación de conidios La exposición de conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli en los diferentes isotiocianatos durante 6, 7, 8 y 9 h, inhibió totalmente su germinación. En contraste, el tratamiento control tuvo a las 7h de incubación un 94% de conidios germinados. 48

69 6.4. Efecto de la combinación quitosano e isotiocianatos Crecimiento micelial Quitosano e isotiocianato de bencilo En la Figura 17, se muestra la cinética de crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli con las 16 combinaciones quitosano-bencilo, donde se observó una acción inhibitoria en todas las concentraciones usadas durante el periodo de incubación. Los tratamientos del isotiocianato de bencilo (0.01, 0.025, 0.05 y 0.1 mg ml -1 ) con quitosano (1.0, 1.5 y 2.0 mg ml -1 ) tuvieron las mayores afectaciones en el crecimiento micelial del hongo, el cual se inhibió hasta un 100%. Sólo en la combinación bencilo 0.01 mg ml -1 -quitosano 0.5 mg ml -1 y bencilo mg ml -1 - quitosano 0.5 mg ml -1 se observó una inhibición del crecimiento de 66.4 y 71.8 %, respectivamente. 49

70 Tamaño de colonia (mm) Días [1] Q1 [1] Q2 [1] Q3 [1] Q4 [2] Q1 Figura 17. Cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli en presencia de concentraciones de quitosano y del isotiocianato de bencilo. Concentraciones de quitosano: (Q1) 0.5 mg ml -1, (Q2) 1.0 mg ml -1, (Q3) 1.5 mg ml -1, (Q4) 2.0 mg ml - 1. Concentraciones del isotiocianato de bencilo: * mg ml -1, [2] mg ml -1 ; [3] mg ml -1, *4+ 0.1mg ml -1. Cada punto representa la media de 6 repeticiones + error estándar. En la Figura 18, se observó el crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli incubado sólo en PDA el cual abarcó toda la caja Petri, en comparación con el nulo crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli con las diferentes combinaciones de quitosanoisotiocianato de bencilo al último día de incubación. 50

71 Figura 18. Crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli en medio PDA en presencia de concentraciones de quitosano-isotiocianato de bencilo al término del periodo de incubación Quitosano e isotiocianato 2-feniletilo En la Figura 19, se muestra la cinética de crecimiento de F. oxysporum con las 16 combinaciones de quitosano isotiocianato de 2-feniletilo. Se observó una acción inhibitoria en todas las concentraciones usadas, desde un 65% (quitosano feniletilo 51

72 Tamaño de colonia (mm) 0.01 mg ml -1 ) hasta un 86.4% (quitosano 2.0-2feniletilo 0.01mg ml -1 ) y una total inhibición en tres tratamientos que coincidieron en ser las combinaciones más altas de quitosano (2.0 mg ml -1 ) con el isotiocianato de2-feniletilo (0.025, 0.05 y 0.1 mg ml -1 ). En algunos tratamientos el crecimiento micelial inició hasta el segundo y tercer día de incubación Días [1] Q1 [1] Q2 [1] Q3 [1] Q4 [2] Q1 [2] Q2 [2] Q3 [2] Q4 [3] Q1 [3] Q2 [3] Q3 [3] Q4 [4] Q1 [4] Q2 [4] Q3 [4] Q4 control Figura 19. Cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli en presencia de concentraciones de quitosano y del isotiocianato de 2-feniletilo. Concentraciones de quitosano: (Q1) 0.5 mg ml -1, (Q2) 1.0 mg ml -1, (Q3) 1.5 mg ml -1, (Q4) 2.0 mg ml - 1. Concentraciones del isotiocianato 2-feniletilo: * mg ml -1, * mg ml -1 ; [3] mg ml -1, *4+ 0.1mg ml -1. Cada punto representa la media de 6 repeticiones + error estándar. En la Figura 20, se observó el crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli incubado sólo en PDA el cual abarcó toda la caja Petri, en comparación con el crecimiento casi nulo de F. oxysporum f. sp. gladioli con las diferentes combinaciones de quitosano- 2-52

73 feniletilo al último día de incubación, en la cual se puede apreciar una total inhibición del crecimiento micelial en tres tratamientos que coincidieron en ser las combinaciones más altas de quitosano (2.0 mg ml -1 ) con el isotiocianato de 2-feniletilo (0.025, 0.05 y 0.1 mg ml -1 ). Figura 20. Crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli en medio PDA en presencia de concentraciones de quitosano isotiocianato de 2-feniletilo al término del periodo de incubación. El hongo fue altamente sensible a la combinación de estos compuestos. En el último día de incubación, todos los tratamientos fueron diferentes estadísticamente respecto al control (p<0.05), más no diferentes entre si, a excepción de los seis 53

74 tratamientos con las concentraciones más elevadas de quitosano (2.0 mg ml -1 ; 1.5 mg ml - 1 ) con el isotiocianato de feniletilo (0.025, 0.05 y 0.1 mg ml -1 ) (Cuadro 9). CUADRO 9. Efecto de la combinación quitosano el isotiocianato de 2-feniletilo en el crecimiento micelial de F. oxyspoum f. sp. gladioli al término del periodo de incubación Concentraciones Feniletilo + Quitosano mg ml -1 Crecimiento (mm) % de inhibición d d d b d d c b d d d b c d c b 100 CONTROL 82.4a 0 Letras diferentes indican diferencias estadísticas (P<0.05) ANOVA en rangos de Friedman Comparación de medias Tukey. H = gl:15. (P <0.001) 54

75 En el Cuadro 10, se muestra la velocidad de crecimiento del hongo tratado con las 16 combinaciones quitosano- isotiocianato de feniletilo. Se obtuvo un crecimiento diario menor a 2.08 mm mientras que, el tratamiento control alcanzó una velocidad máxima de 5.8 mm de crecimiento diario. CUADRO 10. Tasa de crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli incubado en la combinación quitosano-isotiocianato de 2-feniletilo Tratamientos Velocidad de Coeficiente de 2-Feniletilo + Quitosano crecimiento determinación Nivel de significancia mg ml -1 mm * día r 2 F CONTROL gl: 1, 70 55

76 Tamaño de colonia (mm) Quitosano e isotiocianato de fenilo En la Figura 21, se muestra la cinética de crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli con los 16 tratamientos quitosano-fenilo. Se observó una acción inhibitoria en todas las concentraciones usadas desde un 60. 9% (quitosano 0.5 isotiocianato de fenilo 0.01 mg ml -1 ) hasta un 90.3% (quitosano 2.0 isotiocianato de fenilo 0.1mg ml -1 ), El crecimiento micelial en esta concentración inició hasta el 10 día de incubación [1] Q1 [1] Q2 [1] Q3 [1] Q4 [2] Q1 [2] Q2 Días [2] Q3 [2] Q4 [3] Q1 [3] Q2 [3] Q3 [3] Q4 [4] Q1 [4] Q2 [4] Q3 [4] Q4 control Figura. 21. Cinética de crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli inoculado en diferentes concentraciones de quitosano y del isotiocianato de fenilo. Concentraciones de quitosano: (Q1) 0.5 mg ml -1, (Q2) 1.0 mg ml -1, (Q3) 1.5 mg ml -1, (Q4) 2.0 mg ml - 1. Concentraciones del isotiocianato fenilo:* mg ml -1, [2] mg ml -1 ; [3] mg ml -1, *4+ 0.1mg ml -1. Cada punto representa la media de 6 repeticiones + error estándar. En la Figura 22, se observó el crecimiento micelial de F. oxysporum f. sp. gladioli incubado en medio PDA el cual abarcó toda la caja Petri, en comparación con el poco 56

77 crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli con las 16 combinaciones de quitosano- fenilo al último día de incubación. Se pudo apreciar una inhibición del crecimiento micelial en todas las combinaciones evaluadas. QUITOSANO [0.5 mg ml -1 ] FENILO [0.010 mg ml -1 ] QUITOSANO [1.0 mg ml -1 ] FENILO [0.010 mg ml -1 ] QUITOSANO [1.5 mg ml -1 ] FENILO [0.010 mg ml -1 ] QUITOSANO [2.0 mg ml -1 ] FENILO [0.010 mg ml -1 ] QUITOSANO [0.5 mg ml -1 ] FENILO [0.025 mg ml -1 ] QUITOSANO [1.0 mg ml -1 ] FENILO [0.025 mg ml -1 ] QUITOSANO [1.5 mg ml -1 ] FENILO [0.025 mg ml -1 ] QUITOSANO [2.0 mg ml -1 ] FENILO [0.025 mg ml -1 ] QUITOSANO [0.5 mg ml -1 ] FENILO [0.050 mg ml -1 ] QUITOSANO [1.0 mg ml -1 ] FENILO [0.025 mg ml -1 ] QUITOSANO [1.5 mg ml -1 ] FENILO [0.025 mg ml -1 ] QUITOSANO [2.0 mg ml -1 ] FENILO [0.025 mg ml -1 ] QUITOSANO [0.5 mg ml -1 ] FENILO [0.1 mg ml -1 ] QUITOSANO [1.0 mg ml -1 ] FENILO [0.1 mg ml -1 ] QUITOSANO [1.5 mg ml -1 ] FENILO [0.1 mg ml -1 ] Figura 22. Crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli en medio PDA con diferentes concentraciones de quitosano-fenilo al término del periodo de incubación. QUITOSANO [2.0 mg ml -1 ] FENILO [0.1 mg ml -1 ] El hongo fue sensible a la combinación de estos compuestos. En el último día de incubación, todos los tratamientos fueron diferentes estadísticamente respecto al control (p<0.05), más no diferentes entre si, a excepción de los seis tratamientos con las 57

78 concentraciones más elevadas de quitosano (2.0 mg ml -1 ; 1.5 mg ml -1 ) con fenilo (0.025, 0.05 y 0.1 mg ml -1 ) (Cuadro 11). CUADRO 11. Efecto de la combinación quitosano+fenilo en el crecimiento micelial de F. oxyspoum f. sp. gladioli al término del periodo de incubación Concentraciones Fenilo + Quitosano mg ml -1 Crecimiento (mm) % de inhibición c c c b c c b b c c c b c c b b 90.2 CONTROL 82.4a 0 Letras diferentes indican diferencias estadísticas (P<0.05) ANOVA en rangos de Friedman Comparación de medias Tukey H = ; gl: 15 (P = <0.001) 58

79 Las velocidades de crecimiento se muestran en el Cuadro 12. La velocidad mayor de crecimiento se observó en el tratamiento control con 5.82 mm de crecimiento diario mientras que, el crecimiento en general de los 16 tratamientos con quitosano-fenilo fue de 2.2 mm por día. Se registró el valor de crecimiento menor con la combinación quitosano 2.0 mg ml -1 - fenilo 0.1 mg ml -1 con mm diarios. CUADRO 12. Tasa de crecimiento de F. oxysporum f. sp. gladioli incubado en la combinación quitosano-fenilo. Tratamientos Velocidad de Coeficiente de Fenilo + Quitosano gl: 1, 70 mg ml -1 crecimiento mm * día determinación r 2 Nivel de significancia CONTROL F 59

80 6.5 Efecto del quitosano e isotiocianatos en la integridad de los conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli La intensidad fluorescente del conidio después de ser aplicado el ioduro de propidio fue muy variable en cada muestra por lo que no se pudo realizar la cuantificación (Figura 23). a) b) Figura 23. Viabilidad de conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli a) Control 8h 40x; b) feniletilo *0.025 mg ml -1 ] 9h 40x. 6.6 Efecto del quitosano e isotiocianato de fenilo en la morfología de las hifas y conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli Estudio de microscopia electrónica de barrido (MEB) Se observaron diferencias en la morfología de F. oxysporum f. sp. gladioli entre el control y el tratamiento con quitosano e isotiocianato de fenilo. En el caso de micelio no 60

81 tratado se observaron ramificaciones del micelio del hongo (Figura 24a) con una apariencia gruesa y bien formada. Asimismo, se observaron las estructuras características de Fusarium como fueron los conidióforos monofialides y clamidosporas (Figs. 24 b y c). a b c Figura 24. Microfotografía de hifas de F. oxysporum f. sp. gladioli, incubado en PDA. a) Ramificaciones de micelio bien formado mostrando hinchazón, x500; b) presencia de conidióforos, x2000 y c) clamidospora bien desarrollada, x

82 En relación a F. oxysporum f. sp. gladioli tratado con quitosano a la concentracion de 1.5 mg ml -1 se observó enrollamiento en la mayoría de las hifas (Figura 25a), también hubó deformaciones y engrosamientos en la punta de las hifas (Figura 25b). No se observó presencia de conidióforos y clamidosporas. a b Figura 25. Microfotografía de hifas de F. oxysporum f. sp. gladioli, incubadas con quitosano a 1.5 mg ml -1. a) hifas enrolladas, x3000, b) punta terminal deformada, x5000. En hifas de F. oxysporum f. sp. gladioli tratadas con fenilo a la concentración de 1.0 mg ml -1 se observó en su mayoría un aparente adelgazamiento con ausencia de las estructuras características del hongo antes mencionadas (Figs. 26a y b). 62

83 a b Figura 26. Microfotografía de hifas de F. oxysporum f. sp. gladioli tratadas con el isotiocianato de fenilo 1.0 mg ml -1. a) hifas delgadas, x500 y b) ausencia de estructuras características del hongo, x1000. En relación a los conidios incubados sólo en medio nutritivo PDB, éstos se observaron con apariencia normal sin deformaciones (Figura 27a). Sin embargo, los conidios incubados con quitosano e isotiocianato de fenilo tuvieron una apariencia deshidratada. (Figs. 27 b y c). b 63

84 a b c Figura 27. Microfotografía de conidios de F. oxysporum f. sp. gladioli tratadas con quitosano a 1.5 mg ml -1 e isotiocianato de fenilo a 1.0 mg ml -1 ; a) conidios incubados sólo en PDB, x4000; b) y c) deshidratación de los conidios incubados en quitosano x5000 e Isotiocianato de fenilo, x