Diagnóstico de pools en sanidad acuícola: ventajas e inconvenientes

Transcripción

1 3-5 de junio de 2015 Diagnóstico de pools en sanidad acuícola: ventajas e inconvenientes Dr. Ignacio de Blas Laboratorio de Ictiopatología. Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza (España)

2 Introducción Práctica habitual en sanidad acuícola Notable reducción de costes Procedimiento reconocido por la OIE: WSSV: muestras/pool VHS/IHN: 10 muestras/pool ISA: 5 muestras/pool KHV: 2 muestras/pool

3 Pero no se puede calcular la prevalencia individual

4 Uso de muestras en pool Reducción de costes económicos en programas de vigilancia Posibilidad de calcular la prevalencia individual Kline y cols,1989

5 Ejemplo Se han tomado 50 pools de 5 truchas para hacer diagnóstico vírico en cultivo celular, resultando 4 pools positivos a IPN. Cuál es la prevalencia individual?

6 Y la sensibilidad no cambia

7 Prueba a evaluar Evaluación de pruebas diagnósticas Prueba de referencia Gold standard Infectado Sano Total Positivo Verdadero positivo Falso positivo Negativo Falso negativo Verdadero negativo Total

8 Prueba a evaluar Diagnóstico: prevalencias P(infectado) Prueba de referencia Gold standard P(positivo) Infectado Sano Total Positivo Verdadero positivo Falso positivo Prevalencia aparente Negativo Falso negativo Verdadero negativo Total Prevalencia real

9 Prueba a evaluar Fiabilidad del diagnóstico Sensibilidad = P(positivo infectado) Prueba de referencia Gold standard Infectado Sano Total Positivo Negativo Verdadero positivo Falso negativo Falso positivo Verdadero negativo Total Infectados Sanos Especificidad = P(negativo sano)

10 Por qué hay falsos negativos?

11 Prueba a evaluar Fiabilidad del diagnóstico Sensibilidad = P(positivo infectado) Prueba de referencia Gold standard Positivo Negativo Total Muestra inadecuada Periodo de latencia Nivel de detección Inhibidores Infectado Sano Total Verdadero positivo Falso negativo Infectados Falso positivo Verdadero negativo Reacciones cruzadas Contaminaciones Sanos Especificidad = P(negativo sano)

12 Evolución temporal de la enfermedad 1. Periodo de Latencia Infección Diagnóstico 2. Periodo de Prepatencia Infección Infectante 3. Periodo de Incubación Infección Enfermo

13 Latencia vs Incubación Latencia Infección Incubación Síntomas Diagnóstico Latencia Infección Diagnóstico Síntomas Incubación

14 Carga patog. Carga patóg. Límite de detección vs Sensibilidad Límite detección Resultados negativos Resultados positivos Resultados negativos Tiempo Límite detección Resultados negativos Resultados positivos Resultados negativos Tiempo

15 Muestras en pool Efecto dilución descenso sensibilidad Ej: Nivel de detección = Factores a tener en cuenta Nivel de detección Tamaño del pool Carga de patógenos en asintomáticos y enfermos Prevalencia de infección =

16 Pero qué pasa con la sensibilidad?

17 Relaciones entre probabilidades

18 Estimación de prevalencias con pools

19 Estimación de sensibilidad relativa P real P aparente Tamaño de pool Sensibilidad 6,16% 5,11% 15 82,95% 6,16% 5,79% 10 93,99% Kline y cols,1989

20 Y eso influye en el tamaño de muestra necesario para detectar la enfermedad en una población?

21 Carga patog. Carga patóg. Sensibilidad en animales sintomáticos Límite detección Resultados negativos Resultados positivos Resultados negativos Tiempo Límite detección Resultados negativos Resultados positivos Resultados negativos Tiempo

22 Confimar etiología de enfermedad Método de muestreo: No probabilístico Seleccionar animales sintomáticos Tamaño de muestra: n =10-20 Tamaño de muestra: Histopatología (n = 8-10) PCR, microbiología (n=10) Trabajar con pools para confirmar un brote no influye significativamente en la posibilidad de detectar el patógeno

23 Carga patog. Carga patóg. Sensibilidad en animales asintomáticos Límite detección Resultados negativos Resultados positivos Resultados negativos Tiempo Límite detección Resultados negativos Resultados positivos Resultados negativos Tiempo

24 Detectar presencia de un patógeno Método de muestreo: No probabilístico Seleccionar según criterios objetivos (animales sintomáticos siempre que sea posible) Tamaño de muestra: Depende de prevalencia mínima esperada Tamaño de muestra: Histopatología (n = 8-10 extras y sintomáticos) PCR, microbiología (tamaño de muestra calculado, posibilidad de usar pools)

25 Detección de enfermedad n: tamaño de muestra necesario NC: nivel de confianza (normalmente 0,95) d: animales enfermos esperados en la población d = N * Prevalencia mínima esperada N: tamaño de población d N NC) ( n d

26 Detección de enfermedad n 10% 5% 2% N

27 d S N NC) ( n S d d N NC) ( n d Detección de infectados (S<100%) n: tamaño de muestra necesario d: animales infectados esperados en la población N: tamaño de población Cannon, 2001 Positivos esperados

28 Pero con la PCR el efecto dilución es irrelevante

29 Fundamentos PCR Ciclo Copias Agentes Dr. Wehrle, Hoffmann-La Roche AG

30 Fundamentos PCR en tiempo real (qpcr) Mediante ondas Taqman

31 Cuantificación en qpcr Ct muestra =30 Ciclo Copias Agentes Carga inicial Ct umbral

32 Valor umbral en qpcr (Ct)

33 Muestras en pool Efecto dilución descenso sensibilidad Ej: Nivel de detección = Factores a tener en cuenta Nivel de detección Tamaño del pool Carga de patógenos en asintomáticos y enfermos Prevalencia de infección =

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35 Efecto dilución en muestras en pool Factores a tener en cuenta Nivel de detección: Ct umbral Tamaño del pool: n pool Carga de patógenos: Baja en asintomáticos Alta en enfermos Prevalencia de infección: Baja en procesos endémicos y latentes Alta en brotes epidémicos

36 Sensibilidad relativa para muestras en pool

37 Estudio preliminar Caracterizar infección en población asintomática Nivel de detección: Ct umbral Carga de patógenos (Ct muestra ): Distribución normal ( x, s ) Prevalencia de infección: Distribución binomial. Límite inferior IC 95%

38 n repeticiones Simulación Método de Montecarlo 1. Generar nº de infectados en un pool 2. Generar carga de patógenos en cada muestra 3. Suma el total de patógenos en el pool simulado 4. Calcular el Ct del pool (Ct pool ) 5. Comparar el Ct pool con Ct umbral 6. Clasificar el pool como positivo o negativo 7. Determinar cuantas repeticiones son positivas

39 Algunos escenarios

40 Algunos escenarios

41 Algunos escenarios

42 Algunos escenarios

43 Algunos escenarios

44 Algunos ejemplos Sensibilidades relativas correspondientes a diagnóstico en pool para PRRSv para carga viral global (mct = 27.75, sct = 4.625) (datos de Gerber et al, 2013)

45 Algunos ejemplos Sensibilidades relativas correspondientes a diagnóstico en pool para PRRSv carga viral baja (mct = 36.0, sct = 1.0) (datos de Gerber et al, 2013)

46 Implementación en WinEpi winepi2/f302.php

47 Conclusiones Reducción de la sensibilidad diagnóstica Necesidad de ampliar el tamaño de muestra Falta de información epidemiológica y etipatogénica

48 Muchas gracias por su atención