INFORME FINAL. SUBPESCA / Agosto Requierente Subsecretaría de Pesca. Subsecretario de Pesca Pablo Galilea Carrillo

Transcripción

1

2 I N S T I T U T O D E F O M E N T O P E S Q U E R O INFORME FINAL CONVENIO SUBPESCA: Asesoría Integral para la toma de decisiones en pesca y acuicultura, 2010 Determinación de la presencia de enfermedades de alto riesgo en poblaciones de peces silvestres SUBPESCA / Agosto 2011 Requierente Subsecretaría de Pesca Subsecretario de Pesca Pablo Galilea Carrillo Ejecutor Instituto de Fomento Pesquero Director Ejecutivo Jorge Toro Da Ponte Jefe de División Investigación en Acuicultura Leonardo Guzmán Méndez Jefe de Proyecto Sergio Contreras Lynch Autores Paula Miranda Verónica Matus Tadaishi Yatade Sergio Contreras Juan Carlos Quintanilla Margarita González

3 RESUMEN EJECUTIVO El crecimiento de la industria salmonera en los últimos años ha estado acompañado de la presentación de enfermedades de carácter emergente que han afectado directamente el estatus sanitario nacional, entre ellas se encuentran la Vibriosis, Estreptococosis, Furunculosis atípica y durante el último tiempo, la Anemia Infecciosa del Salmón, cuyo primer brote fue reportado oficialmente el 25 de julio de 2007 (SERNAPESCA) A nivel internacional, países con sectores acuicultores de importancia han desarrollado numerosas investigaciones a objeto de poder determinar el riesgo de transmisión horizontal de enfermedades entre peces cultivados, peces de cultivo escapados y otros peces silvestres. Por otro lado, los métodos moleculares se han transformado en importantes herramientas en el diagnóstico y el estudio de la diversidad, mantenimiento y diseminación de agentes patógenos, encontrándose actualmente descritas las técnicas de Reacción de Polimerasa en Cadena (PCR) convencional, para todos los patógenos presentes en la lista 1 de enfermedades de alto riesgo (EAR), así como del virus de la Anemia Infecciosa del Salmón (ISAv), Vibrio ordalii, Piscirickettsia salmonis y Aeromonas salmonicida atípica. En Chile existe escasa información respecto al estatus sanitario de las poblaciones silvestres, como a su vez, la posible transmisión horizontal de agentes patógenos entre las poblaciones silvestres/asilvestradas y de cultivo. El presente documento constituye el Informe final del proyecto Determinación de la presencia de enfermedades de alto riesgo en poblaciones de peces silvestres cuyo objetivo general fue determinar y cuantificar la presencia de agentes causales de enfermedades de alto riesgo en poblaciones de peces silvestres y asilvestrados de las regiones de Los Lagos y Aysén. Las principales actividades ejecutadas consistieron en la realización de los muestreos de especies silvestres y asilvestradas para las Agrupaciones de Concesiones de Salmonicultura (ACS) 1, 10, 17, 18 y 28. Las muestras resultantes fueron analizadas por PCR convencional y tiempo real, para los patógenos Vibrio ordalii, Aeromonas salmonicida atípica, P.salmonis, Eubacterias, Virus de la septicemia Hemorrágica viral (VHSV), Virus de la necrosis hematopoyética epizoótica (EHNV), Virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), Virus del Oncorhynchus Massou (OMV), Virus de la Anemia Infecciosa del Salmón (ISAV) y Alfavirus, en forma semicuantitativa, utilizando genes reporteros para las especies capturadas. Los resultados finales indican que sólo se registró positividad para P. salmonis con 51 muestras positivas de un total de 796 muestras analizadas. Las muestras analizadas fueron secuenciadas entregando un alto porcentaje de identidad con P. salmonis. Las secuencias dominantes en las poblaciones silvestres corresponden a la cepa Irlandesa IRE99-D. 1 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

4 Por otro lado se realizó un estudio de factores de riesgo, identificando a las ACS N 1 y 17, como las que presentan mayor probabilidad de diagnósticos positivos de peces silvestres para el agente patógeno asociado a factores del área. Con los antecedentes de los diagnósticos, información sanitaria de los centros de cultivo y las ACS, se ejecutó un análisis de riesgo que identificó que la presencia de P. salmonis en las poblaciones silvestres tiene un bajo impacto sobre las poblaciones de peces en cultivo. Sin embargo, se hace necesario el dilucidar información objetiva respecto a las probabilidades de transmisión de enfermedades entre las poblaciones silvestres/cultivo para que el análisis de riesgo tenga sustento empírico. Dada la falta de información disponible, los resultados del análisis de riesgo se basan en la evaluación subjetiva de la probabilidad otorgada por el panel de expertos conformado para este proyecto. Finalmente se diseñó un Programa de Vigilancia para el monitoreo de Enfermedades de peces silvestres y asilvestrados, y se identificaron medidas de mitigación de riesgo en el caso de presentarse una condición sanitaria adversa en las poblaciones silvestres, eventualmente transmisible a las poblaciones de cultivo, y considerando como objetivo central, la disminución de la población susceptible. En consecuencia, y a la luz de los antecedentes científicos revisados para el presente informe, se considera de alta relevancia el desarrollar un programa estable de Vigilancia de enfermedades y patógenos en peces silvestres/asilvestrados como parte de la vigilancia integral de los sistemas acuáticos vinculados a la actividad acuicultora, dada su eventual relevancia en la emergencia de enfermedades. 2 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

5 ÍNDICE GENERAL RESUMEN EJECUTIVO... ÍNDICE GENERAL... INDICE DE ANEXOS... ÍNDICE DE FIGURAS... ÍNDICE DE TABLAS... Página i iii v vi viii 1. INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Objetivo general Objetivos específicos METODOLOGÍA Obtención de Muestras Análisis de las muestras Análisis estadístico de los resultados Organización de la información y elaboración de matriz de riesgo Conformación de Panel de expertos ad-hoc multidisciplinario Diseño y Aplicación de encuesta Análisis de riesgo de la transmisión de EAR entre peces asilvestrados/silvestres/cultivo Georeferenciar los resultados derivados del análisis de riesgo Validación de sistema de vigilancia/monitoreo propuesto en el proyecto Diseño de propuesta de Vigilancia/monitoreo Identificación de puntos críticos por zona Diseño de propuesta de medidas de mitigación RESULTADOS Obtención de Muestras Análisis de las Muestras Solicitud e Ingreso de Controles Positivos EAR lista Revisión Bibliográfica y elaboración de protocolos Búsqueda de posible gen reportero Búsqueda de posible gen reportero universal INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

6 4.3. Elaboración, implementación y establecimiento de Protocolos de PCR y extracción de Ácidos Nucleicos Preparación de controles positivos PCR en base a protocolos finales Análisis de las muestras por PCR Cuantificación relativa de los resultados positivos Aislamiento viral de los positivos Análisis estadístico Organización de la información y elaboración de matriz de interacción de variables en base a estadística multivariada Análisis de factores de riesgo de positividad a P. salmonis Análisis de factores de riesgo de la prevalencia de pooles positivos a Piscirickettsia salmonis de peces capturados en torno a centros de cultivo Conformación del panel de expertos Diseño y aplicación de encuesta Análisis de Riesgo de la transmisión de EAR entre peces asilvestrados/silvestres/cultivo Zonificación de las áreas estudiadas Validación de sistema de vigilancia propuesto en el proyecto Diseño de propuesta de vigilancia/monitoreo Identificación de Puntos Críticos por Zona Diseño de propuesta de medidas de mitigación CONCLUSIONES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS ANEXO 1. ANEXO 2. ANEXO 3. ANEXO 4. ANEXO 5. ANEXO 6. ANEXO 7. ANEXO 8. ANEXO 9. ANEXO 10. Fotografías Pesca de Investigación y procesamiento de Muestras Certificados de eliminación de material biológico Certificados de Ingreso de Controles positivos Protocolos Finales LBM-IFOP Respaldos Fotográficos de implementación de protocolos de PCR LBM-IFOP Planilla de resultados muestras por Zona de muestreo Resultados de las secuencias de P. salmonis por especie y porcentaje de identidad. Resultados de Alineamiento en BLAST Encuestas sanitarias Árboles de decisión de Análisis de Riesgo y Encuesta aplicada a Panel de expertos. 4 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

7 ÍNDICE DE ANEXOS ANEXO 1. ANEXO 2. ANEXO 3. ANEXO 4. ANEXO 5. ANEXO 6. ANEXO 7. ANEXO 8. ANEXO 9. ANEXO 10. Fotografías Pesca de Investigación y procesamiento de Muestras Certificados de eliminación de material biológico Certificados de Ingreso de Controles positivos Protocolos Finales LBM-IFOP Respaldos Fotográficos de implementación de protocolos de PCR LBM-IFOP Planilla de resultados muestras por Zona de muestreo Resultados de las secuencias de P. salmonis por especie y porcentaje de identidad. Resultados de Alineamiento en BLAST Encuestas sanitarias Árboles de decisión de Análisis de Riesgo y Encuesta aplicada a Panel de expertos. 5 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

8 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. Figura 11. Figura 12. Figura 13. Figura 14. Figura 15. Figura 16. Figura 17. Figura 18. Figura 19. Figura 20. Figura 21. Figura 22. Figura 23. Variaciones temporales en la cantidad de peces capturados y de muestreos durante el periodo mayo 2010 mayo Variación temporal en la captura de róbalo durante el periodo de estudio. Variación temporal en la captura de pejerrey durante el periodo de estudio. Variación temporal en la captura de chancharro durante el periodo de estudio. Variación temporal en la captura de rollizo durante el periodo de estudio. Variación temporal en la captura de cabrilla durante el periodo de estudio. Variación temporal en la captura de blanquillo durante el periodo de estudio. Variación temporal en la captura de merluza común durante el periodo de estudio. Perfil de fluorescencia de productos de PCR tiempo real, todas las especies. A y B indican los dos comportamientos de amplificación observados. Electroforesis productos de PCR convencional 18Sr. Electroforesis productos de PCR convencional 18Sr. Electroforesis de los controles positivos OMV. Electroforesis de los controles positivos EHNV. Electroforesis de los controles positivos IHNV Electroforesis de los controles positivos VHS Electroforesis de los controles positivos V. ordalii Electroforesis de los controles positivos A. salmonicida Electroforesis de productos de PCR de P. salmonis Cuantificación relativa de resultados positivos P.salmonis. Identificación de muestras cuantificadas por especie y zona de origen. Matriz de identidad al comprar las secuencias 16Sr disponibles en NCBI con la cepa IRE-99D. Árbol de escenarios que muestran el flujo de procesos de la transmisión y establecimiento de un agente patógeno desde peces silvestres/asilvestrado hacia poblaciones de cultivo. Árbol de escenarios que muestran el flujo de procesos de la transmisión y 6 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

9 Figura 24. Figura 25. Figura 26. Figura 27. Figura 28. Figura 29. Figura 30. Figura 31. Figura 32. Figura 33. establecimiento desde peces silvestres/asilvestrado hacia poblaciones silvestres. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en el estuario de Reloncaví. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en Hornopirén. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en Castro. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en Melinka. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en Aysén Prevalencia anual de P. salmonis en muestras de peces silvestres capturados en torno a centros de cultivo ubicados en (A) la región de Los Lagos y (B) Región de Aysén. Zonificación en base al análisis de riesgo de las zonas de estudio. Distribución de pooles por especie derivados de la Pesca de Investigación en torno a los centro de cultivo Cuantificación relativa de resultados positivos a P.salmonis Lote Nº 1 de muestras ACS Nº 17 por pool de órganos. Cuantificación relativa de resultados positivos a P.salmonis Lote Nº 1 de muestras ACS Nº 17 abierto por tejido. Figura 34. Fuentes de información disponibles organizadas por score de calidad (Rodgers, 2009). Figura 35. Figura 36. Figura 37. Potenciales vías de introducción y establecimiento de enfermedades en peces en ecosistema acuícola (Rodgers, 2007). Esquema de red de cerco con cierre vertical. (a) Red de cerco de cierre vertical. (b) Flotadores de la red de cerco. (c) Relinga de plomos y pesos de la red de cerco. (d) Anillas y patas de gallo de la red. 7 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

10 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Tabla 2. Tabla 3. Tabla 4. Tabla 5. Tabla 6. Tabla 7. Tabla 8. Tabla 9. Tabla 10. Tabla 11. Tabla 12. Tabla 13. Tabla 14. Tabla 15. Tabla 16. Tabla 17. Tabla 18. Tabla 19. Tabla 20. Genes reporteros para las especies en estudio. Características y métodos de análisis recomendados para agentes patógenos de peces, según Manual de Diagnóstico de Enfermedades Acuáticas de la OIE y otras referencias internacionales. Propuesta de escala semicuantitativa de Probabilidades. Escala semicuantitativa de impactos. Matriz de probabilidad final. Muestreos realizados por ACS según fecha. Nombre común y científico de especies capturadas en la Pesca de Investigación. Cantidad de pooles e individuos capturados, según zona muestreada en las pescas de investigación. Cantidad de individuos capturados y conformación de pooles según especie. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona del Estuario de Reloncaví. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona de Castro. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona de Hornopirén. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona de Melinka. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona de Aysén. Cantidad de peces capturados y pescas realizadas durante el periodo de estudio. Variación temporal en la captura de especies silvestres durante el periodo de estudio Valores promedio de longitud y peso de las especies capturadas en las pescas de investigación. Valores promedio de longitud y peso de las especies capturadas en las pescas de investigación Valores promedio de longitud y peso de las especies capturadas en las pescas de investigación, según tipo de muestreo (lejanía o proximidad) Partidores seleccionados identificación de secuencias, gen pesquisado y tamaño del producto amplificado. 8 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

11 Tabla 21. Tabla 22. Tabla 23. Tabla 24. Tabla 25. Tabla 26. Tabla 27. Tabla 28. Tabla 29. Tabla 30. Tabla 31. Tabla 32. Tabla 33. Tabla 34. Tabla 35 Tabla 36. Tabla 37. Tabla 38. Tabla 39. Tabla 40. Cuantificación de la extracción de RNA para muestras de las especies en estudio. Frecuencia de pooles positivos a P. salmonis en las zonas muestreadas durante el periodo de estudio. Frecuencia de positividad (absoluta y prevalencia) a P. salmonis en las distintas especies capturadas en las pescas de investigación. Distribución de las especies positivas a P. salmonis, según ACS. Variaciones mensuales en la frecuencia de pooles positivos a P. salmonis (N absoluto de pooles positivos y prevalencia mensual). Distribución de las especies capturadas en los pooles positivos a P. salmonis, según mes. Resultados de Anova Kruskal-Wallis para variables morfométricas de los peces capturados. Resultados de Anova Kruskal-Wallis para variables morfométricas de róbalos capturados. Frecuencia de positividad en pooles de róbalo obtenidos a partir de peces capturados en muestreos de lejanía/proximidad. Estimadores y parámetros del modelo de regresión logística ajustado por zona y especie. Diseño conceptual de la matriz de interacción entre variables del centro de cultivo muestreado y resultados de la pesca de captura. Variables analizadas en el estudio de factores de riesgo y su descripción. Variables retenidas en el modelo final y estadísticos asociados. Odds ratios estimados para distintos valores de FC. Variables analizadas mediante regresión lineal y estadísticos asociados. Probabilidades asignadas por el panel de expertos a las variables de los árboles de escenarios de los modelos de análisis de riesgo de la transmisión de EAR. Categorización de probabilidades de ocurrencia de un evento. Pérdidas estimadas de biomasa (Ton) a nivel de centro de cultivo producto de la transmisión de P. salmonis desde peces silvestres. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en el estuario de Reloncaví. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en Hornopirén. 9 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

12 Tabla 41. Tabla 42. Tabla 43. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en Castro. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en Melinka. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en Aysén. 10 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

13 1. INTRODUCCIÓN El crecimiento explosivo del cultivo de cualquier especie animal involucra un aumento en el riesgo de introducir y/o diseminar enfermedades que afectan directamente la salud de los mismos organismos cultivados e indirectamente a la biota local. En este contexto, el desarrollo a gran escala de la salmonicultura en nuestro país no ha estado exento a dicha realidad y ha debido enfrentar la aparición y diseminación de varias enfermedades que, en algunos casos, han llegado a transformarse en patologías endémicas en los salmones cultivados en el s ur de Chile. Tal es el caso de Piscirickettsiosis y la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPN) (SERNAPESCA). Sumado a lo anterior, en los últimos años se han presentado otras enfermedades de carácter emergente que han afectado directamente el estatus sanitario nacional, entre ellas se encuentran la Vibriosis, Estreptococosis, Furunculosis atípica y durante el último tiempo la Anemia Infecciosa del Salmón, cuyo primer brote fue reportado oficialmente el 25 de julio de 2007 (SERNAPESCA). A nivel internacional, países con sectores acuicultores de importancia han desarrollado numerosas investigaciones a objeto de poder determinar el riesgo de transmisión horizontal de enfermedades entre peces cultivados, peces de cultivo escapados y otros peces silvestres. Al respecto, los resultados demuestran que tanto la trucha café (Salmo trutta) como la trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) pueden actuar como reservorios silvestres del ISAv (Nylund et al. 1995). En cuanto a otras especies no salmonídeas, no ha sido posible demostrar que existan estados infectivos o portadores, así como tampoco el demostrar la existencia de transmisión horizontal entre peces no salmonídeos (en los que se ha detectado la presencia del virus) y peces salmonídeos, a través de estudios de cohabitación. En consecuencia, los resultados anteriores nos indican que a la fecha faltan evidencias científicas que indiquen que otras especies, distintas de las salmonídeas, sean reservorios del agente viral o se vean afectados por la enfermedad (Joint Goverment/Industry Working Group, 2000) no existiendo a la fecha, resultados positivos a la búsqueda del patógeno o signología clínica de la enfermedad (Stagg et al. 1999). Por otro lado los métodos moleculares se han transformado en importantes herramientas en el diagnóstico y el estudio de la diversidad, mantenimiento y diseminación de agentes patógenos, principalmente los de carácter viral (Hungnes et al. 2000). Actualmente se encuentran descritas las técnicas de PCR para todos los patógenos presentes en la lista 1 de enfermedades de alto riesgo (EAR), como a su vez, del virus de la Anemia Infecciosa del Salmón (ISAV), Vibrio ordalii, Piscirickettsia salmonis y Aeromonas salmonicida atípica. Las técnicas inclusive se encuentran adaptadas en algunos casos, para mejorar su sensibilidad de detección en peces silvestres, como es el caso del RT-PCR ISAV descrito por Cunningham & Snow (2000). 11 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

14 En función de lo descrito anteriormente, países del hemisferio norte como Escocia y Noruega han realizado una serie de investigaciones para determinar el rol que pueden jugar los peces silvestres y asilvestrados, como un factor de riesgo en la diseminación de enfermedades tanto a peces de cultivo como entre las poblaciones silvestres/asilvestradas (Raynard et al, 2001; Plarre et al 2005) En este contexto, es necesaria una aproximación a la evaluación del riesgo asociado a la transmisión de EAR entre poblaciones de peces silvestres/asilvestrados/cultivo por medio de técnicas moleculares que permitan la detección, cuantificación y caracterización de estos patógenos en peces silvestres y asilvestrados en las regiones donde existe cultivo intensivo de especies salmonídeas, dirigiendo el estudio a sectores representativos de las regiones de Los Lagos y Aysén. En consideración a lo planteado, el Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) se encuentra ha ejecutado el proyecto Determinación de la presencia de enfermedades de Alto Riesgo en Poblaciones de Peces silvestres, el que contempla el muestreo, análisis y cuantificación relativa de las enfermedades de alto riesgo lista 1 y enfermedades de la lista 2 como Anemia Infecciosa del Salmón, Piscirickettsia salmonis, Aeromonas salmonicida atípica y Vibrio ordalii, por medio de la técnica de PCR (reacción de polimerasa en cadena). El presente documento, da cuenta de las actividades efectuadas y resultados obtenidos a través de la ejecución del proyecto. 12 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

15 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo general Determinar y cuantificar la presencia de agentes causales de enfermedades de alto riesgo en poblaciones de peces silvestres y asilvestrados de las regiones de Los Lagos y Aysén. 2.2 Objetivos específicos Determinar y cuantificar la presencia de Enfermedades de Alto Riesgo (EAR) en peces silvestres y asilvestrados de los sectores en estudio Caracterizar y cuantificar el riesgo de transmisión de EAR entre peces asilvestrados/silvestre/cultivo Establecer zonas en base a los resultados del análisis de riesgo en la transmisión de EAR entre peces asilvestrados/silvestres/cultivo Elaborar una propuesta de vigilancia/monitoreo sanitaria para peces asilvestrados/silvestres e identificar medidas de mitigación. 13 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

16 3. METODOLOGÍA La metodología a utilizada en la presente iniciativa se detalla de acuerdo a los objetivos específicos establecidos: Objetivo 1: Determinar y cuantificar la presencia de Enfermedades de Alto Riesgo (EAR) en peces silvestres y asilvestrados de los sectores en estudio Obtención de muestras Se tomaron muestras por pesca de investigación en mar, previa autorización de ésta por SUBPESCA, en el perímetro de centros de cultivo de peces salmonídeos en tres zonas de interés de la Región de los Lagos: Sector Chiloé Central-Castro, Estuario del Reloncaví y Hornopirén y dos zonas de la Región de Aysén: Fiordo Aysén y Melinka. Las muestras correspondieron a pools de los tejidos riñón, corazón, hígado y bazo de peces salmonídeos asilvestrados (O. mykiss, O. kisutch, S. salar, entre otras), y especies de peces silvestres (Odonthestes regia, Eleginops maclovinus entre otras) las que fueron procesadas en terreno y enviadas al laboratorio manteniendo una temperatura inferior a los 10 C con hielo, tanto en medio de cultivo celular libre de suero como en RNA later. Las carcasas de los peces que se generaron como consecuencia del muestreo se dispusieron en un contenedor estanco cerrado con tapa (Bins) y enviados al vertedero oficial acreditado por SERNAPESCA. Los encargados de los centros de cultivo en torno a los que se desarrolló el muestreo completaron una encuesta especificada en el anexo 1 (Ficha sanitaria), con el objetivo de obtener información sanitaria del centro que pueda influir en la condición sanitaria de los peces asilvestrados/silvestres o viceversa, la información se organizó en una matriz de riesgo a analizar por zona de estudio Análisis de las muestras Se implementaron en dependencias de la División de Investigación en Acuicultura del Instituto de Fomento Pesquero, IFOP, los PCR convencionales de a cuerdo a lo descrito en el Manual de diagnóstico para Organismos acuáticos para las enfermedades de alto riesgo (Resol. SSP Nº ) de la Lista 1 y para Piscirickettsia salmonis, Aeromonas salmonicida atípica y Vibrio ordalii, las cuales fueron estandarizadas para el tipo de muestra y las condiciones del laboratorio. En el caso de Alphavirus e ISA virus se utilizaron las técnicas oficiales definidas por SERNAPESCA y los análisis fueron ejecutados por el laboratorio AQUAINNOVO que se encuentra acreditado en forma oficial por el Servicio Nacional de Pesca 14 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

17 Se analizaron los antecedentes disponibles para estandarizar las metodologías a las distintas especies del estudio, en relación a los genes que puedan ser utilizados como controles de las reacciones de PCR y el número de ciclos descritos como óptimos para el análisis de muestras de peces silvestres. Estas referencias se complementaron con la experiencia de laboratorios de referencia internacionales de la Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE, que han establecido estas técnicas diagnósticas, la experiencia del laboratorio de biotecnología de Organismos Acuáticos de la Universidad Austral y del laboratorio subcontratado AQUAINNOVO, quien participó en el desarrollo del gen reportero universal para la cuantificación relativa de la totalidad de las muestras y especies. Luego de revisadas las metodologías referenciales, se elaboraron y verificaron los protocolos de trabajo procediendo a la adquisición de los insumos específicos para desarrollar las actividades diagnósticas. La implementación de las técnicas de PCR fue efectuada por la bioquímico Verónica Matus de IFOP, bajo la supervisión de la Médico Veterinario y Magíster en Ciencias Veterinarias Paula Miranda y contó permanentemente con la asesoría del Bioquímico y Doctor en Biología celular y molecular de la Universidad Austral, Dr. Alex Romero. El establecimiento de las técnicas a nivel piloto se efectuó con muestras tomadas para este objetivo durante el muestreo base y considerando la escasa captura de salmonideos, se solicitó ejemplares a las empresas productoras de salmonideos que colaboran en otros proyectos de IFOP. Para cada uno de los ensayos se consideró el uso de 3 ejemplares por especie. La extracción de DNA o RNA se realizó mediante la utilización de un kit comercial, utilizando como máximo un equivalente a 5 x 10 6 células de tejido para ser eluído en 150 µl de buffer. Los eluídos fueron analizados mediante espectrofotometría estableciendo la razón de la absorbancia a 260/280 nm de manera de verificar la pureza de la extracción y la concentración de DNA o RNA presente en la muestra por medio de la medición de absorbancia a 260 nm. La integridad del material genético extraído se verificó por medio de electroforesis en red gel al 2% visualizando las bandas en el trans-iluminador. Para establecer la técnica en el laboratorio de Biología Molecular de IFOP, se extrajo y evaluó la pureza, concentración e integridad del DNA y RNA extraídos desde corazón, riñón, hígado y bazo de 3 ejemplares por especie del muestreo base en duplicado. Una vez verificada la metodología de extracción, se estableció la metodología de transcripción reversa (RT) utilizando un kit comercial, la variable para optimizar la reacción fue la concentración inicial de RNA, la que se varió en un rango de 1 a 10 ng, el protocolo óptimo de extracción se estableció verificando los productos de RT por medio de PCR ß-actina de la especie Odonthestes regia. Para la estandarización de las técnicas de PCR, se utilizó como matriz eluídos cuantificados de corazón, riñón, hígado y bazo y pools de los órganos antes mencionados de las especies de peces 15 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

18 en estudio, los que fueron enriquecidos con los agentes blanco en base a los controles positivos adquiridos desde los laboratorios de referencia internacionales o segmentos de DNA/RNA clonados en plásmidos simulando una infección tisular moderada (7ng promedio). Para cada patógeno de interés, se utilizaron partidores específicos y las recomendaciones técnicas descritas previamente en publicaciones científicas y por la OIE. Los PCR fueron estandarizados para obtener los productos del tamaño esperado, para lo cual se realizaron reacciones de PCR en gradientes de temperaturas, con el fin de obtener los parámetros de protocolo óptimos. Se analizó el porcentaje de variación de las técnicas realizando 3 replicas del análisis de una muestra de cada tejido por especie en tres diferentes oportunidades. La reacción de PCR fue analizada de forma semi-cuantitativa en función de la razón entre los productos de PCR para los agentes patógenos y el gen reportero según la especie (Tabla 1), cuantificando las bandas obtenidas al visualizar los productos de PCR en red gel de agarosa al 2% en una imagen por medio del sistema Kodak Digital Science, las bandas correspondientes a los productos de PCR, fueron analizadas por medio del programa Image J. Tabla 1. Genes reporteros para las especies en estudio. Gen reportero Especie Referencia β-actina Pejerrey NCBI B-actina Trucha NCBI B-actina Coho NCBI 28Sr Róbalo NCBI Elf - 1 Salar NCBI Elf - 1 Universal NCBI Una vez establecidos los parámetros se procedió a realizar los análisis de las muestras a distintas diluciones de cdna o DNA de los patógenos específicos (end point dilution analysis), para corroborar lo descrito en las referencias base de nuestros protocolos que establecían 1 ng como el límite de detección de las técnicas, y a su vez, pruebas cruzadas entre patógenos para determinar la sensibilidad y especificidad analítica de la técnica. Se trabajó con series de muestras recolectadas desde el perímetro de los centros de cultivo considerando dos tipos de muestreo: Muestreos de proximidad (perímetro superadas las mallas loberas del centro) y muestreos de lejanía (perímetro superados los 5 Km definidos como área de diseminación ISAv). El n muestreal obtenido se movió en un rango de 278 a 319 peces por zona, n que se ajusta a las directrices OIE, 2006 asumiendo una prevalencia en las poblaciones de estudio de 2% se considera un n muestreal de 150 peces. Las muestras fueron analizadas en pooles de 3 peces considerando lo establecido por la normativa SERNAPESCA para análisis de enfermedades virales. 16 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

19 Las muestras de peces capturados se distribuyeron en conformidad a la proporción de las especies capturadas y la susceptibilidad o estado de portadores indicadas en el Manual de Diagnóstico de Enfermedades Acuáticas de la OIE (OIE, 2006) para cada uno de los agentes en estudio, dando prioridad a las especies salmónidas capturadas. El número de eluídos analizados se movió en un rango de 149 a 178 dependiendo de la zona en estudio. Los eluídos fueron analizados por PCR semicuantitativo específicos para cada patógeno y especie y las reacciones fueron desarrolladas en conjunto con sus respectivos controles negativos y positivos (mix de PCR sin la muestra y con una muestra positiva conocida) a fin de mantener controles internos para discriminar resultados falsos positivos y falsos negativos. Las muestras que entregaron resultados de PCR positivo, fueron procesadas para realizar la secuenciación de los productos de PCR previamente purificados utilizando columnas comerciales de purificación (Qia-quick PCR purification (Quiagen), las secuencias resultantes fueron evaluadas mediante BLAST para confirmar su identidad y en el caso que se presentarán dilucidar variaciones puntuales en las secuencias en el diagnóstico en otras especies no salmonídeas. En la Tabla 2 se presenta el listado de los patógenos analizados para cada muestra junto a las referencias consultadas para la elaboración de los protocolos finales utilizados en el laboratorio de Biología Molecular de IFOP. Tabla 2. Características y métodos de análisis recomendados para agentes patógenos de peces, según Manual de Diagnóstico de Enfermedades Acuáticas de la OIE y otras referencias internacionales. Patógeno VHS (RNA) IHN (RNA) EHN (DNA de doble hebra) Enfermedad Septicemia hemorrágica Viral Necrosis Hematopoyética infecciosa Necrosis Hematopoyética Epizoótica Tº del Agua de brotes (ºC) <14 > Método Diagnóstico RT PCR (Einer Jensen et al, 1995, Journal of Vet Res. 26, ) PCR anidado (Arakawa et al, 1990, DAO 8, ) PCR (Gould et al, DAO 22, ) Muestra elección Riñón Bazo Corazón Riñón anterior bazo Riñón Bazo Hígado Especie susceptible Amplio Rango Salmón del Pacífico Salmón del Atlántico Perca Trucha Arcoiris Galaxias Línea celular de elección BF-2 RTG - 2 EPC BF-2 CHSE-214 BF-2 Laboratorio de Referencia Dinamarca Norteamérica Australia 17 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

20 OMV (DNA) Enfermedad del Oncorhynchus masou <14 PCR (Aso et al, 2001, Bull Fish Sci Hokkaido Univ, 52, ) Riñón Bazo Hígado Salmón Coho Trucha Arcoiris RTG-2 CHSE-214 Japón Alphavirus Enfermedad del páncreas y sleeping disease >12 PCR real Time (Hodneland et al, 2006, Journal of virological methods, 131, ) Riñón Bazo Corazón Salmón del Atlántico Trucha Arcoiris Sin información para Salmón Coho CHSE-214 SHK-1 Escocia Irlanda Noruega ISA Piscirickettsia salmonis Aeromonas salmonicida atípica Anemia infecciosa del salmón <14 SRS PCR Furunculosis atípica PCR Vibrio ordalii Vibriosis PCR PCR real Time (Snow et al, 2006, New Diagnostic Technology vol. 126: ). Riñón Bazo Corazón Riñón Bazo Corazón Riñón Bazo Corazón Riñón Bazo Corazón Salmón del Atlántico Salmón Coho Trucha Arcoiris (portador) Salmón del Atlántico Salmón del Pacífico Trucha Arcoiris Salmón del Atlántico Salmón del Pacífico o Trucha Arcoiris Salmón del Atlántico Salmón del Pacífico Trucha Arcoiris SHK-1 CHSE-214 CHSE-214 No aplica No aplica Canadá Noruega 3.3. Análisis estadístico de los resultados Se utilizó estadística descriptiva utilizando el software STATISTICA v.7.1. StatSoft, Inc. (2005) para analizar los datos y análisis de varianza para identificar diferencias intra e inter grupos. 18 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

21 Objetivo 2: Caracterizar y cuantificar el riesgo de transmisión de EAR entre peces asilvestrados/silvestre/cultivo Organización de la información y elaboración de matriz de interacción de variables en base a estadística multivariada Se validó la información obtenida en las encuestas sanitarias por medio de la definición de rangos máximos y mínimos para cada variable solicitada y confirmación de los datos con los responsables de las áreas de salud de las empresas participantes del proyecto. Los resultados validados se incorporaron a una base de datos en conjunto con los resultados obtenidos en el objetivo 1; a su vez, se consideraron otras variables a modo de caracterizar las poblaciones en estudio como distribución de las especies capturadas en la pesca de investigación, N de brotes en los centros del área, proporción de especies cultivadas, Abundancias de caligus en los centros como posibles vectores, información disponible respecto a la susceptibilidad de las especies capturadas a las EAR consideradas en este estudio, pesos promedio, longitud y presencia o ausencia de posible signología clínica de enfermedad de los peces capturados. Se aplicó a su vez un modelo estadístico de multivarianza, que permitió considerar la relevancia estadística de cada uno de los factores. Dicho modelo en particular, se definió de acuerdo al tipo de variables obtenido y la calidad de los datos. A partir de este análisis, las variables con relevancia estadística fueron incorporadas en una matriz considerando las posibles correlaciones entre las filas y las columnas y la influencia que estas podrían tener en la transmisión entre poblaciones asilvestradas/silvestres/cultivo para cada una de las enfermedades del estudio en base a consulta a un panel de expertos ad hoc multidisciplinario y antecedentes identificados en revisiones bibliográficas Conformación de panel de expertos ad hoc multidisciplinario Se realizó una búsqueda de expertos nacionales e internacionales que tuviesen publicaciones científicas relacionadas a la problemática del estudio, y se les invitó a participar en una consulta que se realizó en forma presencial y vía correo electrónico, se presentó a los expertos árboles de decisión de los distintos escenarios de transmisión de los patógenos y ocurrencia de enfermedad, y a su vez se les aplicó una encuesta previamente diseñada por el equipo técnico de IFOP Diseño y Aplicación de encuesta El diseño contempló la validación y priorización (asignar importancia relativa) de los eventos elementales del flujo de proceso de ocurrencia de la transmisión de EAR entre peces asilvestrados/silvestres/cultivo, validación de las escalas cualitativas de probabilidad y de los impactos, para ser utilizadas en el modelo de análisis de riesgo y el ajuste en la apreciación de riesgo (riesgo aceptable) para su aplicación en el modelo, como a su vez, la estimación de las probabilidades de ocurrencia de ciertos eventos elementales del flujo de transmisión de EAR en 19 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

22 peces asilvestrados/silvestres/cultivo y la estimación de la magnitud de impactos producidos por la transmisión de EAR en peces asilvestrados/silvestres/cultivo Análisis de Riesgo de la transmisión de EAR entre peces asilvestrados/silvestres/cultivo Se diseñó el modelo de análisis de riesgo a implementar en base a la metodología establecida por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE, 2009). Esta etapa corresponde a la conceptualización del modelo en cuanto al objetivo, escenarios y eventos que participan de los procesos involucrados. La información crítica o base requerida para realizar el desarrollo del modelo de análisis de riesgo incluyó entre otras: - Identificación y ubicación espacial de las poblaciones muestreadas. - Registros de monitoreo de parámetros biológicos, productivos y sanitarios de las poblaciones en estudio. Para enriquecer esta data se trabajó con la información derivada de las planillas de tratamientos que entregan los centros de cultivo de especies salmónidas al Servicio Nacional de Pesca para el periodo 2007 a 2009, a modo de caracterizar la condición sanitaria de las zonas en estudio, esta información fue solicitada por el Instituto de Fomento Pesquero al SERNAPESCA por medio de oficio. La estructura del Análisis de Riesgo incluyó las siguientes etapas: I) Identificación del peligro. II) Evaluación de riesgo. III) Gestión de riesgo. IV) Comunicación de riesgo. Etapa I: Identificación del peligro Se identificó posibles eventos y efectos de la presencia de patógenos causales de EAR en función del análisis espacial y temporal de la información proveniente de las distintas fuentes consideradas en el presente estudio. La evaluación de riesgo consideró aquellos patógenos para los cuales se obtuvieron resultados positivos y no se desarrolló para aquellos casos en que no se identificó ningún peligro potencial asociado. 20 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

23 Etapa II: Evaluación del riesgo Se estimó la probabilidad de ocurrencia de los peligros identificados en la etapa I y las consecuencias ligadas al mismo. Lo que se desarrolló en cuatro etapas: a. Evaluación de la difusión b. Evaluación de la exposición c. Evaluación de las consecuencias d. Estimación del riesgo a. Evaluación de la difusión Se describió el o los procesos necesarios para que se produzca la difusión del peligro, en este caso se evaluó la probabilidad de introducción del peligro a una población determinada ya sea asilvestrada/silvestre/cultivo. b. Evaluación de la exposición Se describió el o los procesos necesarios para que los peces asilvestrados/silvestres/cultivo se vean expuestos al o los peligros identificados en la etapa I, y se estimó la probabilidad de advenimiento de esa exposición y de propagación o erradicación de los peligros entre las poblaciones en estudio. c. Evaluación de las consecuencias Se elaboró un flujo general de procesos relacionados al riesgo de transmisión de enfermedades entre peces asilvestrados/silvestres/cultivo, considerando todos los eventos descritos en literatura y la opinión de los expertos que constituyeron el panel ad-hoc. Los eventos fueron clasificados en cuanto a su importancia o correlación a través de la asignación de un valor de probabilidad basado en la información bibliográfica, matriz de interacción de variables en base a estadística multivariada y los resultados de la consulta al panel de expertos ad-hoc. Para aquellos eventos cuya probabilidad de ocurrencia no ha sido determinada a partir de datos disponibles, la evaluación de probabilidades fue de tipo semi-cuantitativa, es decir, se hizo un análisis cuantitativo de probabilidades con una escala cualitativa de comparación la que fue ajustada en base a los resultados de la consulta al panel de expertos ad-hoc (Tabla 3). 21 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

24 Tabla 3. Propuesta de escala semicuantitativa de Probabilidades Escala Semicuantitativa de Probabilidades Escala Escala Cualitativa Cualitativa Mínimo Máximo Nula - 0,0001 Baja 0,0001 0,0010 Media 0,001 0,100 Alta 0,10 0,50 Muy Alta 0,5 1,0 Fuente: Basada en OIE Para estos casos, los análisis o simulación de probabilidades se basaron en el Método Monte Carlo (VOSE, 2004) utilizando las distribuciones de probabilidad que mejor se ajusten al proceso. Utilizando el se calculó el coeficiente de correlación existente entre la variable de salida o output y cada uno de los elementos del modelo de análisis de riesgo. De esta forma fue posible conocer la fuerza y el sentido de la asociación entre los eventos (variables o parámetros) y el output del modelo (probabilidades). Para aquellas consecuencias definidas en el estudio que no cuenten con la información o metodología de respaldo para cuantificar las magnitudes involucradas, se definió escalas cualitativas de magnitud de impacto y probabilidad de ocurrencia (Tabla 4). Tabla 4. Escala semicuantitativa de impactos. Escala Semicuantitativa de Impactos Categoría Nulo Los impactos son insignificantes. Bajo Medio Alto Los impactos son bajos. Los impactos son intermedios. Los impactos son severos. Muy Alto Los impactos son catastróficos. Fuente: Basada en OIE 22 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

25 d. Estimación del riesgo Los resultados cuantitativos de la evaluación de probabilidades de difusión y exposición y además de la evaluación de consecuencias fueron llevados a una escala cualitativa de riesgo, previamente validada por el panel de expertos, la cual entregó el valor final de riesgo (Tabla 5). Probabilidad Final Probabilidad de Difusión N: Probabilidad Final Nula B: Probabilidad Final Baja M: Probabilidad Final Moderada A: Probabilidad Final Alta MA: Probabilidad Final Muy Alta Tabla 5. Matriz de probabilidad final. Probabilidad de Exposición Nula Baja Moderada Alta Muy Alta Muy Alta B M A A MA Alta N M M A A Moderada N B M M M Baja N N B B B Nula N N N N N La ejecución del modelo de análisis de riesgo, se realizó en función de las poblaciones, resultado de los muestreos (pesca de investigación) y análisis de antecedentes derivados de las encuestas sanitarias y la información entregada por el SERNAPESCA. Los modelos se ejecutaron para cada población, zona y región. El resultado de esta etapa permitió clasificar las poblaciones, zonas y regiones según la función de riesgo estimado. La ejecución del modelo y sus resultados están debidamente documentados y sustentados por publicaciones científicas y los resultados del análisis de información en el marco del estudio, todos los cuales también incluyen el análisis de expertos. Etapa III: Gestión de riesgo. En base a los resultados del análisis de riesgo se estableció un ranking de riesgo en base al cual se enmarcaron las zonas y se indicaron los principales factores de riesgo involucrados y sus ponderaciones en el resultado final del análisis. Esta zonificación se contrastó con las áreas de manejo sanitario establecidas por la autoridad (SERNAPESCA) destacando las AMS en las que se detectaron poblaciones asilvestradas/silvestres positivas a EAR. En base a esta información se diseñó un plan de trabajo que apuntando a minimizar el riesgo de transmisión de agentes patógenos causales de EAR a poblaciones en cultivo y a su vez evitar que se produzca un incremento en las cargas de patógenos en la zona identificada, considerando el agente diagnosticado, número de peces positivos, especie positiva, genotipificación y virulencia descrita, como a su vez las especies susceptibles, implicancia sanitaria productiva y el nivel de riesgo que se defina como aceptable. 23 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

26 Etapa IV: Comunicación de riesgo. Los resultados del análisis de riesgo y el plan de trabajo de manejo del riesgo, fueron discutidos con el panel de expertos ad-hoc y están siendo presentados a las autoridades competentes. Objetivo 3: Establecer zonas en base a los resultados del análisis de riesgo en la transmisión de EAR Geo-referenciar los resultados derivados del análisis de riesgo. En base a los resultados del análisis de riesgo se estableció un ranking de riesgo en base al cual se enmarcaron las zonas y se indicaron los principales factores de riesgo involucrados y sus ponderaciones en el resultado final del análisis. Las zonas con resultados positivos a EAR fueron caracterizadas a su vez en función del análisis estadístico de los diagnósticos, la distribución de los positivos en las poblaciones en estudio, genotipificación de los agentes patógenos y virulencia descrita, para lo cual se aplicó el Proceso de Análisis Jerárquico (AHP), desarrollado por Thomas L. Saaty que está diseñado para resolver problemas complejos de criterios múltiples. El resultado obtenido del AHP fue una jerarquización con prioridades que muestran la preferencia global para cada una de las alternativas de decisión. Considerando la información resultante se generaron indicadores de control, que llevó a la creación de un sistema que permitirá monitorear de forma continua las variables que son factores críticos de éxito y las variables que exigen control. La categorización incluyó tres clasificaciones de las zonas, alta, media y baja, de acuerdo al nivel de riesgo en relación a la transmisión de EAR desde peces asilvestrados/silvestres a salmones en cultivo y viceversa. Estas clasificaciones fueron particularizadas por color rojo, amarillo y verde, respectivamente, en un mapa georeferenciado. Objetivo 4: Elaborar una propuesta de vigilancia/monitoreo sanitaria para peces asilvestrados/silvestres e identificar medidas de mitigación Validación de sistema de vigilancia/monitoreo propuesto en el proyecto En base a los resultados obtenidos, se establecieron zonas representativas de cada nivel antes categorizado, en función de los diagnósticos positivos. Por otro lado, los resultados obtenidos durante el desarrollo del presente proyecto en relación a las metodologías de muestreo e 24 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

27 identificación de patógenos fueron utilizadas de base técnica y metodológica para el sistema de monitoreo/vigilancia propuesto Diseño de propuesta de vigilancia/monitoreo En función de lo anterior la propuesta de vigilancia/monitoreo contiene los siguientes ítems validados de los resultados del proyecto: a) Base de datos georreferenciada: esta cuenta con la información del estado de la positividad para cada patógeno, información del centro muestreado desde un punto de vista sanitario (casos clínicos, presentación clínica de la enfermedad), asociado a los datos productivos de las zonas. b) Programa de muestreo apropiado a cada zona definida: se elaboró un programa de muestreos incorporando el análisis de los resultados obtenidos previamente con el fin de establecer una periodicidad de muestreo acorde a cada zona. Es decir, en aquellas zonas donde el riesgo fue mayor, los muestreos deberán tener una mayor frecuencia que en aquellas zonas que no presenten dicha situación Identificación de Puntos críticos por zona En base a los resultados del análisis de riesgo y la identificación de zonas se desarrolló una consulta a expertos ad-hoc, respecto a las medidas de mitigación a considerar en función de los principales puntos críticos Diseño de propuesta de medidas de mitigación La consulta al panel de expertos ad-hoc resultó en un listado de medidas de mitigación e investigaciones propuestas para dilucidar factores desconocidos a la hora de la aplicación del análisis de riesgo. Por otro lado, se realizó una revisión bibliográfica de los manuales de buenas prácticas internacionales y directrices OIE en relación a las medidas de mitigación sugeridas y tomadas en otros países en que existe vigilancia de enfermedades en peces silvestres y transmisión entre las poblaciones silvestres/cultivo. 25 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

28 4. RESULTADOS Objetivo 1: Determinar y cuantificar la presencia de Enfermedades de Alto Riesgo (EAR) en peces silvestres y asilvestrados de los sectores en estudio Obtención de Muestras La resolución de la Pesca de Investigación para la obtención de las especies silvestres en torno a los centros de cultivo fue solicitada a la Subsecretaria de Pesca (SUBPESCA), y autorizada mediante Resolución Exenta Nº Se ejecutaron los muestreos base desde los cuales se obtuvieron 3 ejemplares de Pejerrey y Róbalo para desarrollar la estandarización de las metodologías de PCR de los genes reporteros. A su vez, se solicitó a las empresas productoras de salmónidos que colaboran en otros proyectos con IFOP, el envío al laboratorio de 3 ejemplares de trucha arcoiris, salmón coho y salmón del atlántico para la estandarización de las metodologías para sus genes reporteros, como a su vez de RNA de las especies salmónidas, el que fue aportado por el laboratorio AQUAINNOVO. La pesca de investigación fue ejecutada en todas las Agrupaciones de Concesiones Salmoneras (ACS), consideradas en el proyecto, dentro de una campaña continua de muestreo que se extendió desde el mes de mayo del 2010 hasta mayo del El calendario de muestreos ejecutado se presenta en la Tabla 6. Cabe destacar que en el caso de Melinka y Aysén se concentraron los muestreos en el periodo noviembre 2010 a Mayo 2011 debido a las malas condiciones de tiempo atmosférico presentadas en el periodo anterior, y que no permitieron el desarrollo de la Pesca de Investigación, o que derivaron en la captura de un número de ejemplares muy bajo. En el caso de Estuario de Reloncaví y Castro, se realizó un muestreo adicional para incorporar un mayor número de ejemplares al análisis debido a los resultados positivos a P.salmonis obtenidos en los muestreos previos. Los peces de las especies capturadas, que se detallan con su nombre común y científico en la Tabla 7, fueron medidos, pesados y procesados mediante necropsia y los datos registrados en planilla en el laboratorio de Histología de IFOP. Las muestras individualizadas por órgano (hígado, riñón, corazón y bazo) de peces individuales o pooles de peces en función del tamaño de estos y la especie, fueron depositados en RNA later y MEM + Antibiótico, para ser ingresados a conservación a -80ºC dentro de las 24 hrs. de finalizada la pesca de investigación. 26 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

29 Tabla 6. Muestreos realizados por ACS según fecha. Muestreos ACS 1 - Estuario 10 - Castro 17 - Hornopirén 18 - Melinka 28 - Aysén Muestreo 1 09/07/ /06/ /05/ /07/ /11/2010 Muestreo 2 23/09/ /09/ /06/ /10/ /12/2010 Muestreo 3 23/11/ /11/ /12/ /12/ /01/2011 Muestreo 4 23/12/ /12/ /01/ /01/ /03/2011 Muestreo 5 06/01/ /01/ /04/2011 1/02/ /05/2011 Muestreo 6 26/04/ /03/ Tabla 7. Nombre común y científico de especies capturadas en la Pesca de Investigación. Nombre común Salmón Atlántico Salmón Coho Trucha Arcoiris Pejerrey Róbalo Rollizo Blanquillo Congrio negro Chancharro Merluza común Tollo Brótula Pejegallo Pampanito Trucha fario Cabrilla Lenguado Nombre Científico Salmo salar Oncorhynchus kisutch Oncorhynchus mykiss Odontestes regia Eleginops maclovinus Pinguipes chilensis Prolatilus jugularis Genypterus maculatus Helicolenus langerichi Merluccius gayi gayi Mustelus mento Salilota australis Callorhynchus callorhynchus Stromateus brasiliensis Salmo trutta fario Sebastes capensis Paralichthys microps 27 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

30 Los resultados de la pesca de investigación de las ACS muestreadas se presentan en las tablas 10 a la 15. Tanto los muestreos como el proceso de ingreso de las muestras al laboratorio fue fotografiado, las fotografías se presentan en el Anexo 1. El material biológico de desecho derivado de la pesca de investigación realizada, ha sido eliminado en 3 oportunidades, previa acumulación en el congelador a -20ºC, dispuesto en un contenedor estanco con la sustancia Mort green y transportado al vertedero de la empresa REXIN, vertedero autorizado por el Servicio Nacional de Pesca (SERNAPESCA), en el Anexo 2 se adjuntan los certificados emitidos por el vertedero. En la Tabla 8 se muestra la distribución de las capturas según zona muestreada, observándose que la cantidad de peces muestreados en cada zona fue relativamente homogénea entre zonas. Las zonas que tuvieron la mayor cantidad de individuos muestreados fueron las zonas del Estuario de Reloncaví y Castro, mientras que las que tuvieron la menor cantidad de individuos muestreados fueron las zonas de Aysén, Melinka y Hornopirén. En cuanto a la distribución de los pooles, las zonas con la mayor cantidad de pooles analizados fueron las zonas de Castro y Melinka, en que se dio prioridad a procesar peces en forma individual sobre la formación de pooles, mientras que las que incluyeron menor cantidad de pooles fueron las zonas del Estuario de Reloncaví, Aysén y Hornopirén. En general la totalidad de las zonas muestreadas representa un 20% del total de pooles analizados. Tabla 8. Cantidad de pooles e individuos capturados, según zona muestreada en las pescas de investigación Zona N de pooles % pooles N individuos % individuos Estuario ,72% ,41% Castro ,36% ,28% Hornopirén ,72% ,73% Melinka ,10% ,93% Aysén ,10% ,66% Total general % % La Tabla 9 muestra la distribución de las especies capturadas en las pescas de investigación realizadas. En esta se puede apreciar que de las 19 especies capturadas, las principales corresponden a peces de las especies róbalo y pejerrey, las que representan en conjunto alrededor del 70% de los peces capturados durante el periodo de estudio. En términos de pooles de peces analizados, estas especies representan el 60% de los análisis realizados. En cuanto a los salmónidos capturados (salmón coho, salmón del Atlántico, trucha arcoiris y trucha fario), la participación de estos fue baja, representando en conjunto el 2,6% de los peces capturados, y el 3,9% de los pooles analizados. 28 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

31 Tabla 9. Cantidad de individuos capturados y conformación de pooles según especie Especie N Pooles % pooles N individuos % individuos Róbalo ,36% ,21% Pejerrey ,56% ,46% Chancharro 53 6,66% 91 6,11% Rollizo 67 8,42% 79 5,30% Cabrilla 57 7,16% 78 5,23% Blanquillo 25 3,14% 39 2,62% Merluza común 33 4,15% 35 2,35% Brótula 9 1,13% 19 1,28% Pampanito 5 0,63% 19 1,28% Tollo 14 1,76% 18 1,21% Salmón Coho 13 1,63% 17 1,14% Bonito 5 0,63% 15 1,01% Trucha Fario 7 0,88% 11 0,74% Lenguado 9 1,13% 9 0,60% Trucha arcoíris 9 1,13% 9 0,60% Congrio 5 0,63% 5 0,34% Jurel 5 0,63% 5 0,34% Salmón del Atlántico 2 0,25% 2 0,13% Pejegallo 1 0,13% 1 0,07% Total general % % En cuanto a la distribución de las especies dentro de cada zona, en el Estuario de Reloncaví (Tabla 10), se capturaron 11 especies de peces, de las cuales la principal fue el róbalo, representando el 54,55% de los peces capturados en esta zona y el 48,32% de los análisis realizados en esta zona. Los salmónidos capturados en esta ACS corresponden a las especies salmón coho y trucha arcoiris, representando entre ambos alrededor del 3% de los peces capturados y del 4% de los análisis realizados. 29 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

32 Tabla 10. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona del Estuario de Reloncaví Especie N pooles % pooles N individuos % individuos Róbalo 72 48,32% ,55% Chancharro 30 20,13% 60 18,81% Cabrilla 16 10,74% 35 10,97% Blanquillo 10 6,71% 20 6,27% Pejerrey 4 2,68% 9 2,82% Rollizo 7 4,70% 7 2,19% Salmón Coho 2 1,34% 6 1,88% Trucha arcoiris 4 2,68% 4 1,25% Lenguado 2 1,34% 2 0,63% Congrio 1 0,67% 1 0,31% Pejegallo 1 0,67% 1 0,31% Total general % % En el caso de la zona de Castro (Tabla 11), se capturaron 10 especies de peces, de las cuales las principales fueron pejerrey y róbalo, representando alrededor del 74% de las capturas de la zona y el 63% de los análisis realizados para esta ACS. En relación a los salmónidos capturados, correspondieron a ejemplares de las especies salmón del Atlántico y trucha arcoiris, representando entre ambos el 1% de los peces capturados y del 2% de los análisis ejecutados. Tabla 11. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona de Castro Especie N pooles % pooles N individuos % individuos Pejerrey 46 25,84% ,22% Róbalo 66 37,08% ,91% Cabrilla 31 17,42% 33 10,41% Pampanito 5 2,81% 19 5,99% Merluza común 8 4,49% 8 2,52% Lenguado 7 3,93% 7 2,21% Rollizo 6 3,37% 6 1,89% Jurel 5 2,81% 5 1,58% Salmón del Atlántico 2 1,12% 2 0,63% Trucha arcoiris 2 1,12% 2 0,63% Total general % % 30 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

33 En la zona de Hornopirén (Tabla 12) se capturaron 8 especies de peces, de las cuales la principal fue el pejerrey, representando el 40% de los peces capturados en la zona y el 25% de los análisis de laboratorio. La única especie salmonídea capturada en esta zona fue un ejemplar de trucha arcoiris que representa el 0,64% de los resultados de laboratorio para esta ACS. Tabla 12. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona de Hornopirén Especie N pooles % pooles N individuos %individuos Pejerrey 39 24,84% ,80% Rollizo 51 32,48% 63 21,43% Róbalo 26 16,56% 59 20,07% Blanquillo 15 9,55% 19 6,46% Bonito 5 3,18% 15 5,10% Chancharro 13 8,28% 13 4,42% Cabrilla 7 4,46% 7 2,38% Trucha arcoiris 1 0,64% 1 0,34% Total general % % En la zona de Melinka (Tabla 13) se capturaron cuatro especies de peces: róbalo, chancharro, brótula y cabrilla, representando la primera el 95% de los peces capturados en la zona, y el 94% de los análisis ejecutados. Cabe destacar que no se capturaron ejemplares de especies salmonídeas. Tabla 13. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona de Melinka Especie N pooles % pooles N individuos % individuos Róbalo ,38% ,39% Chancharro 4 2,50% 8 2,84% Brótula 3 1,88% 3 1,06% Cabrilla 2 1,25% 2 0,71% Total general % % En la zona de Aysén (Tabla 14) se capturaron 12 especies de peces siendo la zona con mayor diversidad de ejemplares de las cinco zonas en estudio, de las cuales las principales fueron róbalo y pejerrey, representando en conjunto el 63% de los ejemplares capturados y el 48% de los análisis de laboratorio debido a la conformación de pooles, por su parte la merluza común es relevante en esta ACS representando el 10% de los ejemplares capturados y un 17% de los análisis de laboratorio. En esta área se capturaron ejemplares de Salmón Coho y Trucha Fario los que en conjunto representaron alrededor del 9% de los peces capturados en la zona, y del 13% de las muestras ingresadas al laboratorio para el área. 31 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

34 Tabla 14. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona de Aysén Especie N pooles % pooles N individuos % individuos Róbalo 62 40,79% ,80% Pejerrey 11 7,24% 31 11,15% Merluza común 25 16,45% 27 9,71% Tollo 14 9,21% 18 6,47% Brótula 6 3,95% 16 5,76% Salmón Coho 11 7,24% 11 3,96% Trucha Fario 7 4,61% 11 3,96% Chancharro 6 3,95% 10 3,60% Congrio 4 2,63% 4 1,44% Rollizo 3 1,97% 3 1,08% Trucha arcoiris 2 1,32% 2 0,72% Cabrilla 1 0,66% 1 0,36% Total general % % La temporalidad de las capturas se presenta en la Tabla 15, observándose que la mayor cantidad de peces capturados se produjo entre los meses de diciembre del 2010 y enero del 2011 la que coincide con el mayor número de esfuerzos de Pesca. El coeficiente de correlación entre la cantidad de peces capturados y los esfuerzos de pesca realizados en cada mes fue de 0,89, lo que indicaría que la cantidad de peces capturados estaría asociada principalmente al Nº de salidas de pesca realizadas durante el periodo de estudio, lo anterior se relaciona necesariamente con las características del periodo (Diciembre Enero), que por ser época de verano, las condiciones del tiempo favorecieron la ejecución de las actividades de muestreo, a diferencia de los meses anteriores, en que se debió postergar actividades programadas debido a puertos cerrados. Esta asociación entre el número de pescas de investigación y la cantidad de peces capturados se comprueba para cada una de las áreas bajo estudio, y se presenta gráficamente en la Figura INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

35 Tabla 15. Cantidad de peces capturados y pescas realizadas durante el periodo de estudio Año Mes N peces N pescas May 70 1 Jun Jul Sep 72 2 Oct 34 3 Nov Dic Ene Feb Mar 86 3 Abr 91 2 May 27 2 Figura 1. Variaciones temporales en la cantidad de peces capturados y de muestreos durante el periodo mayo 2010 mayo 2011 Desde el punto de vista de las variaciones temporales en las capturas de cada especie, en el caso del róbalo las mayores capturas se produjeron entre los meses de noviembre de 2010 y febrero de 2011, presentándose los mayores valores en los meses de diciembre y enero, con más de 210 individuos capturados de esta especie en cada mes. Para el resto de los meses las capturas oscilaron entre 3 y 39 peces (Figura 2). 33 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

36 Figura 2. Variación temporal en la captura de róbalo durante el periodo de estudio Para el pejerrey, la mayor cantidad de capturas se produjo en los meses de mayo, noviembre y diciembre de 2010 y en enero de 2011, con una cantidad de entre 50 y 60 peces capturados cada mes. Durante el resto de los meses las capturas no superaron los 21 ejemplares, existiendo 5 meses (julio, septiembre,octubre de 2010, y febrero y mayo de 2011) en los que no se produjeron capturas de esta especie (Figura 3). Figura 3. Variación temporal en la captura de pejerrey durante el periodo de estudio El pez denominado chancharro, presentó sus mayores capturas durante los meses de noviembre y diciembre de 2010, y en enero y abril de 2011, con valores mensuales de entre 18 y 24 ejemplares de esta especie. Durante el resto de los meses las capturas oscilaron entre 2 y 5 peces, no registrándose capturas en mayo y junio de 2010 y en febrero y mayo de 2011 (Figura 4). 34 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

37 Figura 4. Variación temporal en la captura de chancharro durante el periodo de estudio En el caso del rollizo, las mayores capturas se produjeron en los meses de enero y abril de 2011, donde se capturaron 18 y 35 ejemplares de esta especie, respectivamente. Durante el resto de los meses las capturas oscilaron entre 1 y 8 ejemplares, no produciéndose capturas en los meses de julio y octubre de 2010, y en febrero de 2011 (Figura 5). Figura 5. Variación temporal en la captura de rollizo durante el periodo de estudio La cabrilla presentó sus mayores niveles de captura durante el mes de enero de 2011, con 34 ejemplares capturados, presentando valores de entre 1 y 12 ejemplares capturados durante el resto de los meses. En los meses de mayo de 2010, febrero y mayo de 2011 no se produjeron capturas de esta especie (Figura 6). 35 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

38 Figura 6. Variación temporal en la captura de cabrilla durante el periodo de estudio En el caso del blanquillo, sólo se produjeron capturas hasta noviembre de 2010, no capturándose peces durante los muestreos del año La mayor cantidad de peces capturados se produjo en los meses de junio y septiembre, con 16 y 15 individuos capturados, respectivamente (Figura 7). Figura 7. Variación temporal en la captura de blanquillo durante el periodo de estudio Las mayores capturas de merluza común se produjeron en los meses de junio y diciembre de 2010, y en enero y marzo de 2011, con valores que oscilaron entre 5 y 14 peces capturados. En septiembre y noviembre de 2010, se capturó sólo un pez. Durante el resto de los meses no se produjeron capturas de esta especie (Figura 8). 36 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

39 Figura 8. Variación temporal en la captura de merluza común durante el periodo de estudio Para el resto de las especies silvestres, las capturas fueron más esporádicas y de menor cuantía, tendiendo a concentrarse también en el periodo noviembre 2010 enero 2011 (Tabla 16). Tabla 16. Variación temporal en la captura de especies silvestres durante el periodo de estudio Año Mes Especie Bonito Brótula Congrio Jurel Lenguado Pampanito Pejegallo Tollo Total 2010 May Jun Jul Sep Oct Nov Dic Ene Feb Mar Abr May Total En el caso de los salmónidos las capturas también fueron esporádicas y escasas, siendo las especies con mayor cantidad de capturas el salmón coho, la trucha fario y la trucha arcoiris, capturándose sólo dos ejemplares de salmón del Atlántico ambos asociados a la ACS 10 (Tabla 17). 37 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

40 Tabla 17. Variación temporal en la captura de salmónidos durante el periodo de estudio Año Mes Especie Salmón Coho Salmón del Atlántico Trucha arcoiris Trucha Fario Total May Jun Jul Sep Oct Nov Dic Ene Feb Mar Abr May Total Desde el punto de vista de las características morfométricas de las especies capturadas, la Tabla 18 muestra los valores promedio de longitud, peso de estas, observándose que las especies con mayores longitudes y pesos fueron el salmón del Atlántico, tollo, merluza común, y congrio, mientras que las especies con los valores medios más bajos de estas variables fueron el lenguado, pejerrey, trucha fario, pampanito y brótula. Cabe destacar que de los dos salmones del Atlántico capturados, uno de ellos presentaba un factor de condición (Fulton 1902) de 1,25, indicando una buena condición fisiológica, sin embargo el otro ejemplar capturado presentó un FC de 0,11 reflejo de una mala condición corporal. 38 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

41 Tabla 18. Valores promedio de longitud y peso de las especies capturadas en las pescas de investigación Especie Longitud promedio Peso promedio Blanquillo 26,88 259,30 Bonito 40,20 600,00 Brótula 25,53 245,66 Cabrilla 27,76 272,97 Chancharro 26,21 283,69 Congrio 54, ,40 Jurel 47, ,00 Lenguado 21,78 94,26 Merluza común 58, ,80 Pampanito 23,89 149,11 Pejegallo 69,00 600,00 Pejerrey 22,77 89,26 Róbalo 28,97 297,73 Rollizo 41,23 733,54 Salmón Coho 31,06 350,01 Salmón del Atlántico 65, ,55 Tollo 59, ,06 Trucha arcoíris 43,11 851,44 Trucha Fario 23,73 176,91 Total general 29,48 337,53 En relación a los muestreos realizados en lejanía y proximidad del centro de cultivo, se observa que en general, los ejemplares capturados desde la proximidad del centro de cultivo, son de menor tamaño que los capturados en la lejanía. Par las tres especies de salmónidos capturados se observa que la Trucha Fario y el Salmón Coho son los que presentan mejor factor de condición con valores de 1,23 y 1,32 respectivamente, la trucha arcoiris presenta factores de condición de 0,95 promedio y los salmones del Atlántico de 0,5, de lo anterior se infiere que las especies que presentaron mejor condición corporal fueron el Salmón Coho y la Trucha Fario, seguido por la trucha arcoiris. 39 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

42 Tabla 19. Valores promedio de longitud y peso de las especies capturadas en las pescas de investigación, según tipo de muestreo (lejanía o proximidad). Especie Variable Lejanía Proximidad Total general FC Lejanía FC Proximidad Blanquillo Longitud promedio 28,44 24,4 26,88 Peso promedio 319,77 162,55 259,3 1,39 1,12 Bonito Longitud promedio 39,67 40,33 40,2 Peso promedio ,96 0,91 Brótula Longitud promedio 23, ,53 Peso promedio 168, ,66 1,34 0,99 Cabrilla Longitud promedio 26,7 27,92 27,76 Peso promedio 255,35 275,6 272,97 1,34 1,27 Chancharro Longitud promedio 25,54 26,44 26,21 Peso promedio 324,66 269,83 283,69 1,95 1,46 Congrio Longitud promedio 55,33 53,5 54,6 Peso promedio ,4 0,88 0,52 Jurel Longitud promedio - 47,8 47,8 Peso promedio s/i 0,94 Lenguado Longitud promedio 19 22,13 21,78 Peso promedio 47,62 100,09 94,26 0,69 0,92 Merluza común Longitud promedio 68 46,8 58,91 Peso promedio 2701,8 1040, ,8 0,86 1,02 Pampanito Longitud promedio - 23,89 23,89 Peso promedio - 149,11 149,11 s/i 1,09 Pejegallo Longitud promedio Peso promedio s/i 0,18 Pejerrey Longitud promedio 22,73 22,82 22,77 Peso promedio 88,97 89,65 89,26 0,76 0,75 Róbalo Longitud promedio 27,29 34,25 28,97 Peso promedio 267,96 391,14 297,73 1,32 0,97 Rollizo Longitud promedio 38,29 41,9 41,23 Peso promedio 762,71 726,95 733,54 1,36 0,99 Salmón Coho Longitud promedio 21, ,06 Peso promedio 116,44 513,5 350,01 1,23 0,94 Salmón del Atlántico Longitud promedio 65,14-65,14 Peso promedio 1369, ,55 0,50 s/i Tollo Longitud promedio ,22 Peso promedio 1198, ,06 0,58 0,19 Trucha arcoiris Longitud promedio 26,25 47,93 43,11 Peso promedio ,44 0,96 0,95 Trucha Fario Longitud promedio 23,73-23,73 Peso promedio 176,91-176,91 1,32 s/i 40 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

43 4.2. Análisis de las muestras Solicitud e ingreso de controles positivos EAR lista 1 Para contar con los respectivos controles positivos para los patógenos presentes en la lista 1 de Enfermedades de Alto Riesgo, se contactó a los laboratorios de Referencia señalados en el Manual de Test Diagnósticos para Organismos Acuáticos OIE, Para cada agente patógeno se recopiló la información necesaria para el desarrollo de los protocolos de PCR y en función de los partidores descritos y la región a amplificar, se solicitó el material más apropiado a utilizar como control positivo, lo que fue complementado con las recomendaciones de los laboratorios de referencia respectivos. Los controles fueron enviados desde el país de origen, bajo las condiciones apropiadas de transporte según el producto, y recibidos en el laboratorio de Biología Molecular del IFOP, donde fueron conservados bajo las condiciones indicadas en los certificados emitidos por los laboratorios de origen. Los certificados de los materiales solicitados se encuentran en el Anexo 3. En el caso de Vibrio ordalii y Aeromonas salmonicida atípica se utilizaron cepas de campo tipificadas por el laboratorio de Biotecnología y Patología de organismos acuáticos de la Universidad Austral de Chile. Para P.salmonis se utilizó un aislado de campo adquirido en el laboratorio ADL Diagnostic Ltda. La mantención de los controles positivos se realizó mediante la ejecución de PCR convencional anidado, cuantificación de los productos de PCR específicos corroborados mediante electroforesis en gel de agarosa 2% teñido con Syber saf, y conservación de alícuotas de los productos de PCR a - 80ºC Revisión Bibliográfica y elaboración de protocolos Se desarrolló una revisión de las publicaciones en relación a las técnicas de PCR descritas para las especies en estudio, considerando el requerimiento de un gen reportero para hacer la evaluación semicuantitativa de los resultados. En función de esta revisión se determinó que existían partidores descritos para las especies Onchorynchus mykiss y Onchorynchus Kysutsh, Odontesthes regia y Salmo salar, sin embargo no la fecha de la consulta, publicaciones relacionadas con la descripción de técnicas de PCR para genes reporteros en las otras especies derivadas de la pesca de investigación. Debido a lo anteriormente expuesto, debió realizarse una búsqueda de las secuencias disponibles en el NCBI (National Center for Biotechnology Information), disponible en para distintas especies de peces y a partir de esta información, diseñar partidores para especies en particular. A su vez, se trabajó en implementar partidores universales a partir de secuencias altamente conservadas entre las especies capturadas, como son los genes ribosomales. 41 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

44 Búsqueda de un posible gen reportero y diseño de partidores para la especie Eleginops maclovinus y gen reportero Universal. A. Búsqueda de un posible gen reportero: Se realizó una revisión bibliográfica para identificar posibles genes reporteros utilizados en otras especies de peces para tener alternativas en base a las secuencias disponibles para la especie Eleginops maclovinus. De los genes identificados como genes reporteros más comúnmente utilizados en peces destacan el factor de elongación 1 (ELF- 1), β-actina, 18 S y 28 S ribosomal entre otros. La revisión de las secuencias de nucleótidos disponibles se llevó a cabo utilizando el sistema NCBI (National Center for Biotechnology Information), disponible en La secuencia disponible registrada en la base de datos fue la secuencia del 28 S ribosomal, la secuencia disponible tiene un tamaño de 232 pb. Se realizó a su vez un alineamiento utilizando el sistema BLAST de libre uso para observar la región variable entre las especies de peces disponibles en la base de datos, y a partir de ésta, diseñar los partidores. B. Diseño de Partidores: Los partidores fueron diseñados considerando una composición de 60% de Guanina Citosina, que no finalice ni comience con A-T y que minimice la formación de estructuras secundarias dentro del partidor utilizando el programa de diseño de partidores de libre acceso disponible en IDTDNA.com. Como resultado se obtuvieron 4 sets de partidores que cumplen las condiciones indicadas los que se evaluaron utilizando igual protocolo de PCR que el utilizado para β-actina de Odontesthes Búsqueda de un posible gen reportero de carácter universal y diseño de partidores para la totalidad de especies en estudio incluyendo las acompañantes. A. Búsqueda de un posible gen reportero Se realizó una revisión bibliográfica para identificar posibles genes reporteros utilizados en otras especies de peces para tener posibles alternativas en base a las secuencias disponibles para las especies acompañantes.existían a De los genes identificados como genes reporteros más comúnmente utilizados en peces, destacan el factor de elongación 1 (ELF- 1), β-actina, 18 S y 28 S ribosomal entre otros. 42 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

45 La revisión de las secuencias de nucleótidos disponibles se llevó a cabo utilizando el sistema NCBI (National Center for Biotechnology Information), disponible en La mayor cantidad de secuencias disponibles registradas en la base de datos para las especies blanco fue la secuencia del 18 S ribosomal. Se realizó un alineamiento utilizando el sistema BLAST de libre uso, para observar la región conservada entre las especies de peces disponibles en la base de datos y a partir de esta diseñar los partidores. B. Diseño de Partidores Los partidores fueron diseñados considerando una composición de 60% de Guanina Citosina, que no finalice ni comience con A-T y que minimice la formación de estructuras secundarias dentro del partidor utilizando el programa de diseño de partidores de libre acceso disponible en IDTDNA.com. Como resultado se obtuvo un set de partidores que cumplen las condiciones indicadas los que fueron evaluados por AQUAINNOVO en PCR convencional y Tiempo real. C. Resultados de PCR convencional y tiempo real para el gen reportero de las distintas especies en estudio. Dado que no fue posible obtener una señal para todas las muestras con los partidores y sondas diseñados para el factor de elongación de Salmón del Atlántico (dato no mostrado), se utilizó el gen 18Sr para trabajar como control de calidad de RNA para las muestras de este estudio. Dado que es un gen con una función constitutiva y de carácter altamente conservado, podría esperarse obtener una señal de amplificación para la totalidad de las especies analizadas en este estudio. El ensayo se llevo a cabo utilizando el kit Brillant II SybrGreen qrt-pcr Master Mix (Stratagen) con los partidores 18S1s 5 -GTTCCTTTGATCGCTCCAACG-3 y 18S1r 5 - GCCGGGGCAACCGAGATTGGC-3 los cuales primariamente fueron probados en salmones, donde producen un fragmento de amplificación de 137 pb, para las demás especies se esperaba obtener un producto de amplificación similar. Se presentan como resultados la curva de melting utilizando RT-PCR tiempo real (Fig. 9) y las corridas electroforéticas de los mismos para las distintas especies ingresadas en el Lote Nº 1 de muestras para las 5 ACS en estudio. Se puede apreciar que en la curva de melting se observan 2 pick, el primero corresponde a un producto inespecífico (dímeros de partidores) y el segundo corresponde al producto de amplificación de 18Sr. Todas las muestras presentan el segundo pick, variando en altura y forma, lo que se puede deber a una pérdida de complementariedad entre los partidores y a características propias de la secuencia de la muestra consecuencia de la variabilidad entre las diversas especies. La corrida 43 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

46 electroforética (Fig. 10 y Fig. 11) se correlaciona con lo observado en el perfil de fluorescencia utilizando PCR tiempo real, ya que las muestras que se observan a la electroforesis intensas presentan en la curva de melting un segundo pick alto y ausencia del primer pick. B A Figura 9. Perfil de Fluorescencia de productos de PCR tiempo real, todas las especies. A y B indican los 2 comportamientos de amplificación observados Sr Figura 10. Electroforesis productos de PCR convencional 18Sr. Carril 1 y 2: Pejegallo; Carril 3 y 4: Merluza; Carril 5 y 6: Lenguado; Carril 7 y 8: Trucha Fario; Carril 9 y 10: Congrio; Carril 11: Tollo; Carril 12: Control +. Las bandas corresponden a un producto de aproximadamente 200 pb Sr Figura 11. Electroforesis productos de PCR convencional 18Sr. Carril 1: Pejerrey; Carril 2 y 3: Róbalo; Carril 4 y 5: Trucha arcoiris; Carril 6 y 7: Blanquillo; Carril 8 y 9: Cabrilla; Carril 10 y 11: Chancharro; Carril 12: Brótula; Carril 14: Rollizo. Las bandas corresponden a un producto de 44 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

47 aproximadamente 200 pb Elaboración, implementación y establecimiento de Protocolos de PCR y extracción de Ácidos Nucleicos. En base a la revisión realizada y los experimentos ejecutados con los partidores diseñados, se elaboraron los protocolos para los agentes patógenos en estudio y los genes reporteros para las especies derivadas de la pesca de investigación. La implementación de las técnicas de PCR se efectuó en dos pasos, el primero, desarrollado en el Laboratorio de Biotecnología y Patología de organismos acuáticos de la Universidad Austral (UACH), por personal altamente capacitado de IFOP, con la asesoría del Dr. Alex Romero, Jefe del Laboratorio, y el segundo, consistente en el montaje y estandarización de las técnicas una vez verificados los protocolos, en el Laboratorio de Biología Molecular de IFOP (LBM IFOP). Lo anterior se llevó a cabo en dos pasantías llevadas a cabo durante el mes de Mayo del 2010 y el mes de Septiembre del 2010, en las que se implementó el protocolo para Piscirickettsia salmonis, OMV y ß-actina Pejerrey. La segunda etapa ejecutada durante el mes de Septiembre consistió en el montaje de las técnicas restantes, exceptuando el 18Sr que fue montado durante el mes de diciembre en AQUAINNOVO. En la Tabla 20 se señalan los partidores seleccionados derivados de la revisión bibliográfica y los diseñados por IFOP, corregidos en función de los resultados obtenidos en la implementación. Los protocolos en detalle se encuentran en el Anexo INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

48 Tabla 20. Partidores seleccionados identificación de secuencias, gen pesquisado y tamaño del producto amplificado. Identificación Primers IHNV F IHNV R VHS F VHS R EHNV F EHNV R Eubacteria 16S F Eubacteria 16S R B-actina Salmon coho/trucha F B-actina Salmon coho/trucha R 28S róbalo 1 F Secuencia 5 ' 3' TTCGCAGATCCCAACAACAA GCGCACGTGCCTTGGCT ATGGAAGGAGGAATTCGTGTGAAGCG GCGGTGAAGTGCTGCAGTTCCC CGCAGTCAAGGCCTTGATGT AAAGACCCGTTTTGCAGCAGCAAC ACGGATACCTTGTTACGAGTT CGCACGGAGCACTTTGTCCA ATGGAAGATGAAATCGCC TGCCAGATCTTCTCCATG AGGATCTCCTCGTGGGACCTCTC 28S róbalo 1 R ACGGAGCACTTTGTCCACGG 28S róbalo 2 F AGGATCTCCTCGTGGGACCTCTC 28S róbalo 2 R CGCACGGAGCACTTTGTCCA OMV F GTACCGAAACTCCCGAGTC OMV R AACTTGAACTACTCCGGGG B-Actina pejerrey F CGGAACCGCTCATTGCC B-Actina pejerrey R ACCCACACTGTGCCCATCTA P. Salmonis F CTAGGAGATGAGCCCGCGTTG P. Salmonis R GCTACACCTGCGAAACCACTT Aeromonas salmonicida 1 F CGTTGGATATGGCTCTTCCT Aeromonas salmonicida 1 R CTCAAAACGGCTGCGTACCA Aeromonas salmonicida 2 F GGCTGATCTCTTCATCCTCACCC Aeromonas salmonicida 2 R CAGAGTGAAATCTACCAGCGGTGC 18S Universal F GTT CCT TTG ATC GCT CCA ACG 18S Universal R GCC GGG GCA ACC GAG ATT GGC ELF-1 Salmón del Atlántico F CCCCTCCAGGAGGTTTACAAA ELF-1 Salmón del Atlántico R CACACGGCCCACAGGTACA Gen pesquizado Nucleocápside Nucleocápside Cápside viral 16S Beta-actina 28S 28S Genómico Beta-actina PS AS AS 18S Elf-1 Tamaño producto (pb) INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

49 4.4. Preparación de Controles Positivos. A. Dilución y cuantificación de controles positivos OMV: Los controles positivos fueron enviados por el laboratorio de referencia dirigido por el Dr M. Yoshimizu del departamento de Microbiología de la Universidad de Hokkaido en Japón. Los plásmidos fueron resuspendidos agregando 2 volúmenes de agua libre de nucleasas de 100 microlitros cada uno, y posteriormente centrifugados a g por 2 minutos a 4ºC. El sobrenadante se testeó por medición de la absorbancia a 260 nm en espectrofotómetro, para determinar la concentración de DNA presente en la muestra, utilizando la fórmula: Abs x 30µg/ml x Factor de dilución = Concentración de DNA. Se utilizaron 4 µl de sobrenadante en 1ml de agua para hacer la medición (Abs = Absorbancia a 260 nm; Factor de dilución = 250) La concentración derivada de la resuspensión del plásmido fue de 5 µg/µl. Para visualizar la integridad del material resuspendido se evalúo la muestra por medio de electroforesis en gel de agarosa al 2% teñido con Gel red por 15 minutos a 100 Volt, el resultado se observa en la Figura 12. Figura 12. Electroforesis de los controles positivos OMV. St: Estándar de Peso Molecular de 100pb, la flecha blanca indica la banda de 500 pb; 1 y 2: Plásmido de 500 pb conteniendo el inserto de OMV. 47 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

50 A. Dilución y cuantificación de controles positivos EHNV Los controles positivos para el virus de la Necrosis Hematopoyética Epizoótica, EHNV, fueron enviados por el laboratorio de referencia dirigido por el Dr. Whittington, en formato de DNA purificado liofilizado, el que debió ser resuspendido en 50µl de agua libre de nucleasas, la concentración de la resuspensión fue verificada mediante medición en espectrofotómetro EPOCH, a una longitud de onda de 260 nm, para determinar la concentración de DNA presente en la muestra, utilizando la fórmula: Abs x 30µg/ml x Factor de dilución = Concentración de DNA. La concentración derivada del control positivo fue de 39,83 ng/µl, las bandas que muestran la integridad de la muestra se presentan en la Figura EHNV Figura 13. Electroforesis de los controles positivos EHNV. La flecha indica la banda correspondiente al control positivo de 580 pb. B. Dilución y cuantificación de controles positivos IHNV Los controles positivos para el virus de la Necrosis Hematopoyética Infecciosa, IHNV, fueron enviados por el laboratorio de referencia dirigido por el Dr. Winton en formato de plásmido, con el inserto correspondiente al fragmento de cdna del gen de la nucleocapside viral del IHNV, suspendido en 200 µl de agua libre de nucleasas. La concentración fue verificada mediante medición en espectrofotómetro EPOCH a una longitud de onda de 260 nm para determinar la concentración de DNA presente en la muestra, utilizando la fórmula: Abs x 30µg/ml x Factor de dilución = Concentración de DNA La concentración derivada del control positivo fue de 0,49 ng/µl, las bandas que muestran la integridad de las muestras se presentan en la Figura IHNV Figura 14. Electroforesis de los controles positivos IHNV, la flecha indica la banda correspondiente al control positivo de 323 pb. 48 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

51 C. Dilución y cuantificación de controles positivos VHS Los controles positivos para el virus de la Septicemia Hemorrágica Viral, VHS, fueron enviados por el laboratorio de referencia dirigido por el Dr. Olesen en formato de virus inactivado diluido 1:6 en RNA Saber. El RNA viral fue extraído utilizando un Kit de extracción de RNA y la concentración del eluído fue verificada mediante medición en espectrofotómetro EPOCH a una longitud de onda de 260 nm para determinar la concentración de RNA presente en la muestra, utilizando la fórmula: Abs x 40µg/ml x Factor de dilución = Concentración de DNA. La concentración derivada del control positivo fue de 1129,251 ng/µl, las bandas que muestran la integridad de las muestras se presentan en la Figura Figura 15. Electroforesis de los controles positivos VHS, la flecha indica la banda correspondiente al control positivo de 504 pb. VHS D. Dilución y cuantificación de controles positivos Vibrio ordalii Los controles positivos fueron enviados por el laboratorio de Biotecnología de organismos acuáticos de la Universidad Austral de Chile, dirigido por el Dr. Romero, en formato de DNA. La concentración fue verificada mediante medición en espectrofotómetro EPOCH a una longitud de onda de 260 nm para determinar la concentración de DNA presente en la muestra, utilizando la fórmula: Abs x 30µg/ml x Factor de dilución = Concentración de DNA. La concentración derivada del control positivo fue de integridad de la muestra se presentan en la Figura ,4 ng/µl, las bandas que muestran la V. ordalii Figura 16. Electroforesis de los controles positivos V. ordalii, la flecha indica la banda correspondiente al control positivo de 470 pb. 49 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

52 E. Dilución y cuantificación de controles positivos Aeromonas salmonicida atípica Los controles positivos de este patógeno fueron enviados por el Biotecnología de organismos acuáticos de la Universidad Austral de Chile dirigido por el Dr. Romero, en formato de DNA. La concentración fue verificada mediante medición en espectrofotómetro EPOCH a una longitud de onda de 260 nm para determinar la concentración de DNA presente en la muestra, utilizando la fórmula: Abs x 30µg/ml x Factor de dilución = Concentración de DNA. La concentración derivada del control positivo fue de 2,042 ng/µl, las bandas que muestran la integridad de la muestra se presentan en la Figura A. salmonicida Figura 17. Electroforesis de los controles positivos A. salmonicida, la flecha indica la banda correspondiente al control positivo de 421 pb. F. Dilución y cuantificación de controles positivos P. salmonis: Los controles positivos fueron facilitados por el laboratorio de Biología Molecular de peces de la Universidad Austral de Chile, dirigido por el Dr. Jaime Figueroa. El control consistió en DNA de P.salmonis derivado de la amplificación del Amplicón 16S rdna de macerado de riñón de trucha Infectada. El producto de PCR fue diluido 10 veces para llegar a una concentración de 1 µg/ µl y agregar a la reacción de PCR específica 2 µl de producto de PCR. Se desarrolló el PCR utilizando los partidores descritos en el manual de la OIE, 2003 y en base al protocolo de concentraciones del KIT para PCR EconoTaq Plus Green Master Mix de Lucigen. Utilizando una concentración de templado de 2 µl correspondiente a 2 µg de 16 S rdna. Los productos de PCR derivados de los controles positivos se observan en la Figura INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

53 Figura 18. Electroforesis de productos de PCR de P. salmonis, se observa la amplificación del fragmento esperado de 470 pb. St: Estándar de Peso Molecular de 100pb; 1, 2, 3: Producto de PCR de P.salmonis; 4: Control negativo de la reacción de PCR. G. Dilución y cuantificación de controles positivos para control interno de especies silvestres (Eleginops maclovinus y otras) y asilvestradas (Salmo salar, O. mykiss, O. kisutch). Los controles positivos fueron preparados a partir de muestras en RNA later de 3 ejemplares derivados del muestreo base en el caso de las especies silvestres y de muestras entregadas por el laboratorio AQUAINNOVO en el caso de las especies salmonídeas y ejemplares entregados por las empresas salmoneras al Laboratorio de Biología molecular de IFOP. Se tomaron muestras de riñón, corazón, hígado y bazo y se realizó la extracción de RNA total mediante el KIT Ayprep Multisourse Miniprep de Axygen siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras consistieron en fragmentos de 0,5 cm 2 de corazón, riñón, hígado y bazo macerado en forma independiente. Los resultados de la extracción de RNA fueron cuantificados por medio de la medición de absorbancia a 260 nm y cuantificados utilizando la siguiente fórmula: 51 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

54 Abs x 40µg/ml x Factor de dilución = Concentración de RNA. Los resultados de la cuantificación se presentan en la Tabla 21. Tabla 21. Cuantificación de la extracción de RNA para muestras de las especies en estudio. Muestra Absorbancia 260 Absorbancia 280 Razón 260/280 ng/µl Hígado trucha 0,44 0,24 1,82 435,67 Riñón trucha 0,93 0,51 1,81 924,72 Bazo trucha 0,43 0,24 1,81 426,43 Corazón trucha 0,14 0,08 1,82 144,27 Hígado coho 0,85 0,47 1,81 850,31 Riñón coho 0,44 0,24 1,82 437,58 Bazo coho 0,08 0,05 1,75 78,64 Corazón coho 0,63 0,35 1,83 631,21 Hígado salmo salar 1,59 0,76 2, ,34 Riñón salmo salar 1,00 0,48 2,09 795,92 Bazo salmo salar 1,39 0,67 2, ,90 Corazón salmo salar 0,97 0,46 2,09 772,14 Hígado pejerrey 0,78 0,41 1,90 626,50 Riñón pejerrey 1,17 0,66 1,78 936,16 Bazo pejerrey 0,09 0,05 1,96 70,75 Corazón pejerrey 0,33 0,17 1,95 261,10 Hígado róbalo 0,24 0,13 1,83 194,03 Riñón róbalo 0,02 0,01 2,16 13,72 Bazo róbalo 0,27 0,14 1,86 211,85 Corazón róbalo 0,06 0,03 1,83 49,96 Hígado otras 0,51 0,27 1,87 410,26 Riñón otras 0,59 0,33 1,97 474,94 Bazo otras 0,18 0,09 1,91 141,30 Corazón otras 0,19 0,10 1,89 155,53 Promedio ng/µl Desviación estándar ng/µl 482,77 324,19 499,44 327,30 988,32 244,91 473,63 385,05 117,39 100,15 295,51 171, PCR en base a Protocolos Finales Laboratorio de Biología Molecular IFOP. Los respaldos fotográficos de los PCR desarrollados en base a los protocolos finales para los patógenos y genes reporteros, se presentan en el Anexo INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

55 4.6. Análisis de las muestras por PCR Los resultados de la totalidad de las muestras ingresadas resultaron negativas a la detección para ISAV, Alfavirus, V. ordalii, Aeromonas salmonicida, IHNV, EHNV y VHS independiente de la zona y especie a la que pertenecían. Sólo se presentaron resultados positivos a P. salmonis, correspondientes a 51 pooles de peces. El detalle de estos resultados se presenta en el Anexo 6. En la Tabla 22 se observa que la zona con la mayor frecuencia de muestras positivas a P. salmonis fue el estuario del Reloncaví, con un total de 28 pooles positivos, equivalentes a alrededor del 19% de los pooles analizados seguida de Castro, Hornopirén, Melinka y Aysén, en orden decreciente de número de diagnósticos positivos. Tabla 22. Frecuencia de pooles positivos a P. salmonis en las zonas muestreadas durante el periodo de estudio. Zona Pooles (+) Pooles (-) Prevalencia Total general Aysén ,66% 152 Castro ,18% 178 Estuario ,79% 149 Hornopirén ,46% 157 Melinka ,50% 160 Total general ,41% 796 La Tabla 23 muestra la frecuencia de positividad a nivel de especie, observándose que las especies con mayor frecuencia relativa de positividad a P. salmonis fueron el congrio y pampanito, con valores de prevalencia de 20%, seguidos de la brótula, lenguado y trucha arcoiris, con valores en torno al 11,1%, siendo esta última la única especie salmonídea que presentó positividad a este agente. Cabe mencionar que la cantidad de pooles analizados en estas especies fue bajo, no superando los 9 pooles por especie. Esto queda reflejado al ponderar la prevalencia dentro de cada especie por la proporción de pooles analizados que representa cada una de estas. Al hacer esta ponderación, se aprecia que el aporte de estas especies a la prevalencia general de P. salmonis es bajo (0,13% de 6,41%), mientras que las especies que más aportan a la prevalencia general son el róbalo y el pejerrey, los que a pesar de presentar prevalencias más bajas que las especies anteriores, representan la mayoría de los resultados positivos a este agente, aportando con valores de 2,76% y 1,38%, respectivamente, a la prevalencia general de 6,41%. Como se mencionó anteriormente, para el resto de las especies salmónidas no se detectaron pooles positivos, sin embargo, la escasa cantidad de muestras analizadas, podría explicar estos resultados. 53 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

56 Tabla 23. Frecuencia de positividad (absoluta y prevalencia) a P. salmonis en las distintas especies capturadas en las pescas de investigación Especie Pooles (+) Pooles (-) Prevalencia Prevalencia ponderada* Total general Congrio ,00% 0,13% 5 Pampanito ,00% 0,13% 5 Brótula ,11% 0,13% 9 Lenguado ,11% 0,13% 9 Trucha arcoiris ,11% 0,13% 9 Pejerrey ,00% 1,38% 100 Chancharro ,43% 0,63% 53 Cabrilla ,77% 0,63% 57 Róbalo ,84% 2,76% 377 Blanquillo ,00% 0,13% 25 Rollizo ,99% 0,25% 67 Bonito 0 5 0,00% 0,00% 5 Jurel 0 5 0,00% 0,00% 5 Merluza común ,00% 0,00% 33 Pejegallo 0 1 0,00% 0,00% 1 Salmón Coho ,00% 0,00% 13 Salmón del Atlántico 0 2 0,00% 0,00% 2 Tollo ,00% 0,00% 14 Trucha Fario 0 7 0,00% 0,00% 7 Total general ,41% 6,41% 796 *: Valor ponderado con respecto al total de pooles de peces analizados. Desde el punto de vista de las especies que explican los valores de prevalencia observados a nivel de zona, la Tabla 24 muestra que en todas las zonas, las principales especies que determinan la prevalencia son el róbalo y el pejerrey, representando el 50% o más de los pooles positivos a P. salmonis, existiendo también una participación importante de la cabrilla, el chancharro y el rollizo, sobre todo en la zona del estuario del Reloncaví, donde estas especies en conjunto representan alrededor del 36% de los pooles positivos de la zona. Al analizar las variaciones temporales en la positividad a P. salmonis en las especies capturadas durante el periodo de estudio (Tabla 25), se aprecian tres periodos donde aumenta notoriamente la prevalencia de este agente: mayo 2010, julio-septiembre 2010 y el periodo noviembre 2010 enero En el caso de mayo 2010 el valor de prevalencia en torno al 23%, fue dado por 7 pooles de pejerrey positivos al agente (Tabla 26). En julio de 2010 el valor de prevalencia del 10% está dado por un pool positivo de blanquillo y por la baja cantidad de pooles analizados durante este mes (10 pooles), mientras que en septiembre de 2010 el valor de prevalencia de 7,7% esta explicado por 3 pooles positivos, 2 de róbalo y 1 de trucha arcoiris. En el periodo noviembre 2010 enero INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

57 Tabla 24. Distribución de las especies positivas a P. salmonis, según ACS. Especie Aysén Castro Estuario Hornopirén Melinka Total general N pooles % pooles N pooles % pooles N pooles % pooles N pooles % pooles N pooles % pooles N pooles % pooles Blanquillo 0 0% 0 0% 1 4% 0 0% 0 0% 1 2% Brótula 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 25% 1 2% Cabrilla 0 0% 1 9% 3 11% 0 0% 1 25% 5 10% Chancharro 0 0% 0 0% 5 18% 0 0% 0 0% 5 10% Congrio 0 0% 0 0% 1 4% 0 0% 0 0% 1 2% Lenguado 0 0% 1 9% 0 0% 0 0% 0 0% 1 2% Pampanito 0 0% 1 9% 0 0% 0 0% 0 0% 1 2% Pejerrey 0 0% 2 18% 2 7% 7 100% 0 0% 11 22% Róbalo 1 100% 6 55% 13 46% 0 0% 2 50% 22 43% Rollizo 0 0% 0 0% 2 7% 0 0% 0 0% 2 4% Trucha arcoiris 0 0% 0 0% 1 4% 0 0% 0 0% 1 2% Total general 1 100% % % 7 100% 4 100% % 55 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

58 Tabla 25. Variaciones mensuales en la frecuencia de pooles positivos a P. salmonis (N absoluto de pooles positivos y prevalencia mensual) Año Mes Pooles (+) Pooles (-) Prevalencia Total general May ,3% 30 Jun ,3% 76 Jul ,0% 10 Sep ,7% 39 Oct ,0% 34 Nov ,1% 88 Dic ,4% 143 Ene ,9% 152 Feb ,0% 39 Mar ,0% 75 Abr ,0% 83 May ,0% INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

59 Tabla 26. Distribución de las especies capturadas en los pooles positivos a P. salmonis, según mes Año Mes Blanquillo Brótula Cabrilla Chancharro Congrio Lenguado Pampanito Pejerrey Róbalo Rollizo Trucha arcoiris Total general 2010 May Jun Jul Sep Oct Nov Dic Ene Feb Mar Abr May Total general INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES

60 P.salmonis / B-actina INST IT UT O DE F OM ENT O PESQUERO / DIVISIÓN INVESTIGACIÓN EN ACUICULTURA 4.7. Cuantificación relativa de los resultados positivos. Se realizó un gel de agarosa para las muestras positivas y sus respectivos genes reporteros, las muestras fueron evaluadas en el sistema Image J cuantificando la intensidad de la banda. Los resultados de la medición se presentan como la razón entre los valores otorgados por la reacción para P.salmonis dividido por el valor de la reacción del gen reportero. Los resultados de las muestras positivas fueron expresados de manera semicuantitativa y graficados en la Figura 19. Cuantificación resultados positivos P.salmonis por tejido dentro de Pool Identificación de Pool Figura 19. Cuantificación relativa de resultados positivos P.salmonis. * El detalle de las especies correspondientes a las muestras y la zona de origen se presentan en la Figura 20. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 58

61 NºMuestra Especie Pejerrey Pejerrey Pejerrey Pejerrey Pejerrey Pejerrey Pejerrey Pejerrey Pejerrey Pejerrey Blanquillo Trucha Arcoiris Robalo Robalo Zona Hornopiren Hornopiren Hornopiren Hornopiren Hornopiren Hornopiren Hornopiren Hornopiren Hornopiren Hornopiren Estuario Estuario Estuario Estuario Secuenciación s/i s/i anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 s/i anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 NºMuestra Especie Lenguado Robalo Chancharro Chancharro Chancharro Pejerrey Robalo Robalo Robalo Robalo Pejerrey Rollizo Rollizo Robalo Zona Castro Aysen Estuario Estuario Estuario Estuario Estuario Melinka Estuario Estuario Estuario Estuario Estuario Estuario Secuenciación anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 NºMuestra Especie Robalo Robalo Robalo Robalo Robalo Robalo Robalo Robalo Chancharro Chancharro Cabrilla Cabrilla Cabrilla Congrio Zona Estuario Estuario Estuario Estuario Estuario Estuario Estuario Estuario Estuario Estuario Estuario Estuario Estuario Estuario Secuenciación anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 anexo 7 s/i NºMuestra Especie Pejerrey Pejerrey Robalo Robalo Robalo Robalo Robalo Robalo Robalo Cabrilla Pampanito Cabrilla Robalo Brotula Zona Castro Castro Castro Castro Castro Castro Castro Castro Castro Castro Castro Melinka Melinka Melinka Secuenciación s/i s/i s/i s/i s/i s/i s/i s/i s/i s/i s/i s/i s/i s/i Figura 20. Identificación de muestras cuantificadas por especie y zona de origen. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 59

62 4.8. Aislamiento viral de los positivos Para el presente informe, los resultados positivos obtenidos corresponden sólo a P.salmonis. No reportándose ningún resultado positivo para agentes virales. Las bandas positivas de P.salmonis fueron purificadas utilizando el protocolo de purificación de productos de PCR kit comercial MiniElute Gel Extraccion de QIAGEN, posteriormente fueron enviadas a secuenciación a Biogenetics ubicado en Santiago de Chile, y una vez obtenida la secuencia, se utilizó el programa de alineamiento BLAST para corroborar que nuestra secuencia corresponde a la secuencia indicada en la base de datos NCBI del patógeno de interés. Los resultados de la secuenciación de las muestras nos permiten señalar que las muestras indicadas como positivas utilizando el protocolo LBM-PS2 implementado en el laboratorio de Biología Molecular de IFOP, se confirman como positivas dado que el producto de PCR obtenido de las distintas muestras presenta un alto porcentaje de identidad con las secuencias de cepas de Piscirickettsia salmonis disponibles en las base de datos NCBI. Los resultados de los alineamientos obtenidos de la aplicación de BLAST se presentan en el Anexo 8. Los resultados de la secuenciación con el detalle de las secuencias por especie de pez y porcentaje de identidad con el patógeno P.salmonis se presentan en el Anexo 7. Como resultado de los alineamientos por BLAST se evidencia que los aislados de peces silvestres en su mayoría tienen un mayor score y porcentaje de identidad con la cepa irlandesa IRE-99D ingresada al banco de genes con el código AY , correspondiente a una cepa de Salmón del Atlántico aislada en el año 1999, la cual al ser alineada presenta la siguiente matriz de identidad: Figura 21. Matriz de identidad al comprar las secuencias 16Sr disponibles en NCBI con la cepa IRE-99D (Reid et al, 2004). INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 60

63 De los aislados secuenciados, existen 3 que tienen un mejor score para la cepa AL10015 ingresada con el código EU , al banco de genes de NCBI, la que corresponde a un aislado chileno sin información de la especie de origen, ingresado a la base de datos en el año 2007, para la cual se describe crecimiento en medio líquido. Por otro lado existen 2 cepas que presentan un mayor score para la cepa NVI5890 ingresada con el código EU , la que corresponde a una secuencia corta ingresada en el año 2007 de origen no informado, para la cual se describe crecimiento en agar. Cabe destacar que ambas secuencias fueron ingresadas por grupos de investigación noruegos Análisis estadístico Para comparar las características morfométricas (peso, longitud y factor de condición) entre los peces positivos y negativos a P. salmonis se realizó el análisis de varianza de Kruskal-Wallis. Esta prueba no paramétrica permite comparar las esperanzas de 2 o más distribuciones sin necesidad de realizar el supuesto de que los términos de error se distribuyen normalmente (InfoStat, 2004). Este análisis se aplicó sólo para las especies pejerrey, chancharro, cabrilla y róbalo, debido a que en el resto de las especies en las que hubo positividad a P. salmonis en general sólo se detectó un pool positivo. Los resultados de esta prueba se presentan en la Tabla 27. En esta se observa que para las tres variables las diferencias observadas son significativas (p < 0,05). Tabla 27. Resultados de Anova Kruskal-Wallis, para variables morfométricas de los peces capturados Variable P. salmonis N Medias D.E Medianas H p-valor Peso promedio Negativo ,97 562,16 293,33 9,35 0,002 Peso promedio Positivo ,24 359, Long promedio Negativo ,89 12,52 29,58 7,27 0,007 Long promedio Positivo 51 28,68 10,6 24, FC promedio Negativo 744 0,43 0,64 0,01 10,91 0,001 FC promedio Positivo 51 0,12 0,26 0, D.E: desviación estándar Al realizar este análisis para las distintas especies por separado, las diferencias sólo fueron significativas para el caso del róbalo (Tabla 28), presentando los peces positivos menores pesos, longitud y FC promedio que los peces negativos a este agente. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 61

64 Tabla 28. Resultados de Anova Kruskal-Wallis, para variables morfométricas de róbalos capturados Variable P. salmonis N Medias D.E Medianas H p-valor Peso promedio Negativo ,02 287, ,09 0,043 Peso promedio Positivo ,55 351,13 72, Long promedio Negativo ,79 10,34 30,5 3,79 0,05 Long promedio Positivo 22 28,5 12,75 20, FC promedio Negativo 355 0,31 0,69 0,01 3,42 0,06 FC promedio Positivo 22 0,05 0,21 0, Al comparar la frecuencia de presentación de resultados positivos entre muestreos de lejanía y proximidad mediante la prueba de Chi-cuadrado, en la única especie en la que se presentó una diferencia significativa en la frecuencia de positividad entre estos dos tipos de muestreos fue en el róbalo (p = 0,01), detectándose una mayor frecuencia de positividad en aquellos pooles provenientes de peces capturados en muestreos de lejanía (Tabla 29). Tabla 29. Frecuencia de positividad en pooles de róbalo obtenidos a partir de peces capturados en muestreos de lejanía/proximidad. Tipo muestreo Resultados P. salmonis Negativos Positivos Total Lejanía Proximidad Total Las posibles diferencias en la frecuencia de positividad a P. salmonis entre zonas fueron analizadas, ajustando por la variable especie, mediante un modelo de regresión logística, el que incorporó las variables zona y especie, dejando como niveles de referencia de estas variables a la zona de Aysén y a la especie cabrilla. Los resultados de este modelo se presentan en la Tabla 30. En esta se puede apreciar que la única zona que presentó un efecto significativo en la frecuencia de positividad de los pooles frente al agente fue la zona del Estuario del Reloncaví (p = 0,003), con un valor de odds ratio de 22, lo que indica que un pool analizado proveniente de esta zona tiene 22 veces más riesgo de ser positivo a P. salmonis que uno proveniente de la zona utilizada como referencia en el análisis (Aysén). INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 62

65 Tabla 30. Estimadores y parámetros del modelo de regresión logística ajustado por zona y especie. Parámetros Estimador Error estándar Odd ratio Wald Chi² p-valor Constante -4,51 1,13 0,01 15,8512 0,0001 Zona_Castro 1,47 1,08 4,34 1,8621 0,1724 Zona_Estuario 3,10 1,04 22,18 8,8328 0,0030 Zona_Hornopiren 1,67 1,10 5,32 2,3037 0,1291 Zona_Melinka 0,59 1,17 1,80 0,2518 0,6158 Especie_Chancharro -0,36 0,70 0,70 0,2634 0,6078 Especie_Pejerrey 0,84 0,62 2,32 1,8163 0,1778 Especie_Róbalo -0,01 0,55 0,99 0,0005 0,9825 Objetivo 2: Caracterizar y cuantificar el riesgo de transmisión de EAR entre peces asilvestrados/silvestre/cultivo Organización de la información y elaboración de matriz de interacción de variables en base a estadística multivariada. A partir de las encuestas realizadas a profesionales de los centros de cultivo desde donde se obtuvieron las muestras de la pesca de captura, los valores registrados en la misma, e información de variables sanitarias entregadas por Sernapesca, se evaluó la existencia de interacción entre las variables que pueden determinar la infección de peces silvestres con Enfermedades de Alto riesgo o la infección de peces de cultivo a través de poblaciones silvestres infectadas. Los antecedentes derivados de las encuestas sanitarias se adjuntan en el Anexo 9. La Tabla 21 muestra el diseño conceptual de la matriz de interacción. Las interacciones definidas a priori se sustentan en la revisión de antecedentes bibliográficos. Es así como se describe la interacción entre las poblaciones dominantes derivadas de la Pesca de Investigación (Odontesthes regia y Eleginops maclovinus) con las poblaciones en cultivo, y a su vez salmónidos escapados de los centros de cultivo. Esta afirmación se sustenta en estudios realizados por Sepúlveda et al, 2004, quienes estudiaron los contenidos gástricos de las poblaciones circundantes a los centros de cultivo y encontraron que estas especies poseían en un 58%, 100% y 56% de los casos alimento artificial en su contenido gástrico. Por otra parte, la dieta de los salmónidos escapados a su vez, fue consistentemente similar a la evidenciada para O. regia mostrando alta prevalencia de crustáceos. Lo anterior indica que las especies comparten nichos ecológicos fuera del centro de cultivo. Por otro lado, se describe que la existencia de alimento artificial en el sistema, afecta la dinámica de las poblaciones de peces silvestres resultando en una modificación de las relaciones interespecie locales. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 63

66 Si consideramos la afirmación de Pulkkinen et al, 2010, quienes señalan que el principal origen de las enfermedades en centros de cultivo es la introducción desde otras áreas geográficas por intervenciones humanas o la adaptación de patógenos presentes en poblaciones silvestres a los nuevos hospederos en condiciones de cultivo. Un potencial factor de riesgo son las interacciones entre estas poblaciones silvestres oportunistas con las poblaciones en cultivo y en particular la presencia de agentes patógenos que mantenían un equilibrio y bajas virulencias en las poblaciones silvestres, al ver modificadas las condiciones ambientales principalmente por un incremento en la cantidad de susceptibles provee las condiciones óptimas para la emergencia de patógenos que pueden causar brotes en las poblaciones de cultivo (Sharg y Wiener; 1995). Por otro lado, los manejos realizados en las jaulas de cultivo asociado a las altas densidades genera factores de estrés en los peces que favorecen la colonización por patógenos y a su vez facilita la transmisión del agente dentro de la población dada una mayor tasa de contacto (Reno, 1998). Por otro lado Hudson et al, 1992 y Seppälä et al, 2003, señalan que las bajas densidades de las poblaciones naturales determinan una baja tasa de contacto entre los individuos. Bajo estas condiciones pueden favorecerse infecciones de carácter crónico o los individuos infectados en el caso de desarrollar sintomatología clínica quedarán más propensos a la predación, lo que sería más frecuente en caso de existir síntomas más severos y el pez moribundo sería removido de la población antes de que ocurra transmisión del agente patógeno. La presencia de peces vacunados en los centros de cultivo se describe como la principal medida para disminuir el número de individuos de la población susceptible, transformándose en una herramienta útil en el control de enfermedades en ambos ambientes, tanto en los peces de cultivo como en las poblaciones silvestres (Reno, 1998). Se presentó al panel de expertos la matriz con las interacciones identificadas y los antecedentes derivados de las publicaciones científicas para que fuera validada, es así como la matriz validada se presenta en la Tabla 31. Posteriormente, las interacciones definidas en forma teórica, fueron verificadas mediante métodos cuantitativos, con el objetivo de establecer que variables son las que posiblemente determinan la presencia o persistencia del patógeno P. salmonis en poblaciones silvestres y en poblaciones de cultivo. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 64

67 Tabla 31. Diseño conceptual de la matriz de interacción entre variables del centro de cultivo muestreado y resultados de la pesca de captura Variable Esp. Peso Long. Tipo Fecha Sign. PCR capt. capt. capt. muest. capt. capt. (+) ACS S/I + + Tipo centro S/I S/I S/I + Esp. cult. + S/I S/I + S/I + + Tpo. siembra Vacunación S/I S/I S/I S/I S/I + + Mort. diaria S/I S/I S/I S/I S/I + + Mort. acum. S/I S/I S/I S/I S/I + + Biom. cent. S/I S/I + + Peso prom. S/I + + S/I S/I + + Brot. cent. S/I S/I S/I S/I S/I + + Brot. área + S/I S/I S/I S/I + + Carga calig S/I S/I + + Biom. área S/I + + S/I S/I + + Escap. área S/I S/I S/I + Temperatura S/I S/I + + Salinidad + S/I S/I S/I S/I + + ACS: agrupación concesiones salmoneras; Esp. cult.: especie cultivada; Tpo. siembra: tiempo desde la siembra; Mort. Diaria: mortalidad diaria; Mort. acum.: mortalidad acumulada desde la siembra; Biom. cent.: biomasa centro; Peso prom.: peso promedio peces centro; Brot. cent.: Nº brotes en el centro; Brot área: Nº brotes en el área; Carga calig.: carga de Caligus rogercresseyi; Biom. área: biomasa del área; Escap. área: cantidad escapes en el área; Esp. capt.: especies obtenidas en la muestra de captura; Peso capt.: peso de las capturas; Long. capt.: longitud de las capturas; Tipo muest: tipo de muestreo (lejanía/proximidad); Fecha capt.: fecha de la captura; Sign. capt.: signos clínicos de la captura; PCR (+): porcentaje de peces capturados positivos a PCR para la detección del agente; S/I: sin interacción; +: posible interacción. Los resultados derivados de las encuestas sanitarias y los obtenidos de los muestreos para las distintas zonas, indican que existe correlación positiva, entre la presentación de brotes en las poblaciones de cultivo con la presencia de diagnóstico positivo en las poblaciones silvestres. En este sentido se hace relevante el dilucidar la direccionalidad del evento de transmisión del agente patógeno y posterior desarrollo de la enfermedad. A la luz de los antecedentes revisados en publicaciones científicas, se presenta como más probable que el patógeno en sus orígenes se presentará normalmente en las poblaciones silvestres, y que producto de la modificación del ambiente por la inserción de los centros de cultivo haya colonizado a esta nueva especie y modificado su patogenicidad en función de sobrevivir a la nueva presión de selección (Gandon et al, 2001; Read y Taylor, 2001; Bell et al, 2006), un ejemplo de esto es lo ocurrido con el patógeno INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 65

68 Flavobacterium columnare en Finlandia, en que el patógeno proveniente de las poblaciones silvestres, al introducirse en los cultivos acuícolas de especies salmonídeas, desarrolló brotes de la enfermedad entre el año 1984 y 1992, con mortalidades en estudios de desafío de 25% en 7 días, posteriormente al introducirse los tratamientos antibióticos e incrementar así la presión de selección sobre el patógeno, se han desarrollado variedades más virulentas del mismo patógeno las cuales presentan mortalidades del 100% en la misma cantidad de tiempo (Pulkkinen et al, 2010). Lo anterior es un modelo que podría explicar los incrementos en la virulencia de P.salmonis en las poblaciones en cultivo y que otorga relevancia a los monitoreos en peces silvestres, como fuentes de patógenos que posteriormente pueden emerger como patógenos de relevancia en las especies de cultivo. La secuenciación de los productos de PCR resultantes de las muestras correspondientes a peces silvestres nos permite indicar que los patógenos detectados por PCR corresponden efectivamente a Piscirickettsia salmonis, sin embargo es relevante considerar el profundizar el análisis de estas secuencias a través de la amplificación de sus regiones ITS y comparar estas secuencias con las ya descritas en publicaciones científicas con el objetivo de evaluar su cercanía o divergencia con las P. salmonis que están siendo aisladas de los centros de cultivo. Lo anterior debido a que actualmente se han descrito otros agentes que responden a la reacción de PCR desarrollada específicamente para la región 16Sr de P. salmonis desarrollada por Mauel et al, 1996 generando un producto de PCR del tamaño esperado, pero que sin embargo al utilizar el método descrito por Marshall et al,1998, si permite diferenciar entre los aislados y discriminar la existencia de divergencias entre las cepas (Corbeil et al, 2005) Análisis de factores de riesgo de positividad a Piscirickettsia salmonis en peces capturados en torno a centros de cultivo Se realizó un estudio de factores de riesgo de positividad a P. salmonis en pooles de los peces capturados en torno a los centros de cultivo durante el periodo de estudio. Las variables analizadas fueron la especie capturada a partir de la que se constituyó el pool, zona muestreada, tipo de muestreo (proximidad o lejanía), presencia de lesiones en alguno de los peces del pool, ocurrencia de brotes en el centro de cultivo en el periodo previo o durante el muestreo, periodo del año en que se produjo el muestreo, largo, peso y FC promedio de los peces que conforman el pool analizado. El detalle de estas variables se presenta en la Tabla 32. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 66

69 Tabla 32. Variables analizadas en el estudio de factores de riesgo y su descripción Variable Especie Zona Tipo muestreo Lesión Brote Estación Largo promedio Peso promedio FC promedio Descripción Especie capturada en torno al centro de cultivo y que constituyó un pool Zona en la que se localizó el centro en torno al cual se muestreó Proximidad o lejanía Presencia de lesiones en alguno de los peces capturados Ocurrencia de algún brote de piscirickettsiosis en el centro de cultivo en torno al que se muestreó durante el periodo previo o durante el muestreo Estación del año en la que se produjo el muestreo (otoño, invierno, primavera, verano) Longitud (cm) promedio de los peces que componen el pool analizado Peso (gr) promedio de los peces que componen el pool analizado Factor de condición promedio de los peces que componen el pool analizado Los análisis fueron realizados mediante el uso de regresión logística, en la cual la variable respuesta fue la positividad/negatividad del pool analizado. Se realizaron en una primera instancia análisis univariados para detectar asociaciones incondicionales (p 0,2) de las variables independientes con la variable respuesta, posteriormente las variables que presentaron una asociación de este tipo fueron incorporadas en un modelo de regresión logística multivariado (modelo máximo). Las variables que resultaron ser no significativas en este modelo máximo fueron eliminadas de forma secuencial mediante un procedimiento de backward elimination, reteniendo aquellas variables con un valor de p menor a 0,05 (Dohoo et al., 2009). Las variables que presentaron una asociación incondicional con la positividad del pool de peces analizados fueron la zona donde se ubicaba el centro muestreado, la especie capturada, la presentación de brotes de piscirickettsiosis en el periodo previo o durante el muestreo, la estación del año cuando se muestreo, y el largo, peso y FC promedio de los peces que componían el pool analizado. La Tabla 33 muestra las variables retenidas en el modelo final: especie capturada (congrio y brótula), zona (Hornopirén y estuario del Reloncaví), FC promedio de los peces del pool, estación del año (primavera) y la presentación de brotes de piscirickettsiosis en el periodo previo al muestreo. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 67

70 Tabla 33. Variables retenidas en el modelo final y estadísticos asociados Parámetros Estimador Error estándar Odds ratio Wald Chi² p-valor Constante -3,81 0,36 0,02 110,45 < 0,001 Especie_Congrio 2,97 1,45 19,54 4,20 0,040 Especie_Brótula 3,51 1,29 33,38 7,37 0,007 Zona_Estuario 1,47 0,38 4,35 15,04 < 0,001 Zona_Hornopirén 3,08 1,07 21,82 8,31 0,004 Brote_SRS 2,20 0,37 9,03 35,20 <0,001 Estación_Primavera -1,49 0,43 0,23 12,09 0,001 FC promedio -4,19 1,42 0,02 8,72 0,003 Al revisar estos valores, se aprecia que en el caso de las especies capturadas un pool de congrio presenta 19,5 veces más probabilidad de presentar positividad a P. salmonis que un pool de cualquiera de las otras especies, mientras que en el caso de la brótula la probabilidad es 33,4 veces mayor comparado con el resto de las especies capturadas. Lo anterior se relaciona con que las pocas muestras obtenidas de estas especies resultaron efectivamente positivas. Con respecto a la zona en la que se ubicaba el centro en torno al cual se realizó el muestreo, se observa que las zonas del estuario de Reloncaví y de Hornopirén presentan 4,3 y 21,8 veces más probabilidad de presentar pooles positivos de peces capturados en torno a un centro de cultivo. La presentación de brotes de piscirickettsiosis en el periodo previo o durante el muestreo hace que la probabilidad de que un pool de peces capturados en torno al centro sea positivo a P. salmonis sea 9 veces mayor con respecto a centros que no reportaron brotes o que se encontraban en descanso sanitario al momento del muestreo. Los pooles obtenidos a partir de muestreos realizados en el periodo de primavera tienen una probabilidad 0,2 veces menor de presentar positividad al agente, comparado con los pooles obtenidos de muestreos en cualquier otra época del año. Este resultado debe analizarse acompañado de datos de Temperatura para las temporadas de muestreo y extenderse esta data en al menos 2 años para poder emitir alguna conclusión. En el caso del factor de condición, a medida que aumenta el valor de este la probabilidad de que el pool sea positivo al agente disminuye. Esto se expresa de mejor manera en la Tabla 34, que relaciona valores de FC con valores de Odds ratios (Razón de probabilidad de presentación del evento en el grupo expuesto versus el no expuesto al factor de riesgo), OR estimados a partir de su coeficiente de regresión (log odds). INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 68

71 Tabla 34. Odds ratios estimados para distintos valores de FC FC Log odds OR Análisis de factores de riesgo de la prevalencia de pooles positivos a Piscirickettsia salmonis de peces capturados en torno a centros de cultivo Para realizar este análisis se utilizó como variable dependiente la prevalencia a nivel de zona de pooles positivos a P. salmonis, a la que se transformo mediante la aplicación de logaritmo natural para lograr una distribución similar a la normar de sus valores. Las variables independientes analizadas fueron N de brotes de piscirickettsiosis en el barrio (Información SERNAPESCA) durante el periodo , N de brotes en el barrio durante el año 2009, N de brotes en el centro durante el año 2009, N de peces/centro promedio de la zona durante el año 2009, N peces/jaula promedio de la zona durante el año 2009, biomasa/jaula promedio de la zona durante el 2009, temperatura y salinidad promedio de la zona durante 2009, densidad de cultivo promedio de la zona durante 2009, carga de caligus promedio de la zona durante 2009, longitud, peso y FC promedio de los peces capturados en la zona. Estas variables fueron analizadas de manera individual para identificar asociaciones significativas (p < 0,05) mediante la aplicación de modelos regresión lineal simple. La única variable que presentó una asociación significativa con la prevalencia a nivel de zona de pooles positivos a P. salmonis fue el peso promedio de los peces, presentando una asociación negativa con la prevalencia a nivel de zona. Esta variable, junto a otras variables que presentaron una asociación incondicional (p 0,2) en el análisis univariado se presentan en la Tabla 35. Tabla 35. Variables analizadas mediante regresión lineal y estadísticos asociados. Variable Estimador Error estándar LI(95%) LS(95%) T p-valor N brotes barrio 0, , , , ,85 0,16 Nº peces/centro promedio -0, , , , ,64 0,20 Temperatura promedio 1, , , , ,81 0,07 Longitud promedio -0, , , , ,70 0,07 Peso promedio -0, , , , ,61 0,01 FC promedio -1, , , , ,52 0,22 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 69

72 En esta se observa que el número de brotes ocurridos en la ACS durante el periodo y la temperatura promedio del agua de la zona durante el año 2009, tienen una asociación positiva con la prevalencia del agente en las poblaciones silvestres analizadas. En el caso de la longitud y FC promedio de los peces capturados en la zona, estos presentan una asociación negativa con la prevalencia a nivel de zona, mientras que el número promedio de peces/centro presentó una asociación negativa con la prevalencia de positividad a P. salmonis. Es importante considerar que estas asociaciones no son significativas, por lo que pueden variar en la medida que se incorporen más datos al modelo, específicamente los valores a nivel de centro de cultivo de las variables analizadas a nivel de zona en esta instancia, a saber: N de peces/centro, N peces jaula, biomasa/jaula, temperatura y salinidad del agua, densidad de cultivo y niveles de infestación con caligus. En la medida que estas variables sean analizadas en mayor detalle se podrá tener una mejor comprensión de este fenómeno Conformación de Panel de expertos ad-hoc multidisciplinario Se realizó una búsqueda de expertos nacionales e internacionales que poseen publicaciones en relación a la problemática en estudio y se les invitó a participar en el panel. Los expertos identificados que participaron de la consulta se indican a continuación: Ricardo Enríquez S. (renrique@uach.cl) Vicepresidente de Comisión de estándares Sanitarios de Animales Acuáticos OIE. Médico Veterinario, Universidad Austral de Chile, 1986, Chile Dr. Medicina Veterinaria, Ludwig Maximilians Universität, München, 1994, Alemania. Carla Rosenfeld M. (crosenfe@uach.cl) Médico Veterinario, Doctora en Patología Animal mención Salud Animal. Universidad Austral de Chile Universidad Austral de Chile. Master en Ciencias, Medicina Preventiva Veterinaria. Universidad Austral de Chile. Evaluación epidemiológica y control estadístico de procesos Sandra Marín R. (smarin@spm.uach.cl) Master en Ciencias c/m Fauna Silvestre y Pesquería, M.Sc, Texas A&M University, Estados Unidos. Ecología Acuática. Especialidad en Dinámica de Cadenas Tróficas y Modelación Numérica de Ecosistemas. Heraldo Contreras (heraldo.contreras@ifop.cl) Biólogo Marino, de la Universidad Austral de Chile. Doctor en Ecología y Sistemática de la Universidad Austral de Chile. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 70

73 4.14. Diseño y Aplicación de encuesta. Se diseñó una encuesta basada en los árboles de decisión previamente elaborados por el equipo técnico de IFOP. Los árboles de decisión fueron enviados a los expertos vía correo electrónico para que se familiarizaran con la problemática a analizar. Posteriormente fueron discutidos en un Taller de trabajo realizado en la ciudad de Puerto Montt el 12 de Julio del El detalle de los árboles de decisión analizados se presenta en el Anexo 10 junto a la encuesta diseñada y las escalas de probabilidad definidas y validadas por el Panel Análisis de Riesgo de la transmisión de EAR entre peces asilvestrados/silvestres/cultivo. A. Ejecución del Modelo Análisis de Riesgo En función de las zonas en las cuales se ubicaron los centros de cultivo en torno a los cuales se realizaron los muestreos, se ejecutaron los modelos de riesgo para cada zona. a) Diseño del modelo de análisis de riesgo: A partir de la literatura y referencias internacionales, como las de la OIE, se desarrollaron árboles de escenarios para cuatro procesos de transmisión de EAR: 1) transmisión de desde peces silvestres a poblaciones de salmónidos de cultivo, 2) transmisión desde poblaciones de salmónidos asilvestradas a poblaciones de cultivo, 3) transmisión desde poblaciones de salmónidos en cultivo a poblaciones de peces silvestres, y 4) transmisión desde peces asilvestrados a poblaciones silvestres. En los dos primeros árboles de escenarios, que muestran el flujo de procesos necesario para el ingreso de un agente patógeno al centro de cultivo (Figura 22), el proceso comienza con la presencia en el entorno del centro de cultivo de un pez silvestre infectado con el agente en cuestión, el cual puede presentar la enfermedad (liberando el agente al medio), lo cual a su vez puede causar la infección de un salmónido del centro de cultivo, el cual, dependiendo de la existencia o no de inmunidad de masa (vacunación) en la jaula, puede llevar a la presentación de un brote en la jaula y centro de cultivo con distintas probabilidades. Se debe mencionar que la parte del árbol de escenarios que considera la presencia o no de inmunidad de masa no fue incluida en este análisis, dada la falta de información sobre la efectividad de estas vacunas en proteger a las poblaciones, además de la información relativa al nivel de cobertura en la población de salmónidos cultivados. En el caso de los dos últimos, estos muestran el flujo de procesos necesario para el desplazamiento de un agente patógeno desde una población de salmónidos cultivados hacia una población de peces silvestres, ya sea a través de peces silvestres o asilvestrados que se desplazan entre estas poblaciones (Figura 23). INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 71

74 Figura 22. Árbol de escenarios que muestran el flujo de procesos de la transmisión y establecimiento de un agente patógeno desde peces silvestres/asilvestrado hacia poblaciones de cultivo INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 72

75 Figura 23. Árbol de escenarios que muestran el flujo de procesos de la transmisión y establecimiento desde peces silvestres/asilvestrado hacia poblaciones silvestres Debido a que el único agente detectado durante el periodo de estudio fue P. salmonis, los análisis fueron realizados estimando el riesgo de la transmisión de este agente entre las poblaciones de peces. La conceptualización de los modelos de análisis de riesgo, en cuanto a su objetivo, escenarios y eventos que participan en estos, fue discutida con un grupo de expertos ad-hoc multidisciplinario, quienes además, mediante la aplicación de una encuesta, entregaron información sobre una serie de probabilidades que participan en los árboles de escenarios conceptualizados, las que debieron ser estimadas de forma semi-cuantitativa debido a la falta de antecedentes bibliográficos. Las variables sobre las que los expertos entregaron valoraciones subjetivas y los valores de probabilidad asociados a estas se presentan en las Tablas 36 y 37, respectivamente. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 73

76 Tabla 36. Probabilidades asignadas por el panel de expertos a las variables de los árboles de escenarios de los modelos de análisis de riesgo de la transmisión de EAR Tipo de transmisión Evento Probabilidad Enfermedad pez silvestre Baja Infección salmónido cultivo Baja Silvestres a cultivo Desarrollo de brote en jaula Ligera Enfermedad pez asilvestrado - Infección salmónido cultivo Muy baja Asilvestrados a cultivo Desarrollo de brote en jaula Muy baja Liberación del agente al medio - Contacto pez silvestre con poblaciones naturales - Infección peces silvestres - Silvestres a silvestres Brote población P. silvestres insignificante Liberación del agente al medio Baja Contacto pez infectado con poblaciones naturales Insignificante Infección peces silvestres Baja Asilvestrados a silvestres Brote población P. silvestres - - : No fue posible emitir un juicio a la fecha de la consulta Categoría Tabla 37. Categorización de probabilidades de ocurrencia de un evento Definición Probabilidad Mínimo Máximo Insignificante El evento virtualmente no ocurriría 0,000% 0,001% Extremadamente bajo Extremamente improbable que ocurra el evento 0,001% 0,01% Muy bajo Muy improbable que ocurra el evento 0,01% 0,10% Bajo Improbable que ocurra el evento 0,10% 1% Ligero Posible que ocurra el evento a una probabilidad baja 1% 10% Moderado Posible que ocurra el evento a una probabilidad alta 10% 50% Alto Altamente probable que ocurra el evento 50% 100% El árbol de escenario cuyas probabilidades de ocurrencia de eventos pudieron ser estimadas de forma más completa mediante este procedimiento, fue el árbol que estima la transmisión entre peces silvestres en torno a un centro de cultivo de salmónidos y la población cultivada del centro. En tanto, en el resto de los árboles de escenarios del análisis de riesgo, a la fecha existen importantes brechas en el conocimiento para desarrollar este tipo de análisis. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 74

77 Por lo anteriormente expuesto, se desarrolló el modelo análisis de riesgo para la transmisión de P. salmonis desde poblaciones de peces silvestres a poblaciones de salmónidos cultivados. En la medida que se desarrolle un mayor conocimiento sobre la patología de este agente en poblaciones silvestres, su epidemiología y comportamiento de las poblaciones silvestres será posible complementar y desarrollar de mejor forma, modelos de análisis de riesgo para otros escenarios de transmisión de esta enfermedad. Las consecuencias de la transmisión de P. salmonis hacia poblaciones de cultivo de salmónidos fueron cuantificadas en términos de la cantidad de producto perdido (toneladas de biomasa perdida). b) Recopilación de Información necesaria para el desarrollo del modelo de análisis de riesgo: La información necesaria para el desarrollo de este análisis se obtuvo a partir de las campañas de muestreo en torno a los centros de cultivo, los resultados de PCR para P. salmonis, consulta al panel de expertos para la evaluación semi-cuantitativa de probabilidades, y miembros de la industria, quienes aportaron con información sobre las consecuencias de un brote de piscirickettiosis en un centro de cultivo. c) Desarrollo del modelo de análisis de riesgo: Siguiendo la metodología de OIE (2010), la estructura del Análisis de Riesgo incluyó las siguientes etapas: Identificación del peligro En base a los resultados obtenidos en las campañas de muestreo y en los análisis de las muestras se definió como peligro a la presencia de peces silvestres que presenten positividad a P. salmonis. Evaluación del riesgo Evaluación de la difusión: Esta etapa se refiere al ingreso del agente a la población de salmónidos cultivados, y consideró la presencia de peces silvestres que portaran al agente, asumiendo la positividad a PCR como indicativo de este evento, y la liberación del agente desde estos. Evaluación de la exposición: Se refiere al establecimiento del agente en la población de peces cultivados, y para efectos de este análisis dicho evento viene dado por la probabilidad de liberación del agente desde peces silvestres infectados en torno al centro de cultivo y por la probabilidad de que los peces del centro de cultivo adquieran la infección a partir de este evento. Evaluación de las consecuencias Las consecuencias derivadas de la infección con P. salmonis se estimaron a partir de la información entregada por los miembros de la industria entrevistados en el marco del proyecto, INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 75

78 estimando las pérdidas de biomasa asociadas a un brote de piscirickettsiosis en un centro de cultivo. Aplicación de encuestas a miembros de la industria Se realizó una consulta a 8 miembros de la industria con experiencia en el área de salud de salmónidos, a fin de definir los parámetros de ciertos eventos para los cuales la información no se encuentra disponible. La información entregada por los expertos fue la siguiente: Valores esperados del número de jaulas en un centro de mar Valores esperados del número de peces por jaula en centro de mar Valores esperados de los parámetros relativos a un brote de piscirickettsiosis (mortalidad a nivel de jaula, N de jaulas afectadas, peso promedio de los peces afectados) Esta información entregada por los expertos permitió estimar las consecuencias asociadas a un brote de piscirickettsiosis en un centro de mar, en términos toneladas de biomasa perdida. Estimación del riesgo Se integraron los resultados de la probabilidad de todo el flujo de proceso, desde la presencia de peces silvestres positivos al agente hasta la presentación de un brote de piscirickettsiosis, con las consecuencias estimadas en la etapa anterior, obteniendo de esta forma la cantidad estimada de biomasa perdida producto de la transmisión de P. salmonis desde peces silvestres a salmónidos de cultivo. A continuación se presentan los resultados del análisis de riesgo de la transmisión de P. salmonis desde peces silvestres a salmónidos de cultivo a nivel de un centro ubicado en las zonas analizadas en el presente estudio. La Tabla 38 muestra la cantidad estimada de biomasa perdida producto de la transmisión de P. salmonis desde peces silvestres al centro de cultivo. En ella se aprecia que el impacto estimado es marginal, con valores que en el 97,5% de las veces no superarían los 1,6 Kg de biomasa. Este bajo impacto que tendría la infección con P. salmonis en peces silvestres sobre las poblaciones cultivadas dice relación con los bajos niveles de probabilidad asignados por el panel de expertos a los eventos relativos al riesgo de transmisión del agente desde los peces silvestres. Por lo tanto es de interés la realización de estudios que permitan determinar fehacientemente los niveles de probabilidad de estos eventos, y así tener estimaciones de riesgo con menores niveles de incertidumbre. Al comparar las estimaciones de biomasa perdida a nivel centro de cultivo entre zonas, se observa que la zona con el mayor riesgo corresponde la zona del estuario de Reloncaví, seguida por las zonas de Castro, Melinka y Aysén, las que comparten los mismo valores estimados, mientras que la zona Hornopirén es la zona que presentaría el menor riesgo derivado de la transmisión de este agente. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 76

79 En el caso del estuario de Reloncaví la mayor estimación obtenida se debe por una parte a la diversidad de especies silvestres capturadas en dicha zona (9 especie), y por otra a que en la mayoría de estas se detectó la presencia del agente con frecuencias relativamente altas en varias de ellas, lo que actúa aumentando la probabilidad de la transmisión desde peces silvestres hacia poblaciones de cultivo. El hecho de que la zona de Aysén tenga estimaciones similares a las de Castro dice relación con la mayor diversidad de peces silvestres detectada en dicha área (9 especies), la cual, dadas la distribución de probabilidades utilizada para modelar la probabilidad de positividad de estas (distribución beta, la que otorga un valor a priori de probabilidad, aunque no se registre ocurrencia del evento), hace que aumente la probabilidad de la transmisión desde peces silvestres. En el caso de Melinka, la similitud de sus estimaciones con las de Castro dice relación con que en 2 de las 4 especies de las especies silvestres capturadas se presentaron frecuencias de positividad altas, lo que aumenta la probabilidad de transmisión hacia poblaciones cultivadas. El menor valor estimado en la zona de Hornopirén tiene relación con que en solamente 1 especie silvestre de las 7 capturadas en dicha zona se detectó el agente, el cual además estuvo en baja frecuencia, determinando una probabilidad de transmisión baja. Tabla 38. Pérdidas estimadas de biomasa (Ton) a nivel de centro de cultivo producto de la transmisión de P. salmonis desde peces silvestres Zona Percentil 2,5 Media Percentil 97,5 Estuario 0, , , Castro 0, , , Hornopirén 0, , , Melinka 0, , , Aysén 0, , , Análisis de Sensibilidad En base al método de correlación de Spearman, se estimó la correlación de las variables del modelo de análisis de riesgo con las pérdidas estimadas de biomasa producto de un brote de piscirickettsiosis en un centro de cultivo a partir de la transmisión desde un pez silvestre. Estos resultados se grafican para cada una de las zonas en las Figuras 24, 25, 26, 27 y 28. En todas las zonas las principales variables relacionadas con el riesgo de transmisión de P. salmonis entre peces silvestres y de cultivo fueron el porcentaje de jaulas afectadas y la mortalidad en un brote, la probabilidad de brote en un centro de cultivo no inmunizado, la probabilidad de enfermedad (diseminación) en un pez silvestre y la probabilidad de infección de un salmónido de cultivo. Por lo tanto, el esclarecimiento de estas últimas variables (las que fueron estimadas en base a opinión de expertos) en base a metodologías que disminuyan la subjetividad de su estimación (como la INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 77

80 realización de ensayos experimentales o estudios anatomopatológicos en estas poblaciones) pasa a ser de gran importancia. El impacto de la probabilidad de positividad de las especies capturadas varía entre zonas, presentando en general valores de correlación bajos, sobre todo para el caso del róbalo y pejerrey, estando esto último dado por la baja frecuencia de positividad en estas especies. Figura 24. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en el estuario de Reloncaví. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 78

81 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 INST IT UT O DE F OM ENT O PESQUERO / DIVISIÓN INVESTIGACIÓN EN ACUICULTURA Pérdidas totales centro brote SRS Hornopirén Coeficiente de correlación (jerarquía de Spearman) Mortalidad brote SRS 0,59 % Jaulas afectadas 0,45 Peso brote 0,31 Probabilidad enfermedad en pez silvestre 0,25 Probabilidad infección salmónido cultivo 0,24 Probabilidad brote centro no inmunizado 0,19 Nº Jaulas en un centro de mar 0,13 Probabilidad chancharro (+) 0,12 Nº peces/jaula 0,10 Probabilidad bonito (+) 0,10 Probabilidad cabrilla (+) 0,09 Probabilidad blanquillo (+) 0,08 Probabilidad pejerrey (+) 0,06 Probabilidad rollizo (+) 0,06 Probabilidad róbalo (+) 0,00 Valor del coeficiente Figura 25. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en Hornopirén. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 79

82 Figura 26. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en Castro. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 80

83 Figura 27. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en Melinka. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 81

84 Figura 28. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de P. salmonis en Aysén. Gestión del riesgo Dados los resultados aquí presentados, parece más adecuado centrar las medidas mitigación del riesgo (programas de vigilancia y control) en medidas que tiendan a disminuir la susceptibilidad de los peces cultivados a presentar brotes de esta enfermedad, sobre todo considerando, además, que el contacto de estas poblaciones con peces silvestres es en la práctica inevitable. En esta línea se pueden mencionar el desarrollo de vacunas de eficacia probada en condiciones de campo, y medidas de manejo que tiendan a disminuir la susceptibilidad de los salmónidos cultivados a este agente (como disminuir las densidades de cultivo y eventos estresantes que puedan afectar a estas poblaciones). INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 82

85 Objetivo 3 Establecer zonas en base a los resultados del análisis de riesgo en la transmisión de EAR Zonificación de las áreas estudiadas A partir de los resultados del análisis de riesgo desarrollado en el presente proyecto, se han definido de forma preliminar dos grupos de zonas: Zonas de alto riesgo, el que incluye a la zona del estuario del Reloncaví. Siendo esta zona en la que se estimaron las mayores pérdidas de biomasa producto de la transmisión de P. salmonis. Zonas de bajo riesgo, que incluye a aquellas en las que se obtuvieron estimaciones más bajas, específicamente a las zonas de Hornopirén, Castro, Melinka y Puerto Aysén. Sin embargo, cabe mencionar que para el desarrollo de un sistema de zonificación que entregue mayor confianza a la hora de asignar recursos en programas de vigilancia y control, basados en el riesgo, se debe contar mayor cantidad de puntos de muestreo, tanto en el espacio como en el tiempo, con el objetivo de cubrir la mayor parte de las zonas de cultivo y alcanzar una mayor representatividad dentro de ellas. Además se hace necesario el obtener mejores estimadores de la probabilidad de ocurrencia de ciertos eventos que fueron estimados de manera subjetiva en el presente análisis. Por lo anterior se estima que para el diseño del Programa de Vigilancia es más apropiado en esta etapa trabajar con el estudio de Factores de Riesgo y datos de prevalencias obtenidas en los peces silvestres por zona (Figura 30). También es necesario obtener mayores antecedentes sobre la efectividad de las vacunas aplicadas en la actualidad y sobre el nivel de aplicación en la industria, con el objetivo de poder desarrollar modelos que incorporen esta variable. Otro punto a considerar es el desarrollo de programas de muestreo dirigido que puedan estimar la presentación de enfermedades en poblaciones asilvestradas, dado el bajo nivel de capturas de este tipo de peces obtenido en el presente estudio. Con todo, el modelo de análisis de riesgo aquí planteado entrega una metodología sobre la cual trabajar para el desarrollo de sistemas de vigilancia basados en el riesgo, además de identificar importantes brechas en el conocimiento relativo a la interacción en la interfaz entre poblaciones de peces silvestres, asilvestradas, y de cultivo. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 83

86 Figura 29. Prevalencia anual de P. salmonis en muestras de peces silvestres capturados en torno a centros decultivo ubicados en (A) la región de Los Lagos y (B) Región de Aysén. Figura 30. Zonificación en base al análisis de riesgo de las zonas de estudio. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 84

87 Objetivo 4: Elaborar una propuesta de vigilancia/monitoreo sanitaria para peces asilvestrados/silvestres e identificar medidas de mitigación Validación de sistema de vigilancia propuesto en el proyecto Obtención de Muestras: A. Zonas de Muestreo: La metodología del presente proyecto consistió en el monitoreo de 1 centro de cultivo por ACS en torno al cual se realizó la Pesca de Investigación utilizando 2 distancias de muestreo proximidad y lejanía. De los resultados obtenidos se desprende que el sistema de monitoreo propuesto debe corregirse de modo que los resultados puedan ser considerados representativos de un ACS y no de la condición puntual de un centro de cultivo. Lo anterior se respalda en que al aplicar un análisis de correlación entre la condición sanitaria de ACS, versus los resultados derivados de este proyecto, no existe correlación positiva entre la conducta de los resultados en relación a los reportes de brotes informados por las empresas a SERNAPESCA para el patógeno pesquisado y sin embargo, si se presentó una correlación positiva entre la presencia de brote de enfermedad previo o durante los muestreos con diagnósticos positivos en el centro de cultivo con los diagnósticos efectuados en peces silvestres. Se propone ampliar los puntos de muestreo en al menos 3 áreas de pesca distintas dentro de la ACS en torno a centros de cultivo con diferente condición sanitaria. Por otro lado, acogiendo antecedentes presentado por la Dra. Sandra Marín de la Universidad Austral, quien planteó que en el caso de estudios de parásitos en poblaciones silvestres, se utilizan estaciones de monitoreo Control, las que se establecen en zonas donde no existe cultivo de especies salmonídeas, de manera de discriminar si la existencia del parásito en la población silvestre es atribuible a la presencia de centros de cultivo y modificaciones en las dinámicas ecológicas de las poblaciones o si efectivamente lo observado es atribuible a la población en estudio. Por lo anterior expuesto, se sugiere incorporar una estación de monitoreo en la zona de Concepción dónde no existe cultivo de especies salmonídeas. El universo geográfico a Vigilar deberá definirse en función del Objetivo del Programa de Vigilancia y los recursos asignados. B. Especies de Peces objetivo: El presente proyectó consideró como especies objetivo los salmónidos asilvestrados (O. mykiss, O. kisutch, Salmo salar, Salmo trutta fario) y como especies silvestres objetivo Odontesthes regia y Eleginops Maclovinus como se observa en la Figura 31, las que habían sido previamente descritas como las especies dominantes en torno a los centros de cultivo de especies salmonídeas en trabajos anteriores (FIP N ). INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 85

88 Blanquillo Bonito Brótula Cabrilla Chancharro Congrio Jurel Lenguado Merluza Pampanito Pejegallo Pejerrey Róbalo Rollizo Salmon Salmón del Tollo Trucha Trucha INST IT UT O DE F OM ENT O PESQUERO / DIVISIÓN INVESTIGACIÓN EN ACUICULTURA N de pooles/especie N de pooles 0 Figura 31. Distribución de pooles por especie derivados de la Pesca de Investigación en torno a los centro de cultivo Considerando la ecuación que determina la fuerza de infección en una población (Reno, 1998): Fuerza de Infección= x I x S Donde: : Coeficiente de transmisión del agente. I : Frecuencia de contacto entre individuos infectados. S : número de individuos susceptibles. Al existir un mayor número de ejemplares de róbalo y pejerrey en torno a los centros de cultivo, se desprende que el valor de I para esta población es mayor, por ende la probabilidad de infección es mayor independiente de la direccionalidad de esta. De los resultados del presente proyecto se desprende que las especies objetivo previamente definidas corresponden a las especies dominantes, sin embargo se hace necesario revisar las artes de pesca utilizadas en función de los recursos destinados al programa de vigilancia a fin de mejorar el número de ejemplares de especies salmonídeas capturados. Antecedentes recientes publicados por González et al. 2011, quienes ejecutaron pesca de investigación para monitorear la presencia del virus ISAv en poblaciones silvestres indican que la captura de especies salmónidas sólo ascendió al 0,9% de los ejemplares capturados de un total de 121 individuos. Sus resultados indican que no se detectó el agente viral en las especies salmonídeas INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 86

89 O.mykiss, O. kisutch y Salmo trutta fario, y que sólo se detectó en uno de los 11 ejemplares capturados de la especie Salmo salar la presencia de ISAv HPR7b variedad descrita como altamente patogénica. Lo anterior es argumento suficiente para incorporar nuevas metodologías de pesca más eficientes en la búsqueda y captura de salmónidos asilvestrados y a su vez incorporar dentro del Programa, información relacionada con los escapes de peces salmónidos desde las unidades de cultivo con el objetivo de orientar los muestreos en función de l riesgo. C. Procesamiento de muestras y tipo de muestra: Originalmente este proyecto contemplaba la toma de muestras de órganos (riñón, corazón, hígado y bazo) y su análisis individualizando el tejido de origen, sin embargo este procedimiento multiplicaba el número de muestras a analizar, por lo que se desarrollaron pruebas para evaluar si el resultado derivado de un pool de órganos era comparable con el análisis de los tejidos individualizados. En relación a los tejidos donde se detectó la presencia de P.salmonis, se observó que el órgano más frecuente donde se detectó esta bacteria fue el bazo, seguido del corazón y riñón, respectivamente. El órgano donde se detecto con menor frecuencia esta bacteria fue el hígado. Cabe destacar que al analizar las mismas muestras en pool de órganos los resultados positivos son correspondientes en términos de pooles positivos con los resultados derivados del análisis por tejidos individualizados (Figura 32 y Figura 33). Por otro lado en relación al procesamiento de la muestra y cadena de frío utilizada para la conservación de las muestras, se corrobora que la conservación de los tejidos en RNA later o etanol absoluto para biología molecular y su posterior congelación a -80ºC es un método que no degrada la calidad de los RNA o DNA presentes en la muestra, dado que la totalidad de las muestras analizadas presentaron señal y Ct para los genes reporteros evaluados. Por lo anterior se propone que se mantenga la muestra conformada por riñón, corazón, hígado y bazo, exceptuand o la Pesca de ejemplares salmónidos en que la muestra incluiría Branquias y no consideraría el Hígado, la cual deberá ser conservada en etanol absoluto para biología molecular a -80ºC, conservante que puede ser utilizado en la preservación de ácidos nucleicos y que ha demostrado ser efectivo en la conservación de la integridad del RNA de forma similar al RNA latter (Vincek, 2003), a su vez la conservación de las muestras en etanol es mencionada como una alternativa en la norma técnica Nº 1 procedimientos para el muestreo de peces para el diagnóstico de enfermedades numeral En relación al análisis de las muestras será ejecutado conformando pooles de órganos de los ejemplares individualizados a fin de ampliar el número de análisis por zona y optimizar el tiempo de entrega de resultados. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 87

90 P.salmonis / B-actina P.salmonis / B-actina INST IT UT O DE F OM ENT O PESQUERO / DIVISIÓN INVESTIGACIÓN EN ACUICULTURA Cuantificación resultados positivos P.salmonis HPP1 HPP2 HPP3 HPP4 HPP5 HPP9 HPP10 Identificación de Pool Figura 32. Cuantificación relativa de resultados positivos a P.salmonis Lote Nº 1 de muestras ACS Nº 17 por pool de órganos. Cuantificación resultados positivos P.salmonis por tejido dentro de Pool Bazo Bazo Corazón Riñón Corazón Corazón Bazo Bazo Riñón Hígado HPP1 HPP2 HPP3 HPP4 HPP5 HPP9 HPP10 Identificación de Pool Figura 33. Cuantificación relativa de resultados positivos a P.salmonis Lote Nº 1 de muestras ACS Nº 17 abierto por tejido. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 88

91 Análisis de las muestras: A. Patógenos objetivo de la Vigilancia: En el presente proyecto las muestras fueron analizadas para los patógenos Exóticos: OMV, IHN, EHN, VHS y Alphavirus como a su vez para patógenos Endémicos: ISAV, Aeromonas salmonicida, Vibrio ordalii y P.salmonis. La totalidad de los ejemplares capturados fueron evaluados para la totalidad de los patógenos, independiente de la especie de pez y la descripción de susceptibilidad indicada por la OIE para los patógenos en cuestión, lo anterior, por considerarse dentro de los objetivos de este proyecto el efectuar un Catastro de la presencia/ausencia de EAR en peces silvestres/asilvestrados de las zonas en estudio. Los resultados indican que la totalidad de las muestras analizadas son negativas para patógenos exóticos y sólo el agente P.salmonis fue detectado por medio de PCR, dado lo anterior no es posible discriminar si se trata de una infección o un hallazgo, para esto deben necesariamente utilizarse otras técnicas diagnósticas ya sea aislamiento bacteriano o cultivo celular, histología y tinción, IFAT de cortes histológicos entre otros. Desde el punto de vista de la optimización de los recursos y la orientación del programa de Vigilancia hacia los factores que presentan un mayor riesgo y mayores consecuencias, se hace necesario a la luz de los resultados el definir la susceptibilidad de las especies silvestres pesquisadas a los agentes endémicos detectados en este trabajo y otros recientemente publicados, es decir P.salmonis e ISAV, con el objetivo de orientar la direccionalidad de los eventos de diagnósticos de forma de otorgar un rol a las poblaciones silvestres dentro de las posibles rutas de transmisión de patógenos en el ecosistema acuícola. La Figura 34, representa las potenciales vías de interacción y establecimiento de enfermedades en el ecosistema acuático. En este sentido es importante el conocer el rol y la magnitud de cada uno de los componentes que lo integran, particularmente dado el importante rol otorgado a las poblaciones silvestres en la emergencia de nuevas enfermedades, es así como, se sugiere la utilización de metodologías diagnósticas que permitan el desarrollo efectivo de una línea base respecto a los patógenos presentes en las poblaciones silvestres que comparten nicho con los centros de cultivo, como lo indican las directrices la comunidad económica Europea (EC, 2006); dado que las enfermedades presentes en las poblaciones silvestres no necesariamente son aquellas consideradas en los programas de enfermedades notificables. La Vigilancia en especies silvestres, tiene mayor relevancia al considerar su rol en la posible emergencia de enfermedades en la producción acuicultora. Es así como se hace imprescindible la generación de información que permita predecir escenarios y desarrollar análisis de riesgo en relación a la emergencia de enfermedades en los sistemas de cultivo (EC, 2006). INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 89

92 Dentro de la información relevante a considerar se encuentran elementos de la transmisión de los patógenos, distribución geográfica, existencia de información previa a la emergencia, detección de mutaciones de los agentes patógenos por adaptación a los sistemas intensivos y nuevos hospederos entre otros. Respecto a lo anterior es relevante el considerar que actualmente existe información al respecto, sin embargo se encuentra fragmentada (Figura 35), por lo anterior expuesto es relevante dentro de un programa de Vigilancia orientado a las poblaciones silvestres, la consolidación de la información actualmente disponible a nivel nacional e internacional, diferenciando las fuentes de ingreso, e identificar con claridad los tópicos vacíos, a modo de favorecer y focalizar los recursos en esta dirección. La consolidación de la información a su vez permite contar con una base de datos contemporánea y consolidada, a fin de no perder tiempo en la búsqueda ni esfuerzos en el desarrollo de información preexistente y de esta forma tener respuestas rápidas a las situaciones de emergencia a modo de implementar las medidas de mitigación del riesgo correspondientes (EFSA, 2007). INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 90

93 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 91

94 Figura 34. Fuentes de información disponibles organizadas por score de calidad (Rodgers, 2009). La existencia de agentes infecciosos no identificados en poblaciones de peces en cultivo o silvestres tiene consecuencias no dimensionadas al transportar especies o sus productos. Esto ocurre normalmente en las poblaciones silvestres en que es común la presentación de cuadros subclínicos o crónicos o no se representa en brotes con mortalidades masivas debido a que los individuos enfermos son rápidamente removidos de la población por predación, sin embargo la concentración en estos ecosistemas de las actividades de acuicultura incrementa el riesgo de ocurrencia de eventos de emergencia de enfermedades con desarrollo de brotes y mortalidades que atentan contra la sustentabilidad de la esta actividad productiva (Bondad-Reantaso and Subasinghe, 2008). INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 92

95 ECOSISTEMA ACUICOLA Centros de Cultivo Peces Poblaciones Silvestres Peces RILES Plantas de Proceso Derivados como carnada RISES Enfermedades Emergentes AVES Figura 35. Potenciales vías de introducción y establecimiento de enfermedades en peces en ecosistema acuícola (Rodgers, 2007). Dado lo anterior se propone orientar el Programa de Vigilancia/ Monitoreo en dos líneas, Vigilancia de enfermedades exóticas y endémicas en poblaciones de salmonídeos asilvestrados y vigilancia de enfermedades endémicas y descripción de nuevos patógenos presentes en las poblaciones de peces silvestres en torno a los centros de cultivo. B. Método diagnósticos: La vigilancia de las enfermedades exóticas en salmonideos, se ejecutará utilizando las metodologías ya implementadas en este proyecto, es decir PCR real time o PCR convencional utilizando como gen reportero el 18Sr o Elf-1. En el caso de los patógenos endémicos tanto para silvestres como para salmónidos asilvestrados, la vigilancia considerará el PCR y la conservación de contramuestras para la realización de cortes histológicos e inmunohistoquímica con el objetivo de definir si los patógenos pesquisados son un hallazgo o efectivamente los ejemplares están cursando una infección (Derivado del Taller de Expertos ad-hoc). INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 93

96 La vigilancia de nuevos patógenos presentes en las poblaciones de peces silvestres en torno a los centros de cultivo, debe orientarse a contestar las preguntas planteadas por el comité de salud animal de la comunidad económica Europea: Mecanismos de Transmisión de los patógenos. Distribución geográfica. Desarrollo de información previa a la emergencia, Detección de mutaciones de los agentes patógenos por adaptación a los sistemas intensivos Detección de nuevos hospederos. En este sentido las metodologías para abordar esta Vigilancia deberán ser muestreos dirigidos con menor número de muestras hacía las poblaciones dominantes en torno a los centros de cultivo realizando cultivos bacterianos en medios no selectivos y cultivos celulares en diferentes líneas celulares tanto de salmonídeos como de otras especies (CHSE-214, BF-2, PAS (Fernández et al, 1993)). Los esfuerzos en esta dirección, deberán idealmente ser desarrollados por Universidades, laboratorios diagnósticos o Institutos de Investigación, no conformando parte del financiamiento del programa de Vigilancia, si será parte integral del programa de vigilancia el desarrollar listados con las investigaciones faltantes a la luz de las revisiones y monitoreos del programa de vigilancia Diseño de propuesta de vigilancia/monitoreo Derivado de los resultados del proyecto se cuenta con la información suficiente para indicar que las especies objetivo serán róbalos, pejerreyes y salmonídeos dada su dominancia en torno a los centros de cultivo en los dos primeros casos y su relevancia epidemiológica en el caso de los salmonídeos. Dado que no se encontró ningún patógeno exótico en las poblaciones silvestres y asociado a que existe un soporte científico que indica la no susceptibilidad de especies no salmonídeas a estas enfermedades, exceptuando VHS (OIE, 2009) sumado a que no hay reportes para estos agentes derivados del programa de vigilancia activa para salmonideos del Servicio Nacional de Pesca, a la fecha de cierre de los muestreos de este informe, se estima que no es prioritario el monitoreo de estos agentes en las poblaciones de Odontesthes regia y Eleginops maclovinus, caracterizadas en este estudio como las especies dominantes en torno a los centros de cultivo. Las zonas monitoreadas en este estudio consistieron en la ACS 1, ACS 10, ACS 17, ACS 18 y ACS 28, dentro de las cuales se identificó como las áreas con un score que indica un significativo incremento del riesgo sólo asociado al área, y no a los otros factores de riesgo incorporados en el análisis multivariado, se encuentran en orden de importancia la Zona de Hornopirén o ACS 17 con 21.8% mayor de probabilidad de riesgo de presentación de detección de P.salmonis en las INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 94

97 poblaciones silvestres y la Zona del Estuario de Reloncaví con un 4.3% mayor de probabilidad de riesgo de detección de P.salmonis en las poblaciones silvestres. Dado este resultado derivado del estudio de Factores de Riesgo se establece que: Los muestreos deberán tener una mayor frecuencia en las ACS 17 y ACS 1. El n muestreal a considerar en estas zonas por cada campaña cerrada, corresponderá a 150 peces o pooles. La pesca deberá ejecutarse al menos en 3 puntos georreferenciados diferentes en torno a centros de cultivo con distinta condición sanitaria (brote, sin brote, descanso) Deberá contarse con la información contemporánea de los centros de cultivo respecto a la presentación de brotes. Las muestras positivas deberán ser secuenciadas y comparadas con la secuencia de aislados positivos derivados de los centros de cultivo del área. En relación a la temporalidad, la época de primavera fue en la que se capturó un menor número de peces en relación a los esfuerzos de muestreo, dado esto se establece que: Los muestreos deberán realizarse principalmente en la temporada de Otoño y Verano. Es relevante contar con una base de datos ambiental de la zona en estudio particularmente data de temperatura contemporáneos a los muestreos. El número de esfuerzos de muestreo necesario para alcanzar el n comprometido de 150 análisis o peces por zona se cumplió en promedio en 5 salidas, sin embargo, cabe destacar que las salidas efectuadas en el periodo de primavera tuvieron en algunos casos un rendimiento no significativo en el número de ejemplares capturados, por lo que al concentrar los esfuerzos de captura en el periodo de Otoño- Verano el número de salidas a considerar podría disminuir a 4 o 3 salidas por Zona. Las artes de pesca o sistemas apropiados para orientar la captura a especies salmonídeas asilvestradas debe ser consultadas entre expertos en temas pesqueros, se sugiere tomar como referencia el sistema diseñado para recaptura de peces salmonídeos derivado del Proyecto FIP Nº , titulado, evaluación de la posición trófica y la eficiencia de los métodos de recaptura en salmónidos escapados de centros de cultivo. El arte de pesca seleccionado para realizar las experiencias de recaptura de salmónidos corresponde a una red de cerco con cierre vertical (Figura 36). INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 95

98 Figura 36. Esquema de red de cerco con cierre vertical. Este diseño contempla, como características principales, una dimensión de relinga superior de 61 m, de relinga inferior/vertical de 118 m, 660 flotadores M70 y 300 plomos de 250 g. En relación al tipo de tela utilizada, la construcción de esta fue en paño torcido sin nudo, con una titulación 210/36, lo que se traduce en peso seco total de la red de 266 Kg y sumergido de 56 Kg. Para este tipo de actividad, cumple cabalmente con los requerimientos en relación al menor volumen de este en su estiba, menor resistencia al flujo y menor daño al pez en el proceso de recaptura, producto de la inexistencia del nudo. En la Figura 37 se puede apreciar un ejemplo de red de cerco con cierre vertical, observándose sus principales componentes, tales como tela (paños), flotadores, relinga de plomos, plomos, refuerzos, patas de gallo, anillas y jareta. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 96

99 Figura 37. (a) Red de cerco de cierre vertical. (b) Flotadores de la red de cerco. (c) Relinga de plomos y pesos de la red de cerco. (d) Anillas y patas de gallo de la red. Calado de la red de cerco vertical Este procedimiento se inicia con el traspaso del puntero a la embarcación auxiliar (o segunda embarcación), este puntero es un cabo de 12 mm que está unido a uno de los extremos de la red (donde se unen la relinga de flotadores con la relinga de plomos). De esta forma la embarcación auxiliar comienza a tirar la red a través de él y la segunda embarcación o auxiliar, funciona como un ancla de mar activa en el calado. Una vez entregado este cabo y con la embarcación auxiliar trabajando, la red cae al agua con ayuda del personal de la embarcación principal, que va calando tela y flotadores para facilitar su salida de la embarcación. El calado se inicia en forma paralela y en la misma dirección de la corriente para facilitar que el cerco tome la forma de trabajo deseada. Virado del arte de cerco cierre vertical: Una vez cerrada la llave y con todas las anillas arriba de la embarcación, se procede a iniciar el virado de la red, para subirla completamente a la embarcación principal y dejarla preparada y correctamente adujada para un eventual nuevo lance. Esta etapa se inicia al subir uno de los extremos de la red y comenzar virar la tela, los flotadores y los plomos. En esta etapa se sugiere que INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 97

100 tres personas estén virando sólo tela. De lo anterior se requiere que un operario esté virando los flotadores y otro vire la relinga de plomos, así en total con 5 personas involucradas en la operación, el izado de la red demora un tiempo aproximado de 12 minutos. Tópicos a definir dentro del diseño del Programa de Vigilancia de Especies silvestres/asilvestradas: A) Nivel de riesgo aceptado en función de los objetivos del programa. Catastro de estatus sanitario de las poblaciones silvestres (patógenos endémicos y nuevos patógenos) Vigilancia de Patógenos exóticos en poblaciones asilvestradas en función de los resultados de vigilancia del PVA SERNAPESCA. Vigilancia de patógenos endémicos en poblaciones asilvestradas en función de los resultados del programa de Vigilancia pasiva SERNAPESCA. B) Definir la direccionalidad (1 o 2) del programa para orientar los recursos: Evaluar el rol de las poblaciones silvestres en la diseminación de enfermedades de importancia comercial (De cultivo a silvestres). Catastro y monitoreo de los patógenos presentes en las poblaciones silvestres y el riesgo que presentan para los cultivos acuícolas (De silvestres a cultivo) Identificación de Puntos Críticos por Zona En este punto se toma como base la matriz conceptual presentada en el estudio de factores de riesgo que considera la revisión bibliográfica y la opinión de los expertos citados. Se considera que el mayor punto crítico es el incremento de la población susceptible Diseño de propuesta de medidas de mitigación. Conclusiones derivadas de la consulta a Expertos: La principal medida de mitigación es el incremento de la inmunidad de masa por medio de vacunas eficientes aplicadas al mayor porcentaje de la población de forma de disminuir el número de susceptibles afectando la dinámica de la enfermedad. Lo anteriormente descrito es respaldado por Reno 1998 en que establece un modelo para evaluar los factores que inciden sobre las consecuencias de la introducción de un patógeno en una población. La ecuación es: INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 98

101 Fuerza de Infección= x I x S Al disminuir el número de susceptibles se disminuye la fuerza de infección en la población. El manejo de las densidades dentro de las Jaulas de cultivo como a su vez, dentro de ACS, es relevante, ya que al incrementar las densidades, se aumenta el valor de I, frecuencia de contacto entre los individuos lo que produce una mayor fuerza de infección en la población. Otra forma de disminuir la fuerza de infección es modulando el factor de una enfermedad, en este caso las variables a considerar son: Factores de resistencia del huésped: o coeficiente de transmisión Cultivo diferencial en función de la susceptibilidad de la especie (Ej: ISAV en trucha) Inmunidad Natural (Utilización de inmunoestimulantes) Mejoramiento genético de las especies (Resistencia a patógenos) Monitoreo de la alimentación (Disminuir la perdida de alimento asociado a la Jaula de Cultivo) Otras medidas descritas en programas extranjeros y publicaciones científicas. Sacrificio. Esta medida consiste en la eliminación de los stocks susceptibles en un área, es una forma activa de controlar el número de hospederos en las poblaciones (Grenfell y Dobson, 1995). Utilizada también por Dinamarca en su programa de Control de VHS, por medio de pesca eléctrica se realiza la captura de poblaciones de trucha asilvestradas con el objetivo de disminuir la población susceptible. La misma medida es aplicable a condiciones de cultivo en caso de brotes de enfermedad. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 99

102 5. CONCLUSIONES 1. El análisis de las capturas derivadas de la campaña de muestreo, indica que para todas las áreas de Concesiones de Salmonicultoras (ACS), la especie con mayor cantidad de ejemplares es el róbalo, seguida del pejerrey. 2. En relación a la distribución de las capturas por ACS de las especies capturadas, se puede apreciar que de las 19 especies capturadas, las principales corresponden a peces de las especies róbalo y pejerrey, las que representan en conjunto alrededor del 70% de los peces capturados durante el periodo de estudio. 3. En términos de pooles de peces analizados, estas mismas especies representan el 60% de los análisis. En cuanto a los salmónidos capturados (salmón coho, salmón del Atlántico, trucha arcoiris y trucha fario), la participación de estos fue baja, representando en conjunto el 2,6% de los peces capturados y el 3,9% de los pooles analizados. 4. Por otro lado, en relación a la diversidad de especies por ACS, se encuentra que el ACS 28, Fiordo Aysén, es la que presenta una mayor diversidad de especies capturadas incorporándose la merluza común a las principales especies capturadas en torno a los centros de cultivo, además del róbalo y el pejerrey. 5. La mayor cantidad de peces capturados se produjo entre los meses de diciembre del 2010 y enero del 2011, la que coincide con el mayor número de esfuerzos de pesca. El coeficiente de correlación entre la cantidad de peces capturados y los esfuerzos de pesca realizados en cada mes fue de 0,89, lo que indicaría que la cantidad de peces capturados estaría asociada principalmente al Nº de salidas de pesca realizadas durante el periodo de estudio, lo anterior se relaciona necesariamente con las características del periodo (Diciembre Enero), el que por ser época de verano, presenta las mejores condiciones del tiempo para la ejecución de las actividades de muestreo. 6. En el caso de los salmónidos las capturas fueron esporádicas y escasas, siendo las especies con mayor cantidad de capturas el salmón coho (17), la trucha fario (11) y la trucha arcoiris (9), capturándose sólo dos ejemplares de salmón del Atlántico, ambos asociados a la ACS 10 y con un factor de condición promedio de 0,01, por lo que se desprende que su condición fisiológica era bastante baja. 7. Las ACS desde donde se capturaron especies salmonídeas corresponden a Estuario de Reloncaví (salmón coho y trucha arcoiris), Castro (trucha arcoiris y salmón del Atlántico), Hornopirén (trucha arcoiris) y Aysén (salmón coho y trucha Fario). Melinka no registró capturas de especies salmonídeas. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 100

103 8. Cabe destacar que de los dos salmones del Atlántico capturados, uno presentaba un factor de condición (Fulton, 1902) de 1,25 indicando una buena condición fisiológica. El otro ejemplar capturado presentó un FC de 0,11 reflejo de una mala condición corporal. 9. Par las tres especies de salmónidos capturados se observa que la trucha fario y el salmón coho son los que presentan mejor factor de condición con valores de 1,23 y 1,32 respectivamente, la trucha arcoiris presenta factores de condición de 0,95 promedio y los salmones del Atlántico de 0,5, de lo anterior se infiere que las especies que presentaron mejor condición corporal fueron el salmón coho y la trucha fario, seguido por la trucha arcoiris. 10. Los controles positivos se recibieron por parte de IFOP, en condiciones de integridad del material genético de los agentes patógenos, lo que permitió utilizarlos para el montaje e implementación de las metodologías en el Laboratorio de Biología Molecular. 11. El diseño del gen reportero de róbalo, permitió el montaje e implementación de una técnica de PCR, que permite contar con un gen reportero interno para esta especie. 12. El diseño y montaje de una metodología de PCR para un gen universal para las especies derivadas de las capturas de este estudio, permitirá en un futuro contar con una herramienta de control interno transversal entre especies capturadas, para respaldar los resultados obtenidos y efectuar una cuantificación relativa. 13. Los resultados de la totalidad de las muestras ingresadas resultaron negativas a la detección para ISAV, Alfavirus, V. ordalii, Aeromonas salmonicida, IHNV, EHNV y VHS independiente de la zona y especie. Sólo se presentaron resultados positivos a P. salmonis, correspondientes a 51 pooles de peces. 14. La totalidad de los resultados de laboratorio obtenidos, tanto por el laboratorio subcontratado como por el LBM-IFOP, están respaldados por un resultado positivo del control interno, indicador de la integridad de las muestras. 15. El diseño de un control interno universal (18Sr), permitirá contar con respaldos de los análisis negativos en el contexto del diseño del programa de Vigilancia y Control de EAR en peces silvestres/asilvestrados, tanto para PCR tiempo real como para PCR convencional. 16. Los resultados derivados del análisis en pool de órganos, y de órganos por separado entrega, un 100% de coincidencia en los pooles que resultaron positivos, lo que respalda la propuesta de diseño de programa de vigilancia de análisis de las muestras en pool de órganos para mejorar la velocidad de entrega de resultados. 17. La mayor frecuencia de muestras positivas a P. salmonis fue en el estuario del Reloncaví, con un total de 28 pooles positivos, equivalentes a alrededor del 19% de los pooles analizados. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 101

104 18. Las especies con mayor frecuencia relativa de positividad a P. salmonis fueron el congrio y pampanito, con valores de prevalencia de 20%, seguidos de la brótula, lenguado y trucha arcoiris, con valores en torno al 11,1%, siendo esta última la única especie salmonídea que presentó positividad a este agente. Estos resultados se deben al bajo n de capturas de estas especies asociado a la presencia de muestras positivas. 19. El róbalo y el pejerrey, presentan prevalencias más bajas que las especies anteriores (dentro de su categoría), sin embargo, representan el mayor número de los resultados positivos a este agente, aportando con valores de 2,76% y 1,38%, respectivamente, a la prevalencia general de 6,41%. 20. En todas las zonas las principales especies que determinan la prevalencia son el róbalo y el pejerrey, representando el 50% o más de los pooles positivos a P. salmonis, existiendo también una participación importante de la cabrilla, el chancharro y el rollizo, sobre todo en la zona del estuario del Reloncaví, donde estas especies en conjunto representan alrededor del 36% de los pooles positivos de la zona. 21. Los resultados de la secuenciación de las muestras nos permiten señalar que las muestras indicadas como positivas utilizando el protocolo LBM-PS2 implementado en el laboratorio de Biología Molecular de IFOP, se confirman como positivas dado que el producto de PCR obtenido de las distintas muestras, presenta un alto porcentaje de identidad con las secuencias de cepas de Piscirickettsia salmonis disponibles en las base de datos NCBI. 22. Como resultado de los alineamientos por BLAST, se evidencia que los aislados de peces silvestres en su mayoría tienen un mayor score y porcentaje de identidad con la cepa irlandesa IRE-99D ingresada al banco de genes con el código AY , correspondiente a una cepa de Salmón del Atlántico aislada en el año Los peces positivos a P.salmonis son en general más pequeños y con un menor factor de condición que los peces negativos, sin embargo estas diferencias son estadísticamente significativas sólo en el caso de los róbalos (p 0.05). 24. Derivado del estudio de factores de riesgo se desprende que las variables que presentaron una asociación incondicional con la positividad a P.salmonis del pool de peces analizados, fueron la zona donde se ubicaba el centro muestreado, la especie capturada, la presentación de brotes de piscirickettsiosis en el periodo previo, o durante el muestreo. 25. Con respecto a los factores de riesgo, la zona en la que se ubicaba el centro en torno al cual se realizó el muestreo, se observa que para el estuario de Reloncaví y Hornopirén se presentan 4,3 y 21,8 veces más probabilidades de presentar pooles positivos de peces capturados en torno a un centro de cultivo. 26. La presentación de brotes de piscirickettsiosis en el periodo previo o durante el muestreo es un factor de riesgo que incide en que la probabilidad de que un pool de peces capturados en INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 102

105 torno al centro sea positivo a P. salmonis, 9 veces mayor con respecto a centros que no reportaron brotes o que se encontraban en descanso sanitario al momento del muestreo. 27. En el caso del factor de condición, a medida que aumenta el valor de éste, la probabilidad de que el pool sea positivo al agente disminuye, por ende peces en mejores condiciones corporales tendrían menor probabilidad de infectarse o presentar resultados de PCR positivos. 28. La única variable que presentó una asociación significativa con la prevalencia a nivel de zona de pooles positivos a P. salmonis fue el peso promedio de los peces, presentando una asociación negativa con la prevalencia a nivel de zona. 29. Respecto a la información epidemiológica de cada ACS, se observa que el número de brotes ocurridos en el barrio durante el periodo y la temperatura promedio del agua de la zona durante el año 2009, tienen una asociación positiva con la prevalencia del agente en las poblaciones silvestres analizadas. 30. Del análisis de riesgo se desprende que la cantidad estimada de biomasa perdida producto de la transmisión de P. salmonis desde peces silvestres al centro de cultivo, tiene un impacto marginal, con valores en que el 97,5% de las veces no superarían los 1,6 Kg de biomasa. 31. Este bajo impacto que tendría la infección con P. salmonis en peces silvestres sobre las poblaciones cultivadas dice relación con los bajos niveles de probabilidad asignados por el panel de expertos a los eventos relativos al riesgo de transmisión del agente desde los peces silvestres. Por lo tanto es de interés la realización de estudios que permitan determinar fehacientemente los niveles de probabilidad de estos eventos, y así tener estimaciones de riesgo con menores niveles de incertidumbre. 32. Al comparar las estimaciones de biomasa perdida a nivel centro de cultivo entre zonas derivadas del análisis de riesgo, se observa que la zona con el mayor riesgo corresponde la zona del estuario de Reloncaví 33. A partir de los resultados del análisis de riesgo desarrollado en el presente proyecto, se han definido de forma preliminar dos grupos de zonas (de alto y bajo riesgo), considerando el riesgo de perdidas de biomasa a consecuencia de una infección de cultivo por peces silvestres. 34. La zona de alto riesgo, considera el estuario del Reloncaví. Siendo esta zona en la que se estimaron las mayores pérdidas de biomasa producto de la transmisión de P. salmonis. 35. Como zonas de bajo riesgo, se incluyen a aquellas en las que se obtuvieron estimaciones más bajas, específicamente a las zonas de Hornopirén, Castro, Melinka y Puerto Aysén. 36. Se considera, a la luz de la falta de antecedentes concretos y a la estimación de probabilidad implícita dentro del análisis de riesgo para los eventos analizados, más apropiado considerar INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 103

106 los resultados derivados del estudio de factores de riesgo (datos cuantitativos), que pueden ser más orientadores en el diseño del Programa de Vigilancia de EAR en peces silvestres/asilvestrados. 37. Es necesario consolidar la información disponible en relación a las enfermedades y patógenos presentes en las poblaciones de peces silvestres/asilvestrados en torno a los centros de cultivo, de manera de orientar la investigación a resolver los vacíos de conocimiento actualmente existentes, que impiden el desarrollo de un análisis de riesgo a cabalidad. 38. A la luz de los antecedentes científicos revisados para el presente informe, se considera de alta relevancia el desarrollar un programa estable de Vigilancia de enfermedades y patógenos en peces silvestres/asilvestrados como parte de la vigilancia integral de los sistemas acuáticos vinculados a la actividad acuicultora, dada su relevancia en la emergencia de enfermedades. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 104

107 6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS Bell A.; de Roode J.C.; Sim D.; Read A.F Within- host competition in genetically diverse malaria infections: parasite virulence and competitive sucess. Evolution 60: Bondad-Reantaso, M.G. and Subasinghe, R.P Meeting the future demand for aquatic food through aquaculture: the role of aquatic animal health. In: Fisheries for Global Welfare and Environment, 5th World Fisheries Congress, K. Tsukamoto, T. Kawamura, T. Takeuchi, T.D. Beard, Jr. and M.J. Kaiser (eds), Byers H.K.; Gudkovs N.;Crane M. St. J PCR-based assays for the fish pathogen Aeromonas salmonicida. I. Evaluation of three PCR primer sets for detection and identification. Dis Aqua Org 49: Collet B; Munro E. S; Galhawat S; Acosta F; García J; Roemelt C; Zou J; Secombes C.J.; Ellis A.E Infectious pancreatic necrosis virus suppresses type I interferon signalling in rainbow trout gonad cell line but not in Atlantic salmon macrophages. Fish and Shellfish immunology 22: Corbeil S.; Hyatt A.D.; Crane M St. J Characterissation of an emerging rickettsia-like organism in Tasmanian farmed Atlantic salmon Salmo salar. Dis Aquat Org 64: Cunningham,CO, Snow,M Genetic analysis of infectious salmon anaemia virus (ISAV) from Scotland. Dis Aquat Org 41:1 8 Dohoo, I., Martin, W., Stryhn, H Veterinary epidemiologic research. Segunda edición. Editorial VER Inc. Prince Edward Island, Canadá. 865 pp. European Commission (EC) Council Directive 2006/88/EC of 24 October 2006 on animal health requirements for aquaculture animals and products thereof, and on the prevention and control of certain diseases in aquatic animals. OJEU, , L 328/ EFSA Scientific Opinion of the Panel on Animal Health and Welfare on a request from the European Commission on possible vector species and live stages of susceptible species not transmitting disease as regards certain fish diseases. The EFSA Journal, 534, Fernandez R.D.; Yoshimizu M.; Kimura T.; Ezura Y Characterization of Three Continuous Cell Lines from Marine Fish. J. of Aquatic. Animal Health 5: INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 105

108 FIP N Catastro de enfermedades de peces nativos circundantes a centros de cultivo de salmónidos. Fulton, T. W The rate of growth of fishes. 20th Annual Report of the Fishery Board of Scotland 1902 (3): Gandon S.; Jansen V.A.; Van Baalen, M Host Life History and the evolution of parasite virulence. Evolution 55: Gónzalez R.R.; Ruiz P.; Llanos Rivera A.; Cruzat F.; Silva J.; Astuya A.; Grandón M.; Jara D.; Aburto C ISA virus outside the cage: Ichthyofauna and other possible reservoirs to be considered for marine biosafety managment in the far southern ecosystem of Chile. Aquaculture 318: Grenfell B.T.; Dobson P.A Ecology of infectious diseases in natural populations. The Newton institute, Cambridge, UK. Hungnes,O, Jonassen,TØ, Jonassen,CM, Grinde,B Molecular epidemiology of viral infections: how sequence information helps us understand the evolution and dissemination of viruses. APMIS 108:81 97 InfoStat InfoStat, versión Manual del Usuario. Grupo InfoStat, FCA, Universidad Nacional de Córdoba. Primera Edición, Editorial Brujas Argentina. Joint Goverment/Industry Working Group, 2000 Marshall S.; Heath S.; Henríquez V.; Orrego C Minimally invasive detection of Piscirickettsia salmonis in cultivated salmonidis via the PCR. Appl Environ Microbiol 64: Mauel M.J.; Giovannoni S.J.; Fryer J.L Development of polymerase chain reaction assays for detection, identification and differentiation of Piscirickettsia salmonis. Dis Aquat Org 26: Nylund, A, Jakobsen, P Sea Trout as a carrier of infectious salmon anemia virus. J Fish Biol 47: OIE Manual of diagnostic Test for Aquatic Animals. OIE Aquatic Animal Health code. Plarre,H, Devold, M, Snow,M, Nylund,A Prevalence of infectious salmon anaemia virus (ISAV) in wilde salmonids in western Norway. Dis Aquat Org Vol. 66: INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 106

109 Pulkkinen K.; Suomalainen L.R.; Read A.F.; Ebert D.; Rintamäki P.; Valtonen T Intensive Fish farming and the evolution of pathogen virulence: The case of columnaris disease in Finland. Proc. R. Soc. B 277: Raynard,RS, Murray,AG, Gregory,A Infectious salmon anaemia virus in wild fish from Scotland. Dis Aquat Org 46: Reid H.I; Griffen A.A.; Birbeck H.T Isolates of Piscirickettsia salmonis from Scotland and Ireland Show Evidence of Clonal Diversity. Appl. Env. Microbiol. Vol 70, 7: Reno P Factors Involved in the Dissemination of Disease in Fish Populations. Journal of. Aquat. Anim. Health 10: Rodgers, C.J Risk analysis of exotic, emerging and re-emerging disease hazards: Identification of the most significant hazards for European aquatic animals. In: Permanent network to strengthen expertise on infectious diseases of aquaculture species and scientific advice to EU policy (PANDA). Final Report, 78 pp. Rodgers C.J.; Roque A.; López M Inventory of data sources relevant for the identification of emerging diseases in the European aquaculture population. (NP/EFSA/AMU/2009/02) Accepted for Publication on 16 December Saaty, T The Analytic Hierarchy Process. McGraw-Hill. Sciara A.; Rubiolo J.A.; Somoza G.M.; Arranz S.E Molecular cloning, expression and Immunological characterization of pejerrey (Odontesthes bonariensis) growth hormone. Comparative Biochemestry and Phisiology Part C 142: Sepúlveda F.; Marín S.L.; Carvajal J Metazoan parasites in wild fish and farmed salmon from aquaculture sites in southern Chile. Aquaculture 235: Servicio Nacional de Pesca, Informe Sanitario. Servicio Nacional de Pesca, Norma Técnica Nº3/07/2009 de la unidad de acuicultura del Servicio Nacional de Pesca: Procedimientos para la validación y control de calidad de los métodos de PCR utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos Shrag S. ; Wiener P Emerging infectious disease: what are the relative roles of ecology and evolution?. Tree 10: INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 107

110 Stagg,R, Bruno,D, Cunningham,C, Hastings,T, Bricknell,I Infectious salmon anaemia in Scotland: epizootiology and pathology. State Vet J 9: 1 5 Vesalovic J., Koeuth T. and R. Lupski J., Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucl. Aci. Res. 19, 24: Vose, D Risk analysis. A quantitative guide. 2nd Edition. John Wiley & Sons, Ltd. Great Britain. Vincek V, Nassiri M, Knowles J, Nadjii M, Morales A Prservation of Tissue RNA in Normal Saline. Laboratory investigation, 83, 1: INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES. 108

111 ANEXOS

112 ANEXO 1 Muestreo y procesamiento de Muestras

113 Figura 1. Procedimiento de desinfección de embarcaciones en distintas ACS. (A, B, C y D). INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 1

114 Figura 2. Ejemplares capturados en pesca de investigación: A) Róbalo, B) Rollizo, C) Chancharro, D) Blanquillo, E) Pejerreyes. Figura 3. Procedimiento de Pesca, viraje del Arte de Pesca. (A, B y C) INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 1

115 Figura 4. Ejemplares previos procedimiento de necropsia y toma de muestras. Figura 5. Ejemplares previo al procedimiento de necropsia y toma de muestras. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 1

116 Figura 6. Procesamiento de muestras. (A, B, C y D) Necropsia de los ejemplares y zonas de procesamiento de muestras. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 1

117 Figura 7. Procesamiento de muestras. (A, B, C y D) Conformación de pooles para ingreso a LBM INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 1

118 ANEXO 2 Certificados de eliminación de material biológico

119 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 2

120 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 2

121 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 2

122 ANEXO 3 Certificados de Controles Positivos

123 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 3

124 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 3

125 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 3

126 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 3

127 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 3

128 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 3

129 ANEXO 4 Protocolos LMB - IFOP

130 Código: LBM - BP Protocolo PCR convencional B-actina Odontesthes regia Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE B-ACTINA Odontesthes regia. Página 1 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la detección y cuantificación del gen B-actina de la especie Odontesthes regia mediante PCR convencional. 2. Alcance Este procedimiento, es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1 Sciara A.; Rubiolo J.A.; Somoza G.M.; Arranz S.E Molecular cloning, expression and Immunological characterization of pejerrey (Odontesthes bonariensis) growth hormone. Comparative Biochemestry and Phisiology Part C 142: LAB/NT3/ Procedimientos para la validación y control de calidad de los Métodos de reacción en cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos, Sernapesca. 4. Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar el envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis de al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Actividad INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.1

131 Código: LBM - BP Protocolo PCR convencional B-actina Odontesthes regia Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE B-ACTINA Odontesthes regia. Página 2 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación El método de PCR se realiza utilizando los partidores indicados en las citas en termociclador convencional a partir de una muestra de cdna de tejidos de pejerrey y se visualiza en un gel de agarosa al 2% teñido con syber safe gel stain. 6.1 Equipos y Materiales Termociclador Vortex Microcentrífuga refrigerada Micropipetas de volumen regulable p1000, p200, p20, p Material de vidrio de uso general Tubos eppendorf de 1.5 ml libres de nucleasas Tubos PCR 0.5 ml Cámara de electroforesis Traniluminador Fuente de poder Termoblock Ultraturrax 6.2 Reactivos Etanol absoluto para biología molecular Agarosa Tae 1X Kit de extracción de RNA (AyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Axygen)) Kit de elaboración de cdna (affinityscript QPCR cdna Síntesis Kit (Stratagene) Kit de PCR (Econotaq Plus Green (Lucigen) syber safe gel satín (Invitrogen ) Agua libre de nucleasas Agua desionizada 6.4. Estándares Estándar de peso molecular de 1000pb (Fermentas) Preparación de las muestras INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.1

132 Código: LBM - BP Protocolo PCR convencional B-actina Odontesthes regia Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE B-ACTINA Odontesthes regia. Página 3 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Las muestras de tejido de aproximadamente 0.5 cm 2 mantenidas en etanol absoluto de biología molecular a -80ºC son homogeneizadas utilizando un ultraturrax utilizando el vástago plástico del kit de extracción y la solución de lisis del kit Las muestras homogeneizadas deben ser sometidas a una temperatura de 70ºC por 1 minuto en un termoblock, en el caso de que se observen grumos de tejido sin homogeneizar Seguir el protocolo de extracción de RNA del fabricante (Axygen) Cuantificar el RNA mediante la medición de absorbancia a 260nm y la pureza de la extracción mediante el cálculo de la razón 260/280 en el espectofotometro Epoch Tomar el volumen necesario para llegar a 10 ng de RNA y agregar 3 µl de oligo dt, 1 µl de RNAsa Block y el volumen necesario de agua libre de nucleasas para completar 20 µl Poner los tubos en el termociclador a 42ºC por 5 minutos Finalizado el ciclo poner los tubos inmediatamente en hielo y agregar 10 µl de master mix e iniciar el ciclo de 55ºC por 60 minutos y una posterior fase de extensión final de 70ºC por 15 minutos Condiciones de PCR Partidores: Especie Foward Reverse Gen pesquisado Pejerrey 5 -CGG- AAC- CGC- TCA- TTG-CC-3 5 -ACC- CAC- ACT- GTG- CCC- ATC- TA-3 B-actina Agregar a un tubo de PCR de 0.5 µl 12.5 µl de master mix Econataq Plus green 2X, 1 µl de cada primer a una concentración de 25 µm, 2µl de templado y completar el volumen con Agua libre de nucleasas hasta 25 µl Llevar los tubos en hielo al termociclador y ejecutar una denaturación inicial de 94ºC por 2 min y luego 35 ciclos de: 94ºC por 30 segundos 52ºC por 30 segundos 72ºC por 30 segundos Finalmente una Extensión final de 72ºC por 7 minutos INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.1

133 Código: LBM - BP Protocolo PCR convencional B-actina Odontesthes regia Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE B-ACTINA Odontesthes regia. Página 4 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 6.8 Cálculo de Resultados: Una vez ejecutado el PCR las muestras mantenidas en hielo deben ser cargadas en un gel de agarosa TAE 1x al 2% teñido con Syber Safe según las instrucciones del fabricante. Las muestras deben ser corridas por 1 hora a 100 volts y posteriormente visualizadas en un transiluminador con radiación UV. Las bandas son cuantificadas a través del sistema Image J. Los resultados deben corresponder a una banda de 400 pb Control de calidad Se ha establecido que todas las muestras de RNA deben ser cuantificadas previamente al desarrollo del RT-PCR de forma de siempre utilizar 10 ng de RNA para cada reacción Los resultados deben ser uniformes en relación a la expresión del gen en las distintas muestras para cada tejido Cada reacción será comparada con su respectivo control positivo (muestra conocida) y control negativo (cdna sin contenido de RNA) En caso de existir bandas en los controles negativos los reactivos deben ser chequedos y las reacciones repetidas posteriormente Expresión de resultados Expresar en positivo y negativo en caso de existir o no la presencia de una banda del peso molecular esperado. Se utilizará el valor otorgado por el sistema Image J para tratar de cuantificar la cantidad de patógeno presente en la muestra según la cantidad el gen constitutivo Límite de detección (LD): El límite de detección es 10 ng de RNA. 7. Documentación Planilla de trabajo de Laboratorio Informe de Resultados 8. Anexos No aplica. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.1

134 Protocolo Extracción de RNA a partir de muestras de tejido (Axyxen) 1.- Seleccionar 20-40mg de tejido animal. Agregar 400ul de Buffer R-I a un tubo eppendorf de 1,5 ml y moler rápida y vigorosamente hasta que el tejido y el buffer estén completamente mezclados. 2.- Transferir el homogenizado a un tubo de 1,5 ml 3.- Agregar 150 ul de Buffer R-II y realizar un vortex por seg. 4.- Centrifugar a 12000g por 5 min. a 4 C para sedimentar el DNA y Proteínas. 5.- Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml y agregar 250 ul de Isopropanol mezclar con un vortex. 6.- Montar la columna en el tubo de 2ml y transferir la solución del paso anterior a la columna. 7.- Centrifugar a 6000 g por 1min a temperatura ambiente o a 4 C (descartar el filtrado). 8.- Poner la columna nuevamente en el tubo de 2ml. 9.-Agregar 500ul de Buffer W1A y centrifugar a g por 1 min. (descartar el sobrenadante) Agregar 700 ul de Buffer W2 y centrifugar a g por 1min (descartar el sobrenadante). 11.-Repetir el paso anterior. 12.-Transferir la columna a un tubo eppendorf de 1,5 ml. 13.-Agregar 100 ul de Buffer TE (libre de nucleasas) Esperar 1 min. a temperatura ambiente Centrifugar a g por 1min Guardar el eluido a -80 C INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.2

135 Protocolo Extracción de DNA a partir de muestras de tejido (Axygen) 1.-Seleccionar 1-20mg de tejido animal pre-enfriado en hielo, moler rápida y vigorosamente hasta formar un homogenizado. 2.- Agregar a la muestra de tejido 350ul de PBS, luego 0,9 ul de RNasa A mezclar suavemente por 30 seg. Hasta mezclar homogéneamente el PBS con el tejido sedimentado. 3.- Tomar el homogenizado y transferirlo a un tubo de 2 ml. 4.- Agregar 20ul de Proteinasa K y 150 ul de Buffer C-L, mezclar inmediatamente por vortex durante 1min. 5.- Incubar a 56 C por 10 min. Centrifugar brevemente para remover las gotas desde el interior de la tapa. 6.- Agregar 350ul de Buffer P-D a la muestra y mezclar por vortex a velocidad máxima por 30 seg. 7.- Centrifugar a g por 10 min. a temperatura ambiente para sedimentar los restos celulares. 8.-Montar la columna en un tubo de 2ml, transferir el sobrenadante obtenido del paso anterior. 9.- Centrifugar a g por 1 min Descartar el filtrado, colocar la columna en un tubo de 2ml 11.- Agregar 500ul de Buffer W1 a la columna y centrifugar a 12000g por 1 min Descartar el filtrado y colocar la columna nuevamente en el tubo de 2ml. Agregar 700ul de Buffer W2 y centrifugar por 1min.a 12000g Descartar el filtrado y repetir el lavado con 700ul de Buffer W2 14.-Colocar la columna en un tubo de 1,5 ml limpio, para eluir el DNA genómico agregar ul de Eluente o agua desionizada (calentar el agua o el eluente a 65 C) 15.-Esperar 1 min. a temperatura ambiente y centrifugar a g por 1min. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.3

136 Código: LBM PS1 Protocolo PCR convencional Eubacterias Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE 16S DE EUBACTERIAS Página 1 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la detección y cuantificación del gen constitutivo 16SEubacterias en especies salmonídeas y no salmonídeas. 2. Alcance Este procedimiento, es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1 OIE 2003, Manual of diagnostic Test for Aquatic Animals. Capítulo : LAB/NT3/ Procedimientos para la validación y control de calidad de los Métodos de reacción en cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos, Sernapesca. 4. Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar el envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis de al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Actividad El método de PCR se realiza utilizando los partidores publicados en el Manual OIE, Equipos y Materiales Termociclador Vortex Microcentrífuga refrigerada Micropipetas de volumen regulable p1000, p200, p20, p Material de vidrio de uso general Tubos eppendorf de 1.5 ml libres de nucleasas Tubos PCR 0.5 ml Cámara de electroforesis Traniluminador Fuente de poder Termoblock Ultraturrax INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.4

137 Código: LBM PS1 Protocolo PCR convencional Eubacterias Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE 16S DE EUBACTERIAS Página 2 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 6.2 Reactivos Etanol absoluto para biología molecular Agarosa Tae 1X Kit de extracción de DNA (AyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Axygen)) Kit de PCR (Econotaq Plus Green (Lucigen) Syber safe gel stain (Invitrogen) Agua libre de nucleasas Agua desionizada 6.4. Estándares Estándar de peso molecular de 1000pb (Fermentas) Preparación de las muestras Las muestras de tejido de aproximadamente 0.5 cm 2 mantenidas en etanol absoluto de biología molecular a -80ºC son homogeneizadas utilizando un ultraturrax utilizando el vástago plástico del kit de extracción y la solución de lisis del kit Las muestras homogeneizadas deben ser sometidas a una temperatura de 70ºC por 1 minuto en un termoblock, en el caso de que se observen grumos de tejido sin homogeneizar Seguir el protocolo de extracción de DNA indicado por el fabricante del Kit (Axygen) Cuantificar el DNA mediante la medición de absorbancia a 260nm y la pureza de la extracción mediante el cálculo de la razón 260/ Condiciones de PCR Partidores: Patógeno Foward Reverse Gen pesquisado Eubacteria 5 - ACG-GAT-ACC-TTG-TTA-CGA-GTT-3 5 -AGA-GTT-TGA-TCC-TGG-CTC-AG-3 16S Agregar a un tubo de PCR de 0.5 µl 12,5 µl de master mix Econataq Plus green 2X, 1 µl de cada primer a una concentración de 25 µm, 2µl de templado y completar el volumen con Agua libre de nucleasas hasta 25 µl Llevar los tubos en hielo al termociclador y ejecutar una denaturación inicial de 95ºC por 3 min y luego 35 ciclos de: 95ºC 60 segundos 45 ºC 60 segundos 72 ºC 60 segundos INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.4

138 Código: LBM PS1 Protocolo PCR convencional Eubacterias Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE 16S DE EUBACTERIAS Página 3 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Finalmente una Extensión final de 72ºC por 5 minutos 6.8 Cálculo de Resultados: Una vez ejecutado el PCR las muestras mantenidas en hielo deben ser cargadas en un gel de agarosa TAE 1x al 2% teñido con Gel red según las instrucciones del fabricante. Las muestras deben ser corridas por 1 hora a 100 volts y posteriormente visualizadas en un transiluminador con radiación UV. Las bandas son cuantificadas a través del sistema Image J. Los resultados deben corresponder a una banda de 470 pb Control de calidad Se ha establecido que todas las muestras de DNA deben ser cuantificadas previamente al desarrollo del PCR de forma de siempre utilizar 10 ng de DNA para cada reacción Los resultados deben ser uniformes en relación a la expresión del gen reportero en las distintas muestras para cada tejido Cada reacción será comparada con su respectivo control positivo (muestra conocida) y control negativo (PCR sin templado) En caso de existir bandas en los controles negativos los reactivos deben ser chequeados y las reacciones repetidas posteriormente Expresión de resultados Deben ser expresados como positivos o negativos en caso de existir o no la presencia de una banda del peso molecular esperado. Se utilizará el valor otorgado por el sistema Image J para tratar de cuantificar la cantidad de patógeno presente en la muestra según el valor correspondiente al gen reportero de la especie analizada para normalizar los resultados Límite de detección (LD): El límite de detección es 10ng de DNA. 7. Documentación Planilla de trabajo de Laboratorio Informe de Resultados 8. Anexos No aplica. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.4

139 Código: LBM 28SR Protocolo PCR convencional 28Sr Eleginops maclovinus (Róbalo) Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE 28S ribosomal de Eleginops maclovinus (Róbalo) Página 1 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la detección y cuantificación del gen 28S de la especie Eleginops maclovinus (Róbalo) mediante PCR convencional. 2. Alcance Este procedimiento, es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1 Lecointre,G., Bonillo,C., Ozouf-Costaz,C. and Hureau,J.C Molecular evidence for the origins of Antarctic fishes: paraphyly of the Bovichtidae and no indication for the monophyly of the Notothenioidei (Teleostei). Polar Biol. 18 (3), LAB/NT3/ Procedimientos para la validación y control de calidad de los Métodos de reacción en cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos, Sernapesca. 4. Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar el envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis de al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Actividad El método de PCR se realiza utilizando los partidores diseñados a partir de la secuencia publicada en bajo el código U correspondiente a 432 del gen 28S ribosomal de Róbalo, la reacción se desarrolla en termociclador convencional a partir de una muestra de cdna de tejidos de Róbalo y se visualiza en un gel de agarosa al 1% teñido con syber safe. 6.1 Equipos y Materiales Termociclador Vortex Microcentrífuga refrigerada Micropipetas de volumen regulable p1000, p200, p20, p Material de vidrio de uso general Tubos eppendorf de 1.5 ml libres de nucleasas Tubos PCR 0.5 ml Cámara de electroforesis INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.5

140 Código: LBM 28SR Protocolo PCR convencional 28Sr Eleginops maclovinus (Róbalo) Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE 28S ribosomal de Eleginops maclovinus (Róbalo) Página 2 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Traniluminador Fuente de poder Termoblock Ultraturrax 6.2 Reactivos Etanol absoluto para biología molecular Agarosa Tae 1X Kit de extracción de RNA (AyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Axygen)) Kit de elaboración de cdna (affinityscript QPCR cdna Síntesis Kit (Stratagene) Kit de PCR (Econotaq Plus Green (Lucigen) Syber safe (Invitrogen) Agua libre de nucleasas Agua desionizada 6.4. Estándares Estándar de peso molecular de 1000pb (Fermentas) Preparación de las muestras Las muestras de tejido de aproximadamente 0.5 cm 2 mantenidas en etanol absoluto de biología molecular a -80ºC son homogeneizadas utilizando un ultraturrax utilizando el vástago plástico del kit de extracción y la solución de lisis del kit Las muestras homogeneizadas deben ser sometidas a una temperatura de 70ºC por 1 minuto en un termoblock, en el caso de que se observen grumos de tejido sin homogeneizar Seguir el protocolo de extracción de RNA del fabricante Cuantificar el RNA mediante la medición de absorbancia a 260nm y la pureza de la extracción mediante el cálculo de la razón 260/280 en un espectofotometro Epoch Tomar el volumen necesario para llegar a 10 ng de RNA y agregar 3 µl de oligo dt, 1 µl de RNAsa Block y el volumen necesario de agua libre de nucleasas para completar 20 µl Poner los tubos en el termociclador a 42ºC por 5 minutos Finalizado el ciclo poner los tubos inmediatamente en hielo y agregar 10 µl de master mix e iniciar el ciclo de 55ºC por 60 minutos y una posterior fase de extensión final de 70ºC por 15 minutos Condiciones de PCR INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.5

141 Código: LBM 28SR Protocolo PCR convencional 28Sr Eleginops maclovinus (Róbalo) Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE 28S ribosomal de Eleginops maclovinus (Róbalo) Página 3 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Partidores: Especie Foward Reverse Gen pesquisado Róbalo 1 5"-AGG-ATC-TCC-TCG-TGG-GAC-CTC-TC-3" 5"-ACG-GAG-CAC-TTT-GTC-CAC-GG-3" 28Sr Agregar a un tubo de PCR de 0.5 µl 12,5 µl de master mix Econataq Plus green 2X, 1 µl de cada primer a una concentración de 25 µm, 2µl de templado y completar el volumen con Agua libre de nucleasas hasta 25 µl Llevar los tubos en hielo al termociclador y ejecutar una denaturación inicial de 95ºC por 3 min y luego 35 ciclos de: 95ºC por 60 segundos 60ºC por 60 segundos 72ºC por 60 segundos Finalmente una Extensión final de 72ºC por 5 minutos 6.8 Cálculo de Resultados: Una vez ejecutado el PCR las muestras mantenidas en hielo deben ser cargadas en un gel de agarosa TAE 1x al 1% teñido con Gel red según las instrucciones del fabricante. Las muestras deben ser corridas por 30 minutos a 100 volts y posteriormente visualizadas en un transiluminador con radiación UV. Las bandas son cuantificadas a través del sistema Image J. Los resultados deben corresponder a una banda de 195 pb Control de calidad Se ha establecido que todas las muestras de RNA deben ser cuantificadas previamente al desarrollo del RT-PCR de forma de siempre utilizar 10 ng de RNA para cada reacción Los resultados deben ser uniformes en relación a la expresión del gen en las distintas muestras para cada tejido Cada reacción será comparada con su respectivo control positivo (muestra conocida) y control negativo (cdna sin contenido de RNA) En caso de existir bandas en los controles negativos los reactivos deben ser chequedos y las reacciones repetidas posteriormente Expresión de resultados Deben ser expresados como positivos o negativos en caso de existir o no la presencia de una banda del peso molecular esperado. Se utilizará el valor otorgado por el sistema Image J para tratar de cuantificar la cantidad de patógeno presente en la muestra según el valor correspondiente al gen reportero de la especie analizada para normalizar los resultados. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.5

142 Código: LBM 28SR Protocolo PCR convencional 28Sr Eleginops maclovinus (Róbalo) Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE 28S ribosomal de Eleginops maclovinus (Róbalo) Página 4 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Límite de detección (LD) y límite de cuantificación (LC): El límite de detección es 10ng de RNA. 7. Documentación Planilla de trabajo de Laboratorio Informe de Resultados 8. Anexos No aplica. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.5

143 Código: LBM ASA Protocolo PCR convencional Aeromona salmonicida atípica Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE Aeromona salmonicida atípica Página 1 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la detección y cuantificación de Aeromona salmonicida atípica en especies salmonideas y no salmonideas. 2. Alcance Este procedimiento, es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1 Byers H.K.; Gudkovs N.;Crane M. St. J PCR-based assays for the fish pathogen Aeromonas salmonicida. I. Evaluation of three PCR primer sets for detection and identification. Dis Aqua Org 49: LAB/NT3/ Procedimientos para la validación y control de calidad de los Métodos de reacción en cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos, Sernapesca. 4. Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar el envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis de al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Actividad El método de PCR se realiza utilizando los partidores publicados por Byers et al, Equipos y Materiales Termociclador Vortex Microcentrífuga refrigerada Micropipetas de volumen regulable p1000, p200, p20, p Material de vidrio de uso general Tubos eppendorf de 1.5 ml libres de nucleasas Tubos PCR 0.5 ml Cámara de electroforesis Traniluminador Fuente de poder INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.6

144 Código: LBM ASA Protocolo PCR convencional Aeromona salmonicida atípica Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE Aeromona salmonicida atípica Página 2 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Termoblock Ultraturrax 6.2 Reactivos Etanol absoluto para biología molecular Agarosa Tae 1X Kit de extracción de DNA (AyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Axygen)) Kit de PCR (Econotaq Plus Green (Lucigen) Syber safe (Invitrogen) Agua libre de nucleasas Agua desionizada 6.4. Estándares Estándar de peso molecular de 1000pb (Fermentas) Preparación de las muestras Las muestras de tejido de aproximadamente 0.5 cm 2 mantenidas en etanol absoluto de biología molecular a -80ºC son homogeneizadas utilizando un ultraturrax utilizando el vástago plástico del kit de extracción y la solución de lisis del kit Las muestras homogeneizadas deben ser sometidas a una temperatura de 70ºC por 1 minuto en un termoblock, en el caso de que se observen grumos de tejido sin homogeneizar Seguir el protocolo de extracción de DNA indicado por el fabricante del KIT Cuantificar el DNA mediante la medición de absorbancia a 260nm y la pureza de la extracción mediante el cálculo de la razón 260/280 utilizando un espectofotometro Epoch Biotek Condiciones de PCR Partidores: Patógeno Foward Reverse Gen pesquisado AS atípica CGTTGGATATGGCTCTTCCT CTCAAAACGGCTGCGTACCA AS INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.6

145 Código: LBM ASA Protocolo PCR convencional Aeromona salmonicida atípica Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE Aeromona salmonicida atípica Página 3 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Agregar a un tubo de PCR de 0.5 µl 12,5 µl de master mix Econataq Plus green 2X, 1 µl de cada primer a una concentración de 25 µm, 2µl de templado y completar el volumen con Agua libre de nucleasas hasta 25 µl Llevar los tubos en hielo al termociclador y ejecutar una denaturación inicial de 94ºC por 2 min y luego 30 ciclos de: 94ºC 30 segundos 60 ºC 30 segundos 72 ºC 60 segundos Finalmente una Extensión final de 72ºC por 5 minutos 6.8 Cálculo de Resultados: Una vez ejecutado el PCR las muestras mantenidas en hielo deben ser cargadas en un gel de agarosa TAE 1x al 1% teñido con Syber Safe según las instrucciones del fabricante. Las muestras deben ser corridas por 1 hora a 100 volts y posteriormente visualizadas en un transiluminador con radiación UV. Las bandas son cuantificadas a través del sistema Image J. Los resultados deben corresponder a una banda de 470 pb Control de calidad Se ha establecido que todas las muestras de DNA deben ser cuantificadas previamente al desarrollo del PCR de forma de siempre utilizar 10 ng de DNA para cada reacción Los resultados deben ser uniformes en relación a la expresión del gen reportero en las distintas muestras para cada tejido Cada reacción será comparada con su respectivo control positivo (muestra conocida) y control negativo (PCR sin DNA) En caso de existir bandas en los controles negativos los reactivos deben ser chequeados y las reacciones repetidas posteriormente Expresión de resultados Deben ser expresados como positivos o negativos en caso de existir o no la presencia de una banda del peso molecular esperado. Se utilizará el valor otorgado por el sistema Image J para cuantificar la cantidad del patógeno presente en la muestra según valor otorgado al gen reportero de la especie analizada para normalizar los resultados Límite de detección (LD): El límite de detección es 10ng de DNA. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.6

146 Código: LBM ASA Protocolo PCR convencional Aeromona salmonicida atípica Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE Aeromona salmonicida atípica Página 4 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 7. Documentación Planilla de trabajo de Laboratorio Informe de Resultados 8. Anexos No aplica. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.6

147 Código: LBM BO Protocolo PCR convencional B-actina Onchorynchus mykiss/kisutch Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE B-ACTINA Onchorynchus mykiss/kisutch Página 1 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la detección y cuantificación del gen B-actina de las especies Onchorynchus mykiss/kisutch mediante PCR convencional. 2. Alcance Este procedimiento, es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1 Collet B; Munro E. S; Galhawat S; Acosta F; García J; Roemelt C; Zou J; Secombes C.J.; Ellis A.E Infectious pancreatic necrosis virus suppresses type I interferon signalling in rainbow trout gonad cell line but not in Atlantic salmon macrophages. Fish and Shellfish immunology 22: LAB/NT3/ Procedimientos para la validación y control de calidad de los Métodos de reacción en cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos, Sernapesca. 4. Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar el envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis de al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Actividad El método de PCR se realiza utilizando los partidores publicados en las citas en termociclador convencional a partir de una muestra de cdna de tejidos de trucha Arcoiris y se visualiza en un gel de agarosa al 2% teñido con Syber safe. 6.1 Equipos y Materiales Termociclador Vortex Microcentrífuga refrigerada Micropipetas de volumen regulable p1000, p200, p20, p10 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.7

148 Código: LBM BO Protocolo PCR convencional B-actina Onchorynchus mykiss/kisutch Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE B-ACTINA Onchorynchus mykiss/kisutch Página 2 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Material de vidrio de uso general Tubos eppendorf de 1.5 ml libres de nucleasas Tubos PCR 0.5 ml Cámara de electroforesis Traniluminador Fuente de poder Termoblock Ultraturrax 6.2 Reactivos Etanol absoluto para biología molecular Agarosa Tae 1X Kit de extracción de RNA (AyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Axygen)) Kit de elaboración de cdna (affinityscript QPCR cdna Síntesis Kit (Stratagene) Kit de PCR (Econotaq Plus Green (Lucigen) Syber Safe (Invitrogen ) Agua libre de nucleasas Agua desionizada 6.4. Estándares Estándar de peso molecular de 1000pb (Fermentas) Preparación de las muestras Las muestras de tejido de aproximadamente 0.5 cm 2 mantenidas en etanol absoluto de biología molecular a -80ºC son homogeneizadas utilizando un ultraturrax utilizando el vástago plástico del kit de extracción y la solución de lisis del kit Las muestras homogeneizadas deben ser sometidas a una temperatura de 70ºC por 1 minuto en un termoblock, en el caso de que se observen grumos de tejido sin homogeneizar Seguir el protocolo de extracción de RNA del fabricante Cuantificar el RNA mediante la medición de absorbancia a 260nm y la pureza de la extracción mediante el cálculo de la razón 260/280 utilizando un espectrofotómetro Epoch Biotek Tomar el volumen necesario para llegar a 10 ng de RNA y agregar 3 µl de oligo dt, 1 µl de RNAsa Block y el volumen necesario de agua libre de nucleasas para completar 20 µl Poner los tubos en el termociclador a 42ºC por 5 minutos Finalizado el ciclo poner los tubos inmediatamente en hielo y agregar 10 µl de master mix e iniciar el ciclo de 55ºC por 60 minutos y una posterior fase de extensión final de 70ºC por 15 minutos Condiciones de PCR INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.7

149 Código: LBM BO Protocolo PCR convencional B-actina Onchorynchus mykiss/kisutch Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE B-ACTINA Onchorynchus mykiss/kisutch Página 3 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Partidores: Especie Foward Reverse Gen pesquisado Salmón Coho/Trucha 5"-ATG-GAA-GAT-GAA-ATC-GCC- 3" 5"-TGC-CAG-ATC-TTC-TCC-ATG-3" B-actina Agregar a un tubo de PCR de 0.5 µl 12,5 µl de master mix Econataq Plus green 2X, 1 µl de cada primer a una concentración de 25 µm, 2µl de templado y completar el volumen con Agua libre de nucleasas hasta 25 µl Llevar los tubos en hielo al termociclador y ejecutar una denaturación inicial de 94ºC por 2 min y luego 30 ciclos de: 94ºC por 30 segundos 58ºC por 30 segundos 72ºC por 30 segundos Finalmente una Extensión final de 72ºC por 4 minutos 6.8 Cálculo de Resultados: Una vez ejecutado el PCR las muestras mantenidas en hielo deben ser cargadas en un gel de agarosa TAE 1x al 1% teñido con Syber Safe según las instrucciones del fabricante. Las muestras deben ser corridas por 1 hora a 100 volts y posteriormente visualizadas en un transiluminador con radiación UV. Las bandas son cuantificadas a través del sistema Image J. Los resultados deben corresponder a una banda de 259 pb Control de calidad Se ha establecido que todas las muestras de RNA deben ser cuantificadas previamente al desarrollo del RT-PCR de forma de siempre utilizar 1 ng de RNA para cada reacción Los resultados deben ser uniformes en relación a la expresión del gen en las distintas muestras para cada tejido Cada reacción será comparada con su respectivo control positivo (muestra conocida) y control negativo (cdna sin contenido de RNA) En caso de existir bandas en los controles negativos los reactivos deben ser chequeados y las reacciones repetidas posteriormente Expresión de resultados INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.7

150 Código: LBM BO Protocolo PCR convencional B-actina Onchorynchus mykiss/kisutch Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE B-ACTINA Onchorynchus mykiss/kisutch Página 4 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Expresar en positivo y negativo en caso de existir o no la presencia de una banda del peso molecular esperado. Se utilizará el valor otorgado por el sistema Image J para cuantificar la cantidad de patógeno presente en la muestra según el gen constitutivo o reportero que corresponda a cada especie Límite de detección (LD) y límite de cuantificación (LC): El límite de detección es 10ng de RNA. 7. Documentación 8. Anexos No aplica. Planilla de trabajo de Laboratorio Informe de Resultados INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.7

151 Código: LBM EHN Protocolo PCR convencional EHN Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS DE LA NECROSIS HEMATOPOYÉTICA Página 1 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. EPIZOOTICA (EHN) Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la detección y cuantificación del virus EHN en especies salmonideas y no salmonideas. 2. Alcance Este procedimiento, es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1 OIE 2009, Manual of diagnostic Test for Aquatic Animals. Capítulo : LAB/NT3/ Procedimientos para la validación y control de calidad de los Métodos de reacción en cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos, Sernapesca. 4. Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar el envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis de al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Actividad El método de PCR se realiza utilizando los partidores publicados en el Manual OIE, Equipos y Materiales Termociclador Vortex Microcentrífuga refrigerada Micropipetas de volumen regulable p1000, p200, p20, p Material de vidrio de uso general Tubos eppendorf de 1.5 ml libres de nucleasas Tubos PCR 0.5 ml Cámara de electroforesis Traniluminador Fuente de poder Termoblock Ultraturrax INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.8

152 Código: LBM EHN Protocolo PCR convencional EHN Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS DE LA NECROSIS HEMATOPOYÉTICA Página 2 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. EPIZOOTICA (EHN) Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 6.2 Reactivos Etanol absoluto para biología molecular Agarosa Tae 1X Kit de extracción de DNA (AyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Axygen)) Kit de PCR (Econotaq Plus Green (Lucigen) Syber Safe Gel Stain (Invitrogen) Agua libre de nucleasas Agua desionizada 6.4. Estándares Estándar de peso molecular de 1000pb (Fermentas) Preparación de las muestras Las muestras de tejido de aproximadamente 0.5 cm 2 mantenidas en etanol absoluto de biología molecular a -80ºC son homogeneizadas utilizando un ultraturrax utilizando el vástago plástico del kit de extracción y la solución de lisis del kit Las muestras homogeneizadas deben ser sometidas a una temperatura de 70ºC por 1 minuto en un termoblock, en el caso de que se observen grumos de tejido sin homogeneizar Seguir el protocolo de extracción de DNA indicado por el fabricante del KIT Cuantificar el DNA mediante la medición de absorbancia a 260nm y la pureza de la extracción mediante el cálculo de la razón 260/280 utilizando un espectrofotometro Epoch de Biotek Condiciones de PCR Partidores: Patógeno Foward Reverse Gen pesquisado EHN 5 - CGC-AGT-CAA-GGC-CTT-GAT-GT AAA-GAC-CCG-TTT-TGC-AGC-AGC-AAA-C- 3 3 Cápside Viral Agregar a un tubo de PCR de 0.5 µl 12,5 µl de master mix Econataq Plus green 2X, 1 µl de cada primer a una concentración de 25 µm, 2µl de templado y completar el volumen con Agua libre de nucleasas hasta 25 µl Llevar los tubos en hielo al termociclador y ejecutar una denaturación inicial de 95ºC por 3 min y luego 35 ciclos de: 95ºC por 60 segundos 55ºC por 60 segundos INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.8

153 Código: LBM EHN Protocolo PCR convencional EHN Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS DE LA NECROSIS HEMATOPOYÉTICA Página 3 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. EPIZOOTICA (EHN) Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 72ºC por 60 segundos Finalmente una Extensión final de 72ºC por 15 minutos 6.8 Cálculo de Resultados: Una vez ejecutado el PCR las muestras mantenidas en hielo deben ser cargadas en un gel de agarosa TAE 1x al 2% teñido con Syber safe según las instrucciones del fabricante. Las muestras deben ser corridas por 1 hora a 100 volts y posteriormente visualizadas en un transiluminador con radiación UV. Las bandas son cuantificadas a través del sistema Image J. Los resultados deben corresponder a una banda de 580 pb Control de calidad Se ha establecido que todas las muestras de DNA deben ser cuantificadas previamente al desarrollo del PCR de forma de siempre utilizar 10 ng de DNA para cada reacción Los resultados deben ser uniformes en relación a la expresión del gen reportero en las distintas muestras para cada tejido Cada reacción será comparada con su respectivo control positivo (muestra conocida) y control negativo (PCR sin DNA) En caso de existir bandas en los controles negativos los reactivos deben ser chequedos y las reacciones repetidas posteriormente Expresión de resultados Deben ser expresados como positivos o negativos en caso de existir o no la presencia de una banda del peso molecular esperado. Se utilizará el valor otorgado por el sistema Image J para tratar de cuantificar la cantidad de patógeno en la muestra según el valor otorgado por el gen reportero de la especie analizada Límite de detección (LD): El límite de detección es 10ng de DNA. 7. Documentación Planilla de trabajo de Laboratorio Informe de Resultados 8. Anexos No aplica.. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.8

154 Código: LBM IHN Protocolo PCR convencional IHN Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS DE LA NECROSIS HEMATOPOYÉTICA Página 1 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. INFECCIOSA (IHN) Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la detección y cuantificación del virus IHN en especies salmonídeas y no salmonideas. 2. Alcance Este procedimiento, es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1 OIE 2009, Manual of diagnostic Test for Aquatic Animals. Capítulo : OIE 2003, Manual of diagnostic Test for Aquatic Animals. Capítulo : LAB/NT3/ Procedimientos para la validación y control de calidad de los Métodos de reacción en cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos, Sernapesca. 4. Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar el envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis de al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Actividad El método de PCR se realiza utilizando los partidores publicados en el Manual OIE, Equipos y Materiales Termociclador Vortex Microcentrífuga refrigerada Micropipetas de volumen regulable p1000, p200, p20, p Material de vidrio de uso general Tubos eppendorf de 1.5 ml libres de nucleasas Tubos PCR 0.5 ml Cámara de electroforesis Traniluminador INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.9

155 Código: LBM IHN Protocolo PCR convencional IHN Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS DE LA NECROSIS HEMATOPOYÉTICA INFECCIOSA (IHN) Página 2 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Fuente de poder Termoblock Ultraturrax 6.2 Reactivos Etanol absoluto para biología molecular Agarosa Tae 1X Kit de extracción de RNA (AyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Axygen)) Kit de elaboración de cdna (affinityscript QPCR cdna Síntesis Kit (Stratagene) Kit de PCR (Econotaq Plus Green (Lucigen) Syber safe gel stain (Invitrogen) Agua libre de nucleasas Agua desionizada 6.4. Estándares Estándar de peso molecular de 100pb (Axygen) Preparación de las muestras Las muestras de tejido de aproximadamente 0.5 cm 2 mantenidas en etanol absoluto de biología molecular a -80ºC son homogeneizadas utilizando un ultraturrax utilizando el vástago plástico del kit de extracción y la solución de lisis del kit Las muestras homogeneizadas deben ser sometidas a una temperatura de 70ºC por 1 minuto en un termoblock, en el caso de que se observen grumos de tejido sin homogeneizar Seguir el protocolo de extracción de RNA del fabricante Cuantificar el RNA mediante la medición de absorbancia a 260nm y la pureza de la extracción mediante el cálculo de la razón 260/ Tomar el volumen necesario para llegar a 10 ng de RNA y agregar 3 µl de random primers, 1 µl de RNAsa Block y el volumen necesario de agua libre de nucleasas para completar 20 µl Poner los tubos en el termociclador a 42ºC por 5 minutos Finalizado el ciclo poner los tubos inmediatamente en hielo y agregar 10 µl de master mix e iniciar el ciclo de 55ºC por 60 minutos y una posterior fase de extensión final de 70ºC por 15 minutos Condiciones de PCR Partidores: Partidores seleccionados Patógeno Foward Reverse Gen pesquisado INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.9

156 Código: LBM IHN Protocolo PCR convencional IHN Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS DE LA NECROSIS HEMATOPOYÉTICA Página 3 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. INFECCIOSA (IHN) Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación IHN 5 - TTC-GCA-GAT-CCC-AAC-AAC-AA GCG-CAC-GT-GCC-TTG-GCT-3 Nucleocapside Agregar a un tubo de PCR de 0.5 µl 12,5 µl de master mix Econataq Plus green 2X, 1 µl de cada primer a una concentración de 25 µm, 2µl de templado y completar el volumen con Agua libre de nucleasas hasta 25 µl Llevar los tubos en hielo al termociclador y ejecutar una denaturación inicial de 95ºC por 2 min y luego 25 ciclos de: 95ºC por 30 segundos 50ºC por 30 segundos 72ºC por 60 segundos Finalmente una Extensión final de 72ºC por 7 minutos 6.8 Cálculo de Resultados: Una vez ejecutado el PCR las muestras mantenidas en hielo deben ser cargadas en un gel de agarosa TAE 1x al 1.5% teñido con syber safe según las instrucciones del fabricante. Las muestras deben ser corridas por 1 hora a 100 volts y posteriormente visualizadas en un transiluminador con radiación UV. Las bandas son cuantificadas a través del sistema Image J. Los resultados deben corresponder a una banda de 323 pb Control de calidad Se ha establecido que todas las muestras de RNA deben ser cuantificadas previamente al desarrollo del PCR de forma de siempre utilizar 10 ng de DNA para cada reacción Los resultados deben ser uniformes en relación a la expresión del gen reportero en las distintas muestras para cada tejido Cada reacción será comparada con su respectivo control positivo (muestra conocida) y control negativo (RT-PCR sin RNA) En caso de existir bandas en los controles negativos los reactivos deben ser chequeados y las reacciones repetidas posteriormente Expresión de resultados Deben ser expresados como positivos o negativos en caso de existir o no la presencia de una banda del peso molecular esperado. Se utilizará el valor otorgado por el sistema Image J para tratar de cuantificar la cantidad del patógeno presente en la muestra según valor otorgado por el gen reportero de la especie analizada para normalizar los resultados Límite de detección (LD): INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.9

157 Código: LBM IHN Protocolo PCR convencional IHN Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS DE LA NECROSIS HEMATOPOYÉTICA Página 4 de 4 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. INFECCIOSA (IHN) Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación El límite de detección es 10ng de RNA. 7. Documentación Planilla de trabajo de Laboratorio Informe de Resultados 8. Anexos No aplica. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.9

158 Código: LBM OMV Protocolo PCR convencional OMV Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS DEL ONCORHYNCHUS MASSOU (OMV) Página 1 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la detección y cuantificación del virus OMV en especies salmonideas y no salmonideas. 2. Alcance Este procedimiento, es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1 OIE 2003, Manual of diagnostic Test for Aquatic Animals. Capítulo : LAB/NT3/ Procedimientos para la validación y control de calidad de los Métodos de reacción en cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos, Sernapesca. 4. Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar el envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis de al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Actividad El método de PCR se realiza utilizando los partidores publicados en el Manual OIE, Equipos y Materiales Termociclador Vortex Microcentrífuga refrigerada Micropipetas de volumen regulable p1000, p200, p20, p Material de vidrio de uso general Tubos eppendorf de 1.5 ml libres de nucleasas Tubos PCR 0.5 ml Cámara de electroforesis Traniluminador Fuente de poder Termoblock Ultraturrax 6.2 Reactivos INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.10

159 Código: LBM OMV Protocolo PCR convencional OMV Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS DEL ONCORHYNCHUS MASSOU (OMV) Página 2 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Etanol absoluto para biología molecular Agarosa Tae 1X Kit de extracción de DNA (AyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Axygen)) Kit de PCR (Econotaq Plus Green (Lucigen) Syber safe (Invitrogen) Agua libre de nucleasas Agua desionizada 6.4. Estándares Estándar de peso molecular de 1000pb (Fermentas) Preparación de las muestras Las muestras de tejido de aproximadamente 0.5 cm 2 mantenidas en etanol absoluto de biología molecular a -80ºC son homogeneizadas utilizando un ultraturrax utilizando el vástago plástico del kit de extracción y la solución de lisis del kit Las muestras homogeneizadas deben ser sometidas a una temperatura de 70ºC por 1 minuto en un termoblock, en el caso de que se observen grumos de tejido sin homogeneizar Seguir el protocolo de extracción de DNA indicado por el fabricante del KIT Cuantificar el DNA mediante la medición de absorbancia a 260nm y la pureza de la extracción mediante el cálculo de la razón 260/ Condiciones de PCR Partidores: Patógeno Foward Reverse Gen pesquisado OMV 5 - GTA-CCG-AAA-CTC-CCG-AGT-C AAC-TTG-AAC-TAC-TCC-GGG-G-3 Genómico Agregar a un tubo de PCR de 0.5 µl 12,5 µl de master mix Econataq Plus green 2X, 1 µl de cada primer a una concentración de 25 µm, 2µl de templado y completar el volumen con Agua libre de nucleasas hasta 25 µl Llevar los tubos en hielo al termociclador y ejecutar una denaturación inicial de 95ºC por 3 min y luego 35 ciclos de: 95ºC 60 segundos 56 ºC 60 segundos 72 ºC 60 segundos Finalmente una Extensión final de 72ºC por 15 minutos 6.8 Cálculo de Resultados: INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.10

160 Código: LBM OMV Protocolo PCR convencional OMV Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS DEL ONCORHYNCHUS MASSOU (OMV) Página 3 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Una vez ejecutado el PCR las muestras mantenidas en hielo deben ser cargadas en un gel de agarosa TAE 1x al 2% teñido con syber safe según las instrucciones del fabricante. Las muestras deben ser corridas por 1 hora a 100 volts y posteriormente visualizadas en un transiluminador con radiación UV. Las bandas son cuantificadas a través del sistema Image J. Los resultados deben corresponder a una banda de 439 pb Control de calidad Se ha establecido que todas las muestras de DNA deben ser cuantificadas previamente al desarrollo del PCR de forma de siempre utilizar 10 ng de DNA para cada reacción Los resultados deben ser uniformes en relación a la expresión del gen reportero en las distintas muestras para cada tejido Cada reacción será comparada con su respectivo control positivo (muestra conocida) y control negativo (PCR sin DNA) En caso de existir bandas en los controles negativos los reactivos deben ser chequeados y las reacciones repetidas posteriormente Expresión de resultados Deben ser expresados como positivos o negativos en caso de existir o no la presencia de una banda del peso molecular esperado. Se utilizará el valor otorgado por el sistema Image J para tratar de cuantificar la cantidad de patógeno presente en la muestra según el valor otorgado al gen reportero de la especie analizada para normalizar los resultados Límite de detección (LD): El límite de detección es 10ng de DNA. 7. Documentación Planilla de trabajo de Laboratorio Informe de Resultados 8. Anexos No aplica.. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.10

161 Código: LBM PS2 Protocolo PCR convencional P.salmonis Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE P.salmonis Página 1 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la detección y cuantificación de P.salmonis en especies salmonideas y no salmonideas. 2. Alcance Este procedimiento, es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1 OIE 2003, Manual of diagnostic Test for Aquatic Animals. Capítulo : LAB/NT3/ Procedimientos para la validación y control de calidad de los Métodos de reacción en cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos, Sernapesca. 4. Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar el envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis de al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Actividad El método de PCR se realiza utilizando los partidores publicados en el Manual OIE, Equipos y Materiales Termociclador Vortex Microcentrífuga refrigerada Micropipetas de volumen regulable p1000, p200, p20, p Material de vidrio de uso general Tubos eppendorf de 1.5 ml libres de nucleasas Tubos PCR 0.5 ml Cámara de electroforesis Traniluminador Fuente de poder Termoblock Ultraturrax 6.2 Reactivos INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.11

162 Código: LBM PS2 Protocolo PCR convencional P.salmonis Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE P.salmonis Página 2 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Etanol absoluto para biología molecular Agarosa Tae 1X Kit de extracción de DNA (AyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Axygen)) Kit de PCR (Econotaq Plus Green (Lucigen) Syber safe (Invitrogen) Agua libre de nucleasas Agua desionizada 6.4. Estándares Estándar de peso molecular de 1000pb (Fermentas) Preparación de las muestras Las muestras de tejido de aproximadamente 0.5 cm 2 mantenidas en etanol absoluto de biología molecular a -80ºC son homogeneizadas utilizando un ultraturrax utilizando el vástago plástico del kit de extracción y la solución de lisis del kit Las muestras homogeneizadas deben ser sometidas a una temperatura de 70ºC por 1 minuto en un termoblock, en el caso de que se observen grumos de tejido sin homogeneizar Seguir el protocolo de extracción de DNA indicado por el fabricante del KIT Cuantificar el DNA mediante la medición de absorbancia a 260nm y la pureza de la extracción mediante el cálculo de la razón 260/ Condiciones de PCR Partidores: Patógeno Foward Reverse Gen pesquisado P salmonis 5 -CTA-GGA-GAT-GAG-CCC-GCG-TTG-3 5 -GCT-ACA-CCT-GCG-AAA-CCA-CTT-3 PS Agregar a un tubo de PCR de 0.5 µl 12,5 µl de master mix Econataq Plus green 2X, 1 µl de cada primer a una concentración de 25 µm, 2µl de templado y completar el volumen con Agua libre de nucleasas hasta 25 µl Llevar los tubos en hielo al termociclador y ejecutar una denaturación inicial de 94ºC por 2 min y luego 35 ciclos de: 94ºC 60 segundos 65 ºC 120 segundos 72 ºC 180segundos 6.8 Cálculo de Resultados: Una vez ejecutado el PCR las muestras mantenidas en hielo deben ser cargadas en un gel de agarosa TAE 1x al 2% teñido con syber safe según las instrucciones del fabricante. Las muestras deben ser corridas por 1 hora a 100 volts y posteriormente visualizadas en INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.11

163 Código: LBM PS2 Protocolo PCR convencional P.salmonis Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE P.salmonis Página 3 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación un transiluminador con radiación UV. Las bandas son cuantificadas a través del sistema Image J. Los resultados deben corresponder a una banda de 476 pb Control de calidad Se ha establecido que todas las muestras de DNA deben ser cuantificadas previamente al desarrollo del PCR de forma de siempre utilizar 10 ng de DNA para cada reacción Los resultados deben ser uniformes en relación a la expresión del gen reportero en las distintas muestras para cada tejido Cada reacción será comparada con su respectivo control positivo (muestra conocida) y control negativo (PCR sin DNA) En caso de existir bandas en los controles negativos los reactivos deben ser chequeados y las reacciones repetidas posteriormente Expresión de resultados Deben ser expresados como positivos o negativos en caso de existir o no la presencia de una banda del peso molecular esperado. Se utilizará el valor otorgado por el sistema Image J para tratar de cuantificar la cantidad del patógeno presente en la muestra según el valor otorgado al gen reportero de la especie analizada para normalizar los resultados Límite de detección (LD): El límite de detección es 10ng de DNA. 7. Documentación Planilla de trabajo de Laboratorio Informe de Resultados 8. Anexos No aplica.. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.11

164 Código: LBM VHS Protocolo PCR convencional VHS Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y Página 1 de 3 CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS DE SEPTICEMIA HEMORRÁGICA VIRAL (VHS) Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la detección y cuantificación del virus VHS en especies salmonídeas y no salmonideas. 2. Alcance Este procedimiento, es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1 OIE 2009, Manual of diagnostic Test for Aquatic Animals. Capítulo : LAB/NT3/ Procedimientos para la validación y control de calidad de los Métodos de reacción en cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos, Sernapesca. 4. Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar el envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis de al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Actividad El método de PCR se realiza utilizando los partidores publicados en el Manual OIE, Equipos y Materiales Termociclador Vortex Microcentrífuga refrigerada Micropipetas de volumen regulable p1000, p200, p20, p Material de vidrio de uso general Tubos eppendorf de 1.5 ml libres de nucleasas Tubos PCR 0.5 ml Cámara de electroforesis Traniluminador Fuente de poder Termoblock Ultraturrax INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.12

165 Código: LBM VHS Protocolo PCR convencional VHS Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y Página 2 de 3 CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS DE SEPTICEMIA HEMORRÁGICA VIRAL (VHS) Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 6.2 Reactivos Etanol absoluto para biología molecular Agarosa Tae 1X Kit de extracción de RNA (AyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Axygen)) Kit de elaboración de cdna (affinityscript QPCR cdna Síntesis Kit (Stratagene) Kit de PCR (Econotaq Plus Green (Lucigen) Syber safe (Invitrogen ) Agua libre de nucleasas Agua desionizada 6.4. Estándares Estándar de peso molecular de 1000pb (Fermentas ) Preparación de las muestras Las muestras de tejido de aproximadamente 0.5 cm 2 mantenidas en etanol absoluto de biología molecular a -80ºC son homogeneizadas utilizando un ultraturrax utilizando el vástago plástico del kit de extracción y la solución de lisis del kit Las muestras homogeneizadas deben ser sometidas a una temperatura de 70ºC por 1 minuto en un termoblock, en el caso de que se observen grumos de tejido sin homogeneizar Seguir el protocolo de extracción de RNA del fabricante Cuantificar el RNA mediante la medición de absorbancia a 260nm y la pureza de la extracción mediante el cálculo de la razón 260/ Tomar el volumen necesario para llegar a 10 ng de RNA y agregar 3 µl de random primers, 1 µl de RNAsa Block y el volumen necesario de agua libre de nucleasas para completar 20 µl Poner los tubos en el termociclador a 42ºC por 5 minutos Finalizado el ciclo poner los tubos inmediatamente en hielo y agregar 10 µl de master mix e iniciar el ciclo de 55ºC por 60 minutos y una posterior fase de extensión final de 70ºC por 15 minutos Condiciones de PCR Partidores: Patógeno Foward Reverse Gen pesquisado IHN 5 - TTC-GCA-GAT-CCC-AAC-AAC-AA GCG-CAC-GT-GCC-TTG-GCT-3 Nucleocapside Agregar a un tubo de PCR de 0.5 µl 12,5 µl de master mix Econataq Plus green 2X, 1 µl de cada primer a una concentración de 25 µm, 2µl de templado y completar el volumen con Agua libre de nucleasas hasta 25 µl. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.12

166 Código: LBM VHS Protocolo PCR convencional VHS Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y Página 3 de 3 CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS DE SEPTICEMIA HEMORRÁGICA VIRAL (VHS) Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Llevar los tubos en hielo al termociclador y ejecutar una denaturación inicial de 94ºC por 2minutos 35 ciclos de: 94ºC por 30 segundos 55ºC por 30 segundos 68ºC por 60 segundos Finalmente una Extensión final de 68ºC por 7 minutos 6.8 Cálculo de Resultados: Una vez ejecutado el PCR las muestras mantenidas en hielo deben ser cargadas en un gel de agarosa TAE 1x al 1.5% teñido con syber safe según las instrucciones del fabricante. Las muestras deben ser corridas por 1 hora a 100 volts y posteriormente visualizadas en un transiluminador con radiación UV. Las bandas son cuantificadas a través del sistema Image J. Los resultados deben corresponder a una banda de 504 pb Control de calidad Se ha establecido que todas las muestras de RNA deben ser cuantificadas previamente al desarrollo del PCR de forma de siempre utilizar 10 ng de DNA para cada reacción Los resultados deben ser uniformes en relación a la expresión del gen reportero en las distintas muestras para cada tejido Cada reacción será comparada con su respectivo control positivo (muestra conocida) y control negativo (RT-PCR sin RNA) En caso de existir bandas en los controles negativos los reactivos deben ser chequeados y las reacciones repetidas posteriormente Expresión de resultados Deben ser expresados como positivos o negativos en caso de existir o no la presencia de una banda del peso molecular esperado. Se utilizará el valor otorgado por el sistema Image J para tratar de cuantificar la cantidad del patógeno presente en la muestra según el valor otorgado al gen reportero de la especie analizada para normalizar los resultados Límite de detección (LD): El límite de detección es 10ng de RNA. 7. Documentación Planilla de trabajo de Laboratorio Informe de Resultados 8. Anexos No aplica. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.12

167 Código: LBM VO Protocolo PCR convencional Vibrio ordalii Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE Vibrio ordalii Página 1 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la detección y cuantificación de Vibrio ordalii en especies salmonideas y no salmonideas. 2. Alcance Este procedimiento, es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1 Vesalovic J., Koeuth T. and R. Lupski J., Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucl. Aci. Res. 19, 24: LAB/NT3/ Procedimientos para la validación y control de calidad de los Métodos de reacción en cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos, Sernapesca. 4. Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar el envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis de al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Actividad El método de PCR se realiza utilizando los partidores publicados por Vesalovic et al, Equipos y Materiales Termociclador Vortex Microcentrífuga refrigerada Micropipetas de volumen regulable p1000, p200, p20, p Material de vidrio de uso general Tubos eppendorf de 1.5 ml libres de nucleasas Tubos PCR 0.5 ml Cámara de electroforesis Traniluminador Fuente de poder INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.13

168 Código: LBM VO Protocolo PCR convencional Vibrio ordalii Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE Vibrio ordalii Página 2 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Termoblock Ultraturrax 6.2 Reactivos Etanol absoluto para biología molecular Agarosa Tae 1X Kit de extracción de DNA (AyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Axygen)) Kit de PCR (Econotaq Plus Green (Lucigen) syber safe (Invitrogen) Agua libre de nucleasas Agua desionizada 6.4. Estándares Estándar de peso molecular de 1000pb (Fermentas) Preparación de las muestras Las muestras de tejido de aproximadamente 0.5 cm 2 mantenidas en etanol absoluto de biología molecular a -80ºC son homogeneizadas utilizando un ultraturrax utilizando el vástago plástico del kit de extracción y la solución de lisis del kit Las muestras homogeneizadas deben ser sometidas a una temperatura de 70ºC por 1 minuto en un termoblock, en el caso de que se observen grumos de tejido sin homogeneizar Seguir el protocolo de extracción de DNA indicado por el fabricante del KIT Cuantificar el DNA mediante la medición de absorbancia a 260nm y la pureza de la extracción mediante el cálculo de la razón 260/ Condiciones de PCR Partidores: Los set de partidores son proporcionados por el Laboratorio Aquainnovo Agregar a un tubo de PCR de 0.5 µl 12,5 µl de master mix Econataq Plus green 2X, 1 µl de cada primer a una concentración de 25 µm, 2µl de templado y completar el volumen con Agua libre de nucleasas hasta 25 µl Llevar los tubos en hielo al termociclador y ejecutar una denaturación inicial de 95ºC por 5 min y luego 35 ciclos de: 92ºC 45 segundos 52 ºC 60 segundos 70 ºC 60 segundos Finalmente una Extensión final de 70ºC por 20 minutos 6.8 Cálculo de Resultados: INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.13

169 Código: LBM VO Protocolo PCR convencional Vibrio ordalii Título: PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PCR PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE Vibrio ordalii Página 2 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Junio 2010 Aprobado por : En evaluación Una vez ejecutado el PCR las muestras mantenidas en hielo deben ser cargadas en un gel de agarosa TAE 1x al 1% teñido con syber safe según las instrucciones del fabricante. Las muestras deben ser corridas por 1 hora a 100 volts y posteriormente visualizadas en un transiluminador con radiación UV. Las bandas son cuantificadas a través del sistema Image J. Los resultados deben a una banda de aprox 430 pb Control de calidad Se ha establecido que todas las muestras de DNA deben ser cuantificadas previamente al desarrollo del PCR de forma de siempre utilizar 10 ng de DNA para cada reacción Los resultados deben ser uniformes en relación a la expresión del gen reportero en las distintas muestras para cada tejido Cada reacción será comparada con su respectivo control positivo (muestra conocida) y control negativo (PCR sin DNA) En caso de existir bandas en los controles negativos los reactivos deben ser chequeados y las reacciones repetidas posteriormente Expresión de resultados Deben ser expresados como positivos o negativos en caso de existir o no la presencia del patrón de bandas del peso molecular esperado. Se utilizará el valor otorgado por el sistema Image J para tratar de cuantificar la cantidad de patógeno presente en la muestra según el valor otorgado por el gen reportero de la especie analizada para normalizar los resultados Límite de detección (LD): El límite de detección es 10ng de DNA. 7. Documentación Planilla de trabajo de Laboratorio Informe de Resultados 8. Anexos No aplica. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.13

170 Código: LBM P Protocolo Purificación de Producto de PCR Título: Protocolo purificación de productos de PCR desde gel de Agarosa (Qiagen) Página 1 de 2 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Mayo 2011 Aprobado por : Jefe de Laboratorio. 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la purificación de los productos de PCR obtenidos para su posterior secuenciación. 2. Alcance Este procedimiento, es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1. LAB/NT3/ Procedimientos para la validación y control de calidad de los Métodos de reacción en cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos, Sernapesca. 4. Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar el envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Actividad El método de purificación se desarrolla utilizando el KIT de QIAGEN. 6. Equipos y Materiales 6.1. Equipos Vortex Microcentrífuga refrigerada Micropipetas de volumen regulable p1000, p200, p20, p Tubos eppendorf de 1.5 ml libres de nucleasas Cámara de electroforesis Transiluminador Fuente de poder Termoblock 6.2 Reactivos Isopropanol Agarosa Tae 1X Kit de purificación de productos de PCR, MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen) Syber safe (Invitrogen ) Agua libre de nucleasas Agua desionizada 7. Estándares No aplica. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.14

171 Código: LBM P Protocolo Purificación de Producto de PCR Título: Protocolo purificación de productos de PCR desde gel de Agarosa (Qiagen) Página 2 de 2 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Mayo 2011 Aprobado por : Jefe de Laboratorio. 8. Preparación de las muestras 8.1. Escindir el fragmento de DNA del gel de Agarosa Agregar 300ul de Buffer QG al tubo que contiene la banda Incubar a 50 C por 30min. hasta que el gel este completamente disuelto Agregar 100ul de Isopropanol a la reacción y mezclar por vortex Traspasar toda la muestra a la columna Centrifugar a 13000rpm por 1 min. (Cambiar tubo de recolección) Agregar 500ul de buffer QG a la columna y posteriormente centrifugar por 1min a 13000rpm Para lavar, agregar 600ul de Buffer PE a la columna y esperar 2-5 min Centrifugar por 1min a 13000rpm y descartar el filtrado Secar la columna a 13000rpm por 2min Eluir el DNA agregando 15ul de EB en el centro de la columna, esperar 1min y centrifugar por 1min. 9. Cálculo de Resultados: Una vez ejecutada la purificación las muestras deberán ser mantenidas en hielo y cargadas en un gel de agarosa TAE 1x al 1.5% teñido con syber safe según las instrucciones del fabricante. Las muestras deben ser corridas por 30 minutos a 100 volts y posteriormente visualizadas en un transiluminador con radiación UV. Las bandas serán indicadoras del éxito del procedimiento. 10. Control de calidad Visualización de una banda en un gel de agarosa. 11. Expresión de resultados Los resultados serán expresados indicando el número de bandas presentes en el gel de agarosa derivadas de la purificación. El producto purificado será derivado a proveedor de servicio de secuenciación junto con los partidores utilizados en el procedimiento de PCR. 12. Límite de detección (LD): No aplica 13. Documentación Planilla de trabajo de Laboratorio Informe de Resultados 14. Anexos No aplica. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 4.14

172 ANEXO 5 Respaldos fotográficos de montaje e implementación de Protocolos finales de PCR convencional en LBM-IFOP.

173 A g e n t e s V i r a l e s

174 EHNV Figura 1. Chequeo en triplicado del protocolo EHNV en tres condiciones de PCR. El resultado óptimo se presenta en el protocolo 2 y final. VHS tipo Ia Figura 2. Chequeo en triplicado del protocolo VHS en tres condiciones de PCR. El resultado óptimo se presenta en el protocolo 2 y final. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 5

175 IHNV-(N) diluido Figura 3. Chequeo en triplicado del protocolo de IHNV en tres condiciones de PCR. El resultado óptimo sepresenta en el protocolo 3 correspondiente a los carriles finales. Figura 4. Electroforesis PCR OMV a 56 oc de anneling, la flecha celeste indica el producto esperado de 439pb, la flecha roja indica una banda inespecifica de 300 pb, se observa exceso de partidores y formación de dimeros bajo las 100 pb; St: Estandar de Peso Molecular de 100 pb; 1, 2 y 3: Producto de PCR OMV. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 5

176 Figura 5. Electroforesis de los productos de PCR en gradiente de temperaturas de OMV, la flecha celeste indica el producto de PCR al utilizar una temperatura de annealing de 50oC. St: Estandar de Peso Molecular de 100 pb; 1: Producto de PCR a 50oC de anneling; 2: Producto de PCR a 52.4oC de annealing; 3: Producto de PCR a 55oC de annealing; 4: Producto de PCR a 57oC de annealing; 5: Producto de PCR a 60oC de annealing. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 5

177 A g e n t e s B a c t e r i a n o s

178 16S Eubacteria Figura 4. Chequeo en duplicado del protocolo 16S Eubacteria en dos condiciones de PCR para P.S (P.salmonis), V.O (V. ordalii) y A.S (Aeromona salmonicida). El resultado óptimo se presenta en el protocolo 2 y final con un mix de Aeromonas Salmonicida Atípica Figura 5. Chequeo en cuadruplicado del protocolo de Aeromonas salmonicida atípica con dos set de partidores. El resultado óptimo se presenta en el protocolo 1 y final con el set de partidores No1. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 5

179 Vibrio ordalii Figura 6. Chequeo en triplicado del protocolo de Vibrio ordalii en dos condiciones de PCR. El resultadooptimo se presenta en el protocolo 1 y final con utilizando un mix de P.Salmonis Figura 7. Chequeo en duplicado del protocolo de P.salmonis en ocho condiciones de PCR. El resultado óptimo se presenta en un mix de utilizando el producto de PCR de 16S eubacteria en una dilución 1/100, donde se observa menor saturación de las bandas. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 5

180 G e n e s R e p o r t e r o s

181 28S róbalo 2 Figura 8. Chequeo en triplicado del protocolo de 28Sr de Róbalo en tres condiciones de PCR. El resultado óptimo se presenta en el protocolo 2 en que se observa menor saturación de las bandas. Figura 9. Electroforesis de los productos de PCR en gradiente de temperatura de β-actina de Odontesthes regia. St: Estandar de Peso Molecular de 100 pb; 1: Producto de PCR a 50oC de anneling; 2: Producto de PCR a 52.4oC de annealing; 3: Producto de PCR a 55oC de annealing; 4: Producto de PCR a 57oC de annealing; 5: Producto de PCR a 60oC de annealing; 6: Control negativo. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 5

182 B-Actina de Pejerre Figura 10. Chequeo en triplicado del protocolo de B-actina Pejerrey en tres condiciones de PCR. El resultado óptimo se presenta en el protocolo 3 correspondiente a los carriles finales n que se presenta menor saturación de las bandas. Figura 10. Chequeo en cuadruplicado del protocolo de B-actina Trucha /Coho en dos condiciones de PCR. El resultado óptimo se presenta en el protocolo 1 correspondiente a los primeros carriles. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 5

183 Pruebas de Sensibilidad

184 EHNV Figura 11. Ejemplo de las pruebas de dilución realizadas para los patógenos en estudio, en general se cumple lo indicado en el kit de PCR en que se indica como límite de detección 1ng de DNA de la muestra problema. P.salmonis Figura 12. Electroforesis en gel de Agarosa al 2%: Se realizaron distintas diluciones para comprobar que nuestro protocolo es capaz de detectar como mínimo 1 ng de DNA bacteriano. El carril st corresponde a un estandar de 100pb, el carril 1 corresponde a 1ul tomado directamente desde la muestra, los carriles 2,3, 4,5,6,7 y 8 corresponden a diluciones seriadas a en base 2 a partir de una muestra de DNA bacteriano de concentración 187,88ng/ul. INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 5

185 ANEXO 6 Detalles de Muestras: Hornopiren, Melinka, Estuario, Castro, Aysen

186 H o r n o p i r e n

187 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

188 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

189 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

190 E s t u a r i o

191 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

192 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

193 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

194 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

195 M e l i n k a

196 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

197 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

198 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

199 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

200 C a s t r o

201 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

202 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

203 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

204 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

205 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

206 A y s e n

207 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

208 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

209 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 6

210 ANEXO 7 Secuencias de las Muestras Positivas a P.salmonis por especie de pez y porcentaje de identidad.

211 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 7

212 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 7

213 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 7

214 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 7

215 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 7

216 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 7

217 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 7

218 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 7

219 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 7

220 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 7

221 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 7

222 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 7

223 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 7

224 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 7

225 ANEXO 8 Alineamiento BLAST-2

226 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

227 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

228 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

229 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

230 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

231 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

232 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

233 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

234 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

235 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

236 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

237 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

238 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

239 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

240 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

241 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

242 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

243 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

244 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

245 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 8

246 ANEXO 9 Encuestas Sanitarias a Centros de Cultivo

247 Encuesta Sanitaria Centros de Cultivo 1.- Antecedentes Generales Nombre Empresa: Salmones Antártica S.A. Nombre Centro de Cultivo: Punta Morro Código RNA: Región: X XI (x) Tipo de Centro: Estuario (x) Mar 2.- Antecedentes Productivo Sanitarios Especie cultivada: Trucha (x) Coho Salar Tipo de Centro origen: Piscicultura (x) Lago Estuario (x) Fecha de siembra: inicio 11 de Noviembre de 2009 Centro (s) de origen peces: Piscicultura Coreo Centro Puntilla Vacuna: Nombre: Agrovac 3 y Recalcine triple Laboratorio: Agrovet y Recalcine Mortalidad: Diaria 0,04 % Mt. Acumulada desde siembra 22,96 % Biomasa actual: Kgs. Peso promedio: 3461 (Grs) INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 9

248 Brotes en mar desde fecha de siembra: Nº Diagnóstico: Enfermedad Fecha inicio Fecha Termino a) Laboratorio b) Presuntivo Terreno 1 a y b SRS Fines marzo 10 Término de cosecha n Otras observaciones: No se realizaron tratamientos terapéuticos contra la patología detectada; por lo cual la mortalidad asociada a la patología diagnosticada permaneció hasta el término de cosecha. Últimos diagnósticos confirmados por laboratorio: Fecha de Diagnóstico Laboratorio Solicitado Patógeno aislado INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 9

249 Encuesta Sanitaria Centros de Cultivo 1.- Antecedentes Generales Nombre Empresa: Camanchaca Nombre Centro de Cultivo: Río Chilco Código RNA: Región: X (x) XI Tipo de Centro: Estuario 2.- Antecedentes Productivo Sanitarios Especie cultivada: Trucha Tipo de Centro origen: Piscicultura y Lago Fecha de siembra: Enero-Febrero 2010 Centro (s) de origen peces: Piscicultura SISA Lago Playa Maqui Vacuna: Nombre: Birnagen Forte 2 Laboratorio: Novartis Mortalidad: Diaria 0,1% Mt. Acumulada desde siembra 14,6 % Biomasa actual: Kgs. Peso promedio: 2890 (Grs) INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 9

250 Brotes en mar desde fecha de siembra: Nº Diagnóstico: Enfermedad Fecha inicio Fecha Termino a) Laboratorio b) Presuntivo Terreno 1 A y b SRS Abril Mayo 2 A y b SRS Agosto Hasta la fecha n Otras observaciones: Últimos diagnósticos confirmados por laboratorio: Fecha de Diagnóstico Laboratorio Solicitado Patógeno aislado Abril ADL Piscirickettsia salmonis Abril ADL Nucleospora salmonis INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 9

251 Encuesta Sanitaria Centros de Cultivo 1.- Antecedentes Generales Nombre Empresa: Empresas AquaChile S.A Nombre Centro de Cultivo: Lagreze Norte. Código RNA: Región: X XI (x) Tipo de Centro: Estuario Mar (x) 2.- Antecedentes Productivo Sanitarios Especie cultivada: Trucha (x) Coho Salar Tipo de Centro origen: Piscicultura Lago (x) Estuario Fecha de siembra: Noviembre 2009 Centro (s) de origen peces: Lago Chapo Vacuna: Nombre: Alphajet Micro 2 IPN - SRS Laboratorio: Pharmaq Mortalidad: Diaria % Mt. Acumulada desde siembra 26,19 % Biomasa actual: 0 Kgs. Peso promedio: (Grs) INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 9

252 Brotes en mar desde fecha de siembra: Nº Diagnóstico: n a) Laboratorio b) Presuntivo Terreno Enfermedad Fecha inicio Fecha Termino Otras observaciones: No hubo brotes de enfermedad Últimos diagnósticos confirmados por laboratorio: Fecha de Diagnóstico Laboratorio Solicitado Patógeno aislado No hubo diagnósticos pues no hubo brotes de enfermedad INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 9

253 Encuesta Sanitaria Centros de Cultivo 1.- Antecedentes Generales Nombre Empresa: Salmones Multiexport Nombre Centro de Cultivo: Pitihorno Código RNA: Región: X (x) XI Tipo de Centro: Estuario Mar (x) 2.- Antecedentes Productivo Sanitarios Especie cultivada: Trucha (x) Coho Salar Tipo de Centro origen: Piscicultura Lago (x) Estuario Fecha de siembra: 5 de Diciembre 2008 Centro (s) de origen peces: Montealegre Rupanco Vacuna: Nombre: Birnagen Forte II (Novartis) y IPN-SRS (Centrovet) Laboratorio: Novartis y Centrovet Mortalidad: Diaria 0,02 % Mt. Acumulada desde siembra 28,02 % Biomasa actual: 0 Kgs. Peso promedio:_3160 (Grs) INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 9

254 Brotes en mar desde fecha de siembra: Nº Diagnóstico: a) Laboratorio Enfermedad Fecha inicio Fecha Termin o b) Presuntivo Terreno 1 a SRS-Vibrio Spp a SRS-Vibrio Spp n Otras observaciones: Centro.Cosechado Últimos diagnósticos confirmados por laboratorio: Fecha de Diagnóstico Laboratorio Solicitado Patógeno aislado SRS SRS INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 9

255 Encuesta Sanitaria Centros de Cultivo 1.- Antecedentes Generales Nombre Empresa: Salmones Multiexport Nombre Centro de Cultivo: Punta Cuem Código RNA: Región: X (x) XI Tipo de Centro: Estuario Mar (x) 2.- Antecedentes Productivo Sanitarios Especie cultivada: Trucha (x) Coho Salar Tipo de Centro origen: Piscicultura Lago (x) Estuario Fecha de siembra: 27 enero-26 abril Centro (s) de origen peces: Puerto Fonk Rupanco Vacuna: Nombre: IPN SRS Laboratorio: Centrovet - Pharmaq Mortalidad: Diaria 0,02 % Mt. Acumulada desde siembra 36,59 % Biomasa actual: Kgs. Peso promedio: 2106(Grs) INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 9

256 Brotes en mar desde fecha de siembra: Nº Diagnóstico: Enfermedad Fecha inicio Fecha Termino a) Laboratorio b) Presuntivo Terreno 1 Flavobacterium Flavobacteriosis 15-feb 15-marzo 2 Vibrio sp Vibriosis 15 marzol 15 abril 3 P. salmonis SRS 15 agosto A la fecha 4 5 n Otras observaciones: SRS: se comenzó a medicar desde cuando se diagnosticó, hasta la fecha no hay brote. Últimos diagnósticos confirmados por laboratorio: Fecha de Diagnóstico Laboratorio Solicitado Patógeno aislado INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 9

257 ANEXO 10 Encuestas Sanitarias a Centros de Cultivo

258 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 10

259 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 10

260 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 10

261 INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 10

262 ENCUESTA OPINIÓN DE EXPERTOS SOBRE LA TRANSMISIÓN DE PISCIRICKETTSIOSIS ENTRE PECES SILVESTRES Y SALMÓNIDOS DE CULTIVO El objetivo de esta encuesta de opinión es estimar la probabilidad de ocurrencia de una serie eventos necesarios para que se produzca la transmisión de Piscirickettsia salmonis entre poblaciones de peces silvestres/asilvestrados y salmónidos de cultivo, y la posterior presentación de la enfermedad en dichas poblaciones. Esta aproximación a la obtención de dichos parámetros permitirá el desarrollo de estimaciones del riesgo de la transmisión de esta enfermedad entre estas poblaciones y la generación de programas de vigilancia epidemiológica basados en este riesgo. Desde ya agradecemos su participación en esta iniciativa. Instituto de Fomento Pesquero INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 10

263 Considere la siguiente tabla de categorización de probabilidades de ocurrencia de un evento, la que va desde 0% hasta 100% de probabilidad: CATEGORIA DEFINICION PROBABILIDAD Mínimo Máximo Insignificante El evento virtualmente no ocurriría 0,000% 0,001% Extremadamente bajo Extremamente improbable que ocurra el evento 0,001% 0,01% Muy bajo Muy improbable que ocurra el evento 0,01% 0,1% Bajo Improbable que ocurra el evento 0,1% 1% Ligero Posible que ocurra el evento a una probabilidad baja 1% 10% Moderado Posible que ocurra el evento a una probabilidad alta 10% 50% Alto Altamente probable que ocurra el evento 50% 100% Para visualizar mejor las probabilidades puede considerar también la siguiente tabla que relaciona un nivel de probabilidad con la frecuencia de ocurrencia de un evento Probabilidad Frecuencia de ocurrencia 0,001% 1 de ,01% 10 de ,1% 100 de % de % de % de % de Por último, considere también las siguientes definiciones Pez silvestre: incluye a cualquier pez de las especies que se pueden capturar en torno a un centro de cultivo, como el Blanquillo, Brótula, Cabrilla, Chancharro, Congrio, Lenguado, Merluza común, Pampanito, Pejegallo, Pejerrey, Róbalo, Rollizo y Tollo. Pez asilvestrado: corresponde a un salmónido que habita fuera de las balsas jaulas, e incluye al salmón coho, salmón del Atlántico, trucha arcoiris, salmón chinook y trucha fario. En base a esta información responda las siguientes preguntas. Cuál es la probabilidad de que un pez silvestre infectado con Piscirickettsia salmonis libere este agente al medio? INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 10

264 a) Insignificante b) Extremadamente baja c) Muy baja d) Baja e) Ligera f) Moderada g) Alta Cuál es la probabilidad de que un salmónido asilvestrado infectado con Piscirickettsia salmonis libere este agente al medio? a) Insignificante b) Extremadamente baja c) Muy baja d) Baja e) Ligera f) Moderada g) Alta Si un pez infectado (silvestre o asilvestrado) libera P. salmonis en la proximidad de un centro de cultivo de salmónidos (dentro de la malla lobera), qué tan probable es que se infecten salmónidos del centro de cultivo? Silvestre a) Insignificante b) Extremadamente baja c) Muy baja d) Baja e) Ligera f) Moderada g) Alta Asilvestrado g) Alta Si este mismo evento se produce en el perímetro de 5 Km que rodea a un centro de cultivo de salmónidos (fuera de la malla lobera), qué tan probable es que se infecten salmónidos del centro de cultivo? Silvestre Asilvestrado a) Insignificante b) Extremadamente baja c) Muy baja d) Baja e) Ligera f) Moderada a) Insignificante b) Extremadamente baja c) Muy baja d) Baja e) Ligera f) Moderada a) Insignificante b) Extremadamente baja c) Muy baja d) Baja e) Ligera f) Moderada g) Alta INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 10

265 g) Alta Dado que se infecten salmónidos del centro de cultivo de las formas mencionadas anteriormente, qué tan probable es que se produzca un brote de piscirickettsiosis en el centro? a) Insignificante b) Extremadamente baja c) Muy baja d) Baja e) Ligera f) Moderada g) Alta h) Dada la presencia de un pez, silvestre o asilvestrado, infectado con P. salmonis en el perímetro de 5 Km que rodea a un centro de cultivo de salmónidos (dentro o fuera de la malla lobera), cuál es la probabilidad de que este tome contacto con una población natural de peces silvestres (no asociados a centros de cultivo)? Silvestre Asilvestrado a) Insignificante b) Extremadamente baja c) Muy baja d) Baja e) Ligera f) Moderada g) Alta a) Insignificante b) Extremadamente baja c) Muy baja d) Baja e) Ligera f) Moderada g) Alta Si un pez, silvestre o asilvestrado, infectado con P. salmonis se encuentra liberando el agente al medio acuático y toma contacto con una población natural de peces silvestres, cuál es la probabilidad de que los peces de esta población se infecten con el agente? Silvestre Asilvestrado a) Insignificante b) Extremadamente baja c) Muy baja d) Baja e) Ligera f) Moderada g) Alta a) Insignificante b) Extremadamente baja c) Muy baja d) Baja e) Ligera f) Moderada g) Alta Cuál es la probabilidad de que los peces de esta población natural, infectados de la forma descrita anteriormente, enfermen producto del agente? INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 10

266 a) Insignificante b) Extremadamente baja c) Muy baja d) Baja e) Ligera f) Moderada g) Alta h) Considerando la siguiente categorización de las consecuencias de la presentación de piscirickettsiosis en poblaciones naturales de peces silvestres Categoría Insignificantes Muy bajas Bajas Moderadas Altas Extremas Definición Las consecuencias biológicas y económicas derivadas de la introducción del agente patógeno son insignificantes Las consecuencias biológicas y económicas derivadas de la introducción del agente patógeno son menores Las consecuencias biológicas y económicas derivadas de la introducción del agente patógeno son bajas Las consecuencias biológicas y económicas derivadas de la introducción del agente patógeno son intermedias Las consecuencias biológicas y económicas derivadas de la introducción del agente patógeno son severas Las consecuencias biológicas y económicas derivadas de la introducción del agente patógeno son catastróficas Cuál sería el impacto de la presentación de esta patología en una población natural de peces silvestres? a) Insignificante b) Muy bajo c) Bajo d) Moderado e) Alto f) Extremo INFORME FINAL: DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO EN POBLACIONES DE PECES SILVESTRES - ANEXO 10

267 INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO Sección Ediciones y Producción Blanco 839, Fono Valparaíso, Chile

268