TESIS PAULA ROJAS MENCIO

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1 UNIVEUNIVERSIDAD VERACRUZANA ERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y AGROPECUARIAS ESTABLECIMIENTO DE UNA METODOLOGÍA PARA LA MICROPROPAGACIÓN DE PATRONES TOLERANTES AL VIRUS DE LA TRISTEZA DE LOS CÍTRICOS (VTC) TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS ESPECIALIDAD: BIOTECNOLOGIA DE PLANTAS PRESENTA: PAULA ROJAS MENCIO CORDOBA, VER. JUNIO DEL

2 INTRODUCCIÓN Los cítricos constituyen el cultivo de mayor importancia en la fruticultura mexicana, tanto por el área que se destina a su cultivo en 17 estados de la República, como por los empleos que genera en la producción, la industria y la comercialización nacional e internacional (De la Osa, 1998; Gómez et al., 1998). Actualmente, México ocupa el cuarto lugar como productor de cítricos en el ámbito mundial de naranjas y primer lugar en la producción de limas ácidas solamente superado por Brasil, Estados Unidos y China (De la Osa, 1998). La superficie cultivada con cítricos en México es de 485,000 ha, que producen en promedio anual 5.6 millones de toneladas de fruta, con una valor estimado de 4,659 millones de pesos (Villarreal, 2001). De la superficie total cultivada, la naranja ocupa el 69 %, el limón mexicano el 21 %, el limón persa el 3 % y la mandarina, toronja, otros limones y pomelo ocupan el 7 % (Chagolla, 1990; Villarreal 2001). Veracruz con 176,000 ha ocupa el primer lugar en la producción de cítricos, le sigue San Luis Potosí con 44,000 ha, Tamaulipas con 38,000 ha, Michoacán con 35,000 ha, Nuevo León y Colima, con 32,000 ha cada uno; en conjunto estas entidades concentran el 83 % de la superficie cultivada en el país (Villarreal, 2001). De la superficie cultivada en el estado de Veracruz, alrededor del 85.0 % corresponde a naranjas, el 10.2 % a mandarinas, el 4.5 % a limón persa y el 0.3 % a toronja (Gómez et al., 1998). La propagación de este grupo de especies se lleva a cabo casi exclusivamente mediante injertos sobre patrones de semillas, que en muchos casos tienen un origen apomíctico. Este tipo de propagación, que en general requiere una gran superficie y resulta algo más tardado, se encuentra limitado por la época del año y la obtención de semilla adecuada, además de que puede 1

3 promover la transmisión de enfermedades, especialmente sistémicas (Chagolla, 1990). El Virus de la Tristeza de los Cítricos (VTC) constituye hoy en día la enfermedad viral, de carácter letal, que más daño ha causado a la citricultura mundial (Orozco, 1996). Desde fines de la década del 30 hasta los últimos años, esta enfermedad ha ocasionado la muerte de 50 millones de árboles en diversos países (Orozco, 1996). En particular, el VTC ha destruido la citricultura de Sudamérica (especialmente en países como Argentina, Brasil y Venezuela) y ha dañado sensiblemente la citricultura de Estados Unidos, España, e Israel (Roistacher et al., 1994; RIAC, 1995). En gran parte, estos daños pueden ser atribuidos al hecho de que más del 90 % de los árboles de los 6 países de mayor producción y exportación de cítricos en la región de América Latina y el Caribe, se encuentran injertados sobre patrones de naranjo agrio (Citrus aurantium L.) (RIAC, 1995) el cual, además de ser altamente susceptible al virus de la tristeza de los cítricos, resulta también muy sensible a la psorosis y a los nemátodos (Curti-Díaz et al., 1996). México, por su parte, posee el 95 % del total de sus plantaciones susceptibles al VTC, ya que están injertados sobre patrones de naranjo agrio o son de "pie franco" (sin injertar) como los limones "Colima" o "Criollo" (C. aurantifolia L.), todos ellos extremadamente susceptibles al VTC (Orozco, 1996). El primer registro de VTC en México fue en plantaciones comerciales en Tamaulipas en 1983, y posteriormente en viveros del estado de Veracruz en Durante , el Centro Nacional de Referencia en un diagnóstico fitosanitario de la Dirección General de Sanidad Vegetal de la SAGAR, detectó plantaciones infectadas con VTC en Nuevo León, Quintana Roo y Veracruz. En 1997 se reporta en Baja California, en 1998 en Colima y Michoacán, en 1999 y 2000 en Quintana Roo, Campeche y Yucatán (Villarreal, 2001). 2

4 El vector más eficiente de la enfermedad, es el áfido Toxoptera citricidus Kirkardly (Brunt et al., 1997), elemento que desencadena con su diseminación la alta mortalidad de plantas. Ha sido reportado en varios países de Centro América, en migración hacia el Norte, así como en las islas del Caribe incluyendo a Cuba. Desde noviembre de 1995 se le ha detectado también en el estado de la Florida y en octubre de 1996 llegó a Belice (De la Osa, 1998). Como medida de prevención, ante esta seria enfermedad, desde hace años la mayoría de países citricultores afectados por el VTC ha ido sustituyendo el naranjo agrio (Citrus aurantium L.), por patrones tolerantes al VTC como son: los Citranges "troyer y "carrizo" (Citrus sinensis L. Osbeck x Poncirus trifoliata L. Raf.), la mandarina "Cleopatra" (Citrus reticulata Blanco), la lima "Rangpur" (Citrus aurantifolia L.) y el limón Volkameriano (Citrus volkameriana Pasq.) (RIAC, 1995; Medina, 1995; Orozco, 1996). Algunos de estos patrones como los Citranges "troyer" y "carrizo" (Citrus sinensis L. Osbeck x Poncirus trifoliata L. Raf.) además de tolerantes al VTC, pertenecen al grupo de patrones cuyo efecto sobre la calidad del fruto es alto (Padrón, 1991). Aunque en México se han desarrollado diversas acciones preventivas contra el VTC (López, 1994; Colli y Cárdenas, 1995; INEGI, 1996), no se cuenta, en la magnitud de lo necesario, con un programa de certificación de plantas de cítricos, que permita la producción de patrones tolerantes al VTC, ni de yemas certificadas de las principales variedades comerciales, de manera que los productores puedan contar con plantas certificadas como medio de defensa ante esta enfermedad (Orozco, 1996). Es por ello que la mayoría de los productores de la región del Golfo siguen empleando el naranjo agrio (Citrus aurantium L.) como patron, debido fundamentalmente a la poca disponibilidad de semilla y el gran desconocimiento que tienen sobre el comportamiento de otros patrones en sus plantaciones; por estas razones, algunos citricultores han optado por plantar alternadamente un patrón agrio y uno tolerante al VTC, dentro de cada hilera; de este modo esperan asegurar una supervivencia de al menos un 50 % de sus 3

5 árboles en caso de que se presenten algunas cepas severas de este virus (Curti- Díaz et al., 1996). De acuerdo con López (1994), en la zona norte de Veracruz, donde se encuentran diferencias notables en suelos y clima, no se puede recomendar el uso de un solo patrón como sustituto del naranjo agrio, por lo que afirma que la nueva tecnología exige precisión en la selección de un grupo numeroso de patrones, ya que cada uno de ellos presenta limitantes a las propiedades extremas físicas y química del suelo y otras enfermedades. Cabe resaltar que ante esta situación, desde hace algunos años, se han estado desarrollando algunas acciones, para lograr un adecuado control y prevención del VTC, por parte del Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Veracruz (CESVVER) en Coordinación con el Instituto Tecnológico Agropecuario No. 18 (ITA-18) de Ciudad Cardel, Ver., lo que ha conllevado, entre otras, al establecimiento de un vivero de patrones de cítricos tolerantes al VTC, que se ha venido caracterizando desde un punto de vista morfoagronómico (Coto y Rodríguez, 1998; Gómez et al., 1998). Las investigaciones dirigidas en particular al estudio, selección y propagación de patrones, que proporcionen las mejores características hortícolas, con los mejores requerimientos de control de plagas y enfermedades, constituye uno de los fundamentos necesarios, para cualquier industria citrícola y por ello cada país, con una citricultura viable, debe, con alta prioridad, adoptar un programa adecuado de producción de material de propagación (RIAC, 1995). Por todo lo anterior, la aplicación de las técnicas biotecnológicas con este propósito puede constituir una vía muy útil para apoyar los programas de producción y certificación de patrones y yemas tolerantes al VTC. 4

6 Sobre la base de todo lo antes expuesto, se propuso el desarrollo del presente trabajo con el objetivo general de establecer las condiciones para la inducción del proceso morfogenético en segmentos nodales de dos patrones de cítricos C. troyer y C. carrizo, tolerantes al Virus de la Tristeza. Como parte de este objetivo general, se propone el desarrollo de diversos experimentos con vistas a establecer; la técnica de desinfección y termoterapia más adecuada para la obtención de cultivos asépticos, la técnica para la inducción de brotes múltiples a partir de segmentos nodales, la combinación de reguladores de crecimiento más apropiada para la inducción del proceso de enraizamiento a partir de brotes y el tipo de sustrato más apropiado para la aclimatación de las vitroplántulas obtenidas a partir de la inducción del proceso morfogenético. 5

7 REVISIÓN DE LA LITERATURA 2.1. Origen y distribución de los cítricos Los cítricos son originarios de una vasta región comprendida por la Conchinchina, el Archipiélago Malayo y partes adyacentes de Asia (Palacios, 1978; Cameron y Soost, 1987). El conocimiento sobre la utilización de sus frutos, así como el cultivo de los árboles, se extendió desde China e India pasando a través de Persia y Palestina, hasta conocerse en Africa del Norte y Europa, en las áreas adyacentes a la cuenca del Mediterráneo (Palacios, 1978; Morín, 1985). La cidra, el naranjo agrio y el limonero, estuvieron entre las primeras especies conocidas, y fueron introducidas en Europa alrededor del año 1200 (Loussert, 1992). El naranjo dulce es originario de China y estuvo entre las primeras especies citrícolas más difundidas al resto del mundo (Palacios, 1978). Cuando Cristóbal Colón realizó los primeros viajes hacia América, llevó consigo semillas de naranjo dulce. En esa época los cítricos ya se habían distribuido en los países de la cuenca del mediterráneo, sobre todo en España, Italia y Grecia (Loussert, 1992). Los portugueses fueron quiénes introdujeron el naranjo dulce en Europa desde la India y China, durante los viajes que realizaban a través del Cabo de Buena Esperanza (Palacios, 1978). Se presume que el mandarino es originario de China y Conchinchina y pasó al Japón que es actualmente uno de los países de mayor producción (Palacios, 1978). En el año 1493, realizando Colón su segundo viaje, introdujo semillas de agrios a la Isla "La Española" (Santo Domingo) y "La Isabela" (Islas Bahamas) (Palacios, 1978; Loussert, 1992). Posteriormente se difundió a México y Cuba en 1517 (Palacios, 1978). Los portugueses en el año 1530, introdujeron el naranjo en Brasil cuando se lanzan a colonizar el Amazonas (Palacios, 1978; Coto y Rodríguez, 1998). En el año 1565, se introdujeron los primeros agrios a la Península de Florida, los Jesuitas llevaron los primeros cítricos a California años 6

8 después, distribuyéndolos en las zonas adyacentes del Pacífico (Palacios, 1978; Loussert, 1992). Los Jesuitas difundieron los cultivos de naranjos y limoneros con material proveniente de Paraguay. Por los años 1750 existían importantes huertos citrícolas en Paraguay, Brasil, Perú y Argentina (Palacios, 1978; Morín 1985) Clasificación botánica De acuerdo con Swingle y Reece (1967), los patrones de cítricos C. troyer y C. carrizo se ubican taxonómicamente dentro de la familia Rutaceae y la subfamilia Aurantioideae y pertenecen a la subtribu Citrinae. De acuerdo con estos autores existen dentro de esta subtribu 3 géneros que son: Citrus, Fortunella y Poncirus y dentro del género Citrus existen 10 especies, las que se relacionan en la Tabla 1. Tabla 1. Relación de especies del género Citrus de acuerdo con Swingle y Reece (1967) No. ESPECIES DE Citrus 1. Citrus sinensis (L.) Osbeck.- Naranjo dulce 2. C. aurantium L.- Naranjo agrio C. aurantium var. Myrtifolia Ker-Gawl.- Naranja mirtifoliado 3. C. reticulata Blanco.- Mandarinero C. reticulata var. Austera Swing.- Mandarina agria 4. C. grandis (L.) Osbeck.- Shaddock 5. C. paradisi Macf.- Toronjo 6. C. medica L.- Citrón C. medica var. Sarcodactylid (Noot.) Swing-Citrón de dedos C. medica var. Ethrog Engl.- Citrón Etrog 7. C. limon (L.) Burn.- Limonero Real 8. C. aurantifolia (Christm.) Swing.- Lima ácida o limonero sutil 9. C. indica Tan.- Naranjo silvestre hindú 10. C. tachibana (Mak.) Tan.- Naranjo Tachibana 7

9 2.3. Importancia del uso de patrones en cítricos Uno de los aspectos de mayor importancia para el éxito de una huerta citrícola, es la correcta selección de los patrones (Curti-Díaz et al., 1996). Wutscher (1979), ha indicado que los patrones han contribuido quizá más que ningún otro factor al éxito o fracaso de la industria citrícola en el mundo. De acuerdo con Castle et al. (1993), el uso de patrones tiene tres propósitos generales: Reducir el período juvenil o período improductivo del árbol, mediante el injerto de yemas maduras provenientes de árboles en producción. Tolerar las condiciones adversas de suelo, clima y agentes patógenos, para ampliar el área citrícola hacia regiones donde los cítricos normalmente no se desarrollan adecuadamente. Mejorar el comportamiento frutícola del árbol Patrones tolerantes al virus de la tristeza de los cítricos (VTC) Citrange troyer (Poncirus trifoliata (L.) Raf. X Citrus sinensis (L.) Osbeck) Este Citrange fue obtenido polinizando flores Washington navel (Citrus sinensis L. Osbeck) con polen de Poncirus trifoliata L. Raf. (Forner-Valero, 1985). Este patrón tiene muy buena aceptación en casi todas las regiones del mundo (Padrón, 1991). En lo que a virosis se refiere, es tolerante a la tristeza, psoriasis y cachexia-xyloporosis, pero es sensible a la exocortis (Padrón, 2001). El patrón es considerado como resistente a Phytophthora sp. pero sensible a exocortis. Tiene buena afinidad con variedades de naranjo dulce, mandarina y pomelo, pero es incompatible con el limón Eureka (Padrón, 1991; 2001). Este patrón induce buena 8

10 productividad y vigor, precocidad en la producción, frutos de alta calidad, es sensible a los altos contenidos de caliza activa en el suelo y a la salinidad (Coto y Rodríguez, 1998; Padrón, 1991; 2001) Citrange carrizo (Poncirus trifoliata (L.) Raf. X Citrus sinensis (L.) Osbeck) Este Citrange procede vegetativamente del mismo híbrido que originó a Citrange troyer, por lo que son prácticamente iguales desde el punto de vista morfológico, solo con pequeñas diferencias respecto a su comportamiento agronómico (Coto y Rodríguez, 1998; Padrón, 2001). Este híbrido variedad muestra una mayor tolerancia a la gomosis, al virus de la tristeza, la exocortis, la cachexia y la agalla de la madera. Resulta por otra parte, tolerante a la pudrición de la raíz, pero es sensible a Armillaria y a los nemátodos de los cítricos, y muestra resistencia a Phytophthora. Las variedades injertadas sobre este patrón son más productivas que sobre C. troyer (Coto y Rodríguez, 1998; Padrón, 2001). Este patrón presenta una respuesta aceptable al Boro y a los suelos arenosos, limosos y arcillosos, no así para los cloruros y suelos calcáreos (Ferguson et al., 1990). En cuanto al clima, es resistente al frío, pero la respuesta a la asfixia radicular es insatisfactoria (Coto y Rodríguez, 1998). En relación a sus características de vigor, tamaño y tolerancia a la sequía posee un comportamiento medio. Agronómicamente tiene un comportamiento medio para producción y tamaño del fruto y posee un alto porcentaje de zumo, acidez y sólidos solubles totales (Ferguson et al., 1990; Padrón, 1991). 9

11 2.4. Virus de la tristeza de los cítricos (VTC) La tristeza de los cítricos (VTC) es una enfermedad que afecta prácticamente a todas las especies citrícolas, pero principalmente al naranjo, toronjo y lima (Agrios, 1998) Etiología El virus de la tristeza de los cítricos, es un miembro del género Closterovirus, de la familia Closteroviridae (Orozco, 1995; Agrios, 1998; Isidrón et al., 2001). Microscópicamente se ha determinado que son partículas en forma de "varilla flexible" que mide 2,000 nm. (Orozco,1996; Agrios, 1998). Se han aislado, de preparaciones purificadas, algunos tipos de ácidos ribonucléicos de cadena simple con pesos moleculares de 5.4 a 6.5 por 10 y proteínas de cápside, con pesos de 28,000, 23,000 y 21,000 daltones (Medina, 1995; Agrios, 1998). El virus se encuentra por lo regular limitado al floema de los árboles afectados aunque también se ha detectado en la corteza de los tejidos jóvenes (Orozco, 1996; Brunt et al., 1997) Epidemiología y transmisión por vectores El VTC se transmite por áfidos, principalmente Toxoptera citricidus Kirkaldy (RIAC,1995; Rocha-Peña et al.,1995; Agrios, 1998; Brunt et al., 1997; SAGAR, 1993; Francis, 2001) y Aphis gossypii Glover (Roistacher y Bar-Joseph, 1987; Yokomi y Damgsteet, 1991). También por injerto de yema, transmisión mecánica en tallos de hospedantes susceptibles (toronja y limón mexicano) (Garnsey y Muller, 1988). La transmisión por semilla no ha sido demostrada (Bar- Joseph y Lee, 1989). 10

12 El grado de eficiencia en el proceso de la diseminación de la enfermedad varía con las especies de pulgones, razas del virus y especies hospederas (Isidrón et al., 2001). La especie Cuscuta sp. puede transmitir la enfermedad (Garnsey y Lee, 1988; Orozco, 1996). En 1930 se introdujeron a Brasil y Argentina cítricos provenientes de Africa del Sur y Asia, los cuales venían infectados por el VTC junto con el T. citricidus, diseminándose el virus (Roistacher y Moreno, 1991; Roistacher et al., 1991). En , El VTC, se introdujo sin el vector, de los países asiáticos a California, Florida, Israel y España por importaciones masivas de cítricos. Treinta a cincuenta años después de efectuadas las importaciones por los países antes mencionados, se descubrió un cambio en la transmisibilidad de muchos aislados del VTC severos, eficientemente diseminados por A. gossypii (Wallace, 1978; Moreno et al., 1983; Roistacher y Bar-Joseph, 1987; Yokomi y Garnsey, 1987; Garnsey y Lee, 1988; Yokomi y Damgsteet, 1991; Orozco, 1996). Los áfidos: A. gossypii, A. spiracoela y T. aurantii, son vectores poco eficientes en la transmisión del VTC (Roistacher y Bar-Joseph, 1987; Roistacher et al., 1991) Variabilidad del virus de la tristeza de los cítricos El VTC ocurre en la naturaleza en aislados o razas, las cuales pueden variar en gran medida, y la reacción y sintomatología en diversos hospedantes (Lee y Peña-Rocha, 1992; Isidrón et al., 2001). Las razas existentes en América del Sur, Sudáfrica, Australia y Asia producen daños severos en toronjas (C. paradisi L.) y naranja dulce (C. sinensis 11

13 L.). En Africa y Brasil, existen razas muy virulentas que además de afectar a las toronjas, afectan a todas las variedades del naranjo dulce y algunos patrones tolerantes, naranjo trifoliado, lima Rangpur, limón rugoso y mandarina Cleopatra (Moreno et al., 1983; Garnsey y Lee,1988; Lee et al., 1992; Orozco, 1996) Sintomatología de la enfermedad Los síntomas de VTC en árboles afectados dependen de si se presenta en árboles injertados sobre patrones susceptibles o tolerantes a la enfermedad (Orozco, 1996) Síntomas producidos en árboles injertados sobre naranjo agrio (C. aurantium L.) Los síntomas en árboles sobre patrones de naranjo agrio (C. aurantium L.) producen decaimiento de todas las variedades comerciales de naranja dulce (C. sinensis), toronja (C. paradisi), mandarina (C. reticulata Blanco). El limon mexicano (C. aurantium), el italiano (C. limon) y el eureka se han observado que se infectan menos (INIFAP, 1996; Padrón, 2001). La muerte de los árboles se debe a la obstrucción de los vasos conductores de la savia elaborada que sirve de alimento a las raíces (Wallace, 1978; Moreno et al., 1983; Garnsey y Lee, 1988; Lee y Rocha, 1992; Orozco, 1996). El colapso puede ser rápido con marchitamiento foliar de color cenizo y muerte repentina en 1 o 2 semanas, quedando secos por completo y solo persistiendo los frutos (INIFAP, 1996; Reyes de Acevedo y Palmieri, 1997). Declinamiento lento. En árboles jóvenes se presenta una abundante floración y amarre del fruto, el cual puede colorear prematuramente las nervaduras 12

14 de las hojas; éstas se aclaran y después se amarillan y caen, causando la muerte de las ramas y el acortamiento de los brotes vegetativos, reduciéndose el tamaño de la copa (Isidrón et al., 2001). Se produce además, lenta y gradualmente, la muerte de las raicillas, presentándose un descortezamiento y pudrición en todo el sistema radical en la unión patrón-injerto; al levantar la corteza (2 a 3 cm de ancho) con una navaja, se observan abundantes punteaduras en la cara interna de la corteza de naranjo agrio (C. aurantium L.) conocido como panal de abeja (Brunt et al., 1997; Isidrón et al., 2001), y en el tronco se presentan prolongaciones agudas, parecidas a las cerdas cortas y fibrosas de un cepillo (INIFAP,1996; Reyes de Acevedo y Palmieri, 1997). Los frutos producidos son de tamaño pequeño que se amarillean prematuramente y muestran un color más pálido que lo normal. Árboles sin declinamiento. Árboles que no muestran síntomas de la enfermedad; algunas veces presentan menor altura, hinchazón arriba de la línea de injerto y punteaduras en la corteza del patrón. Eso indica que está infectado con una raza débil del virus; lo anterior es muy importante, primero porque son focos de infección y segundo porque el comportamiento de estos árboles suele ser inestable, pudiendo manifestar declinamiento y muerte, transcurrido algún tiempo. Algunas de estas razas han sido utilizadas para la protección cruzada con el objeto de reducir la diseminación de razas severas de VTC (Orozco, 1995; INIFAP, 1996; Reyes de Acevedo y Palmieri, 1997; Isidrón et al., 2001) Síntomas en árboles sobre patrones tolerantes El síntoma más característico es la presencia de acanaladuras en la madera ocasionando que las ramas sean muy quebradizas y se rompan con facilidad con el viento; el follaje puede presentar síntomas de decaimiento y deficiencias nutricionales, lo que conduce a una disminución en la producción y a una baja calidad de los frutos (Orozco, 1996). 13

15 Métodos de detección del VTC Los métodos de diagnóstico de la enfermedad se han incrementado en las últimas décadas y va desde la utilización de plantas indicadoras, serología, técnicas basadas en el análisis de ácidos nucléicos, la utilización de sondas marcadas, la amplificación por cadena de polimerasa y la combinación de diferentes técnicas (Francis, 2001). El VTC está constituido de proteínas y doble cadena de ARN (Guerri et al., 1990; Brunt et al., 1997). La detección se realiza por métodos electroforéticos, conociéndose 7 tipos de virus que causan la enfermedad en base a la posición de bandas de ARN (Moreno et al., 1983). Entre los métodos de detección del VTC que más se han empleado se encuentra la prueba de ELISA, que detecta la presencia de la enfermedad en plantas, aún cuando no se manifiestan sus síntomas (SAGAR, 1997b; Garnsey et al., 1993). Otro método consiste en el uso de los anticuerpos monoclonales (ACM), y se emplea como herramienta para conocer la diversidad de epítopes existentes en la cubierta proteica de los aislados de VTC. Estos estudios permiten establecer serogrupos de aislados teniendo en cuenta su reacción frente a diferentes anticuerpos monoclonales (Gutiérrez, 1996) Control legal a). Norma Oficial Mexicana. La operatividad de la campaña fitosanitaria se establece en el proyecto de Norma oficial mexicana NOM-031-FITO-1995, que tiene por objeto establecer las medidas fitosanitarias que deben aplicarse para prevenir, combatir, controlar y/o erradicar al VTC en las diferentes zonas citrícolas (SAGAR, 1997a). 14

16 b). Dispositivo Nacional de Emergencia. Con fundamento en el artículo 46 de la Ley Federal de Sanidad Vegetal se establecerá el dispositivo nacional de emergencia cuando se detecte la presencia de plagas que pongan en situación de emergencia a una o varias especies vegetales en todo o en parte del territorio nacional; en caso de requerirse es factible el dispositivo nacional de emergencia para la destrucción de brotes del virus de la tristeza de los cítricos (SAGAR, 1997a). c). Regulación cuarentenaria El objetivo de esta medida es evitar la entrada ilegal de material vegetativo procedente de áreas donde el VTC está presente (Garnsey y Lee, 1988; Moreno et. al., 1983; Orozco, 1996). c.1. Nacional. Debido a la presencia de VTC en el estado de Veracruz, catalogado como el principal estado proveedor de material propagativo, y considerando la potencial existencia de VTC y su posible diseminación a otras entidades, se establece como requisito fitosanitario que la movilización de material propagativo (plantas) debe hacerse únicamente mediante el certificado fitosanitario para la movilización nacional, previo diagnóstico fitosanitario negativo por un laboratorio aprobado (SAGAR, 1997a). c.2. Internacional. Un alto riesgo de introducción del VTC y su vector, representa la importación directa de germoplasma de cítricos procedentes de áreas donde el VTC es endémico, o de aquellos países que han sufrido la introducción del patógeno a su territorio (SAGAR, 1997a). Se regula la importación de plantas, yemas o cualquier material propagativo de cítricos de los países afectados por el virus de la tristeza, a excepción de aquellos donde se compruebe mediante verificación, en origen, por personal aprobado o acreditado de la Secretaria de Agricultura, que los productos proceden de áreas libres del patógeno 15

17 (SAGAR, 1997a). Se permite la introducción de material propagativo de plántulas in vitro, previo cumplimiento de los requisitos fitosanitarios establecidos por la Secretaria y certificado por el país de origen (SAGAR, 1997a) Programa de certificación del material libre de virus La amenaza que representa para toda la citricultura de México el VTC y su vector, hace a la campaña contra el VTC como una prioridad dentro de la fitosanidad nacional, por lo que es imperativo establecer medidas fitosanitarias extremas para prevenir una situación de daño casi irreversible para la citricultura nacional, siendo el eje principal el establecimiento de centros de producción de material propagativo de cítricos certificados o viveros certificados, que proporcionen material propagativo tolerante certificado y de calidad varietal para la sustitución y establecimiento de nuevas plantaciones (SAGAR, 1997a) Erradicación Esta medida conlleva la eliminación total de los árboles enfermos en un área determinada, que pongan en riesgo la citricultura nacional (SAGAR, 1997a) Uso de patrones tolerantes a VTC La utilización de patrones tolerantes como medida de combate es una práctica necesaria, sobre todo en países donde existen razas altamente virulentas, capaces de causar daños directos en variedades infectadas sobre los patrones (Orozco,1996). La necesidad de utilizar patrones tolerantes al VTC, con cualidades deseables, ha propiciado la evaluación de cultivares, híbridos y parientes de los cítricos, originando con ello información sobre el comportamiento 16

18 de los cítricos injertados sobre muchos patrones diferentes. Los principales criterios de selección son: tolerancia a enfermedades y nemátodos, tolerancia a la salinidad y tipo de suelo, y efecto del patrón sobre el árbol (compatibilidad) (Padrón, 2001). Actualmente, en México se utilizan los siguientes patrones tolerantes a VTC: mandarina Cleopatra, mandarina Sunki, mandarina Sun chu sha, naranja trifoliada, citranges (troyer y carrizo), citrumelos swingle, limón rugoso, C. volkameriana y lima Rangpur (Padrón, 2001) Protección cruzada El método de protección cruzada consiste en infectar la planta con una variante atenuada de un virus, con vistas a desarrollar una sintomatología menos severa de la enfermedad, al ser infectadas por una variante más severa del mismo virus (Gonsalves y Garnsey, 1989; Gutiérrez, 1996). Este método, sin embargo, puede generar algunas dificultades, dado entre otras, a que la variante atenuada puede mutar y convertirse en una variante severa; por otra parte, puede existir sinergismo entre la variante protectora (atenuada) y la variante severa, o con otro virus, ocasionando una enfermedad más severa. Otro problema que reviste este método es la dificultad que conlleva la identificación y selección de una variante atenuada adecuada, ya que puede resultar un proceso muy largo. Incluso la variante atenuada seleccionada en una área o región determinada puede comportarse como variante severa en otra área. La resistencia observada durante la protección cruzada puede deberse a la interacción especifica entre uno o más genes virales de la variante protectora y uno o más genes de la variante atacante, resultando en la reducción y/o inhibición de la multiplicación de la variante atacante (Fitchen y Beachy, 1993; Gutiérrez, 1996). Esta medida ha sido implementada en Brasil (Muller et al., 1988), Africa del Sur (Garnsey y Lee, 1988) y Australia (Broadbent et al., 1991). En estos casos, la medida más efectiva para combatir el VTC es la protección de las diferentes especies de cítricos con cepas 17

19 benignas. En Brasil este método se ha utilizado para proteger los cítricos de razas de virus que ocasionan el picado del tallo (Orozco, 1996) Embrionía sexual y nucelar La mayoría de las especies cítricas presentan poliembrionía, o sea, que una sola semilla puede tener dos o más embriones; sin embargo, sólo uno de éstos proviene de la fusión de los gametos femenino y masculino dentro del óvulo; es decir, en una semilla poliembriónica solo un embrión es de origen sexual y los restantes se originan de las células somáticas del nucelo de la planta madre y se extienden fuera del saco embrionario (Palacios, 1978). Salvo la posibilidad de mutaciones, las plántulas provenientes de embriones nucelares, mantienen una constitución genética idéntica a la planta madre y se caracterizan por su vigor y uniformidad (Palacios, 1978). Las plantas originadas por embriones sexuales o gaméticos, se distinguen fácilmente de las nucelares por débil crecimiento, diferencias morfológicas y de desarrollo, y es frecuente que el embrión nucelar domine al sexual y no lo deje desarrollar (Palacios, 1978). Por eso en algunas especies y variedades, las semillas producen casi exclusivamente plantas nucelares, lo cual indica que el embrión sexual estuvo obstaculizado o fue demasiado débil para vivir (Cameron y Soost, 1987). Existen algunas especies cítricas monoembriónicas entre las que se encuentra la toronja (Citrus grandis Osbeck), los mandarinos (Citrus reticulata Blanco) y las cidras (C. medica L.) (Palacios, 1978). 18

20 2.6. Métodos de propagación de los cítricos Métodos convencionales de propagación Propagación por semilla Los cítricos se pueden reproducir por semilla, sin embargo este método de propagación presenta diversas desventajas, entre las que se pueden incluir: juvenilidad, producción errática, gran tamaño y susceptibilidad a la pudrición de pie por Phytophthora. Esta enfermedad fue el factor que influyó en gran medida para que se optara por los árboles injertados, en vez de árboles por semilla (Castle, 1987), por lo que actualmente los cultivares comerciales de cítricos se propagan por injerto de yema, sobre patrones, siendo las fuentes preferidas para estos últimos los de origen nucelar (Cameron y Soost, 1987). Es por ello que la poliembrionía en los cítricos y sus géneros afines Poncirus y Fortunella, es de gran importancia en los trabajos de micropropagación de microinjertos, pues aún multiplicando por semilla, la embrionía nucelar permite obtener plantas muy uniformes con todas las características de la planta madre (Coto y Rodríguez, 1998) Propagación por injerto El injerto es sin duda alguna el procedimiento tradicional más utilizado en la propagación de los cítricos, pues es el que ofrece las mayores ventajas sobre los otros métodos de reproducción (Padrón, 2001). La técnica consiste en conseguir la unión íntima de dos especies diferentes, de tal manera que ambas se sueldan, permanezcan unidas y continúen su vida de esa manera, formando una especie de simbiosis. Una de las especies, utilizada como patrón contribuye con su sistema radical. Este debe provenir de plantas nucelares; la otra especie, el cultivar o variedad, dará lugar a la parte aérea, pudiendo haberse derivado de una yema simple o de una vareta o púa, que provenga de fuentes sanas y certificadas 19

21 (Padrón, 2001). La unión íntima de ambas partes solo se puede llevar a cabo cuando el contacto se realice entre el cambium de una con el cambium de la otra. Es decir, para que puedan soldarse las dos especies es necesario poner en contacto estrecho sus meristemos secundarios. Estas dos partes llegan a constituir una completa unidad en su fisiología y en su funcionamiento total, como si se tratara de un solo individuo, pero permaneciendo invariable su constitución genética de cada una de ellas. Por ello, la parte aérea producirá frutos correspondientes a un tipo de variedad o clon especial al que pertenezca y toda su morfología y características intrínsecas permanecerán invariables, salvo algunas influencias que sobre ella determine el patrón (Calderón, 1993). En los cítricos se pueden aplicar varias técnicas de injerto, siendo el injerto de yema o escudete el de uso más frecuente porque se puede obtener un número máximo de planta a partir de una cantidad limitada de varetas por yemas (Palacios, 1978). Los injertos de púa se pueden emplear también como los del enchapado lateral, en aquellos casos en los que las varetas y los patrones son demasiado pequeños para utilizar yemas (Cameron y Soost, 1987). Los patrones de cítricos se deben injertar cuando alcancen una edad de 12 a 15 meses, o alcancen una altura de cuando menos 45 cm. Cuando presenten cualquiera de estas condiciones deben prepararse para el injerto; éste se realiza removiendo las hojas y espinas a una altura de 45 cm una semana antes de ser injertados (Opeke, 1982). Por otra parte, las yemas que se empleen en el injerto de los patrones, se deben colectar en la mañana del mismo día y deben ser utilizados lo más pronto posible (Opeke, 1982). Actualmente existe un gran número de patrones y variedades comerciales para la propagación de los cítricos, pero la elección de las combinaciones para los injertos deben efectuarse con sumo cuidado pues es una decisión clave para el éxito de cualquier explotación citrícola, ya que algunas combinaciones patrón- 20

22 injerto, no son compatibles y las plantas injertadas pueden declinar e inclusive morir (Castle, 1988). A los injertos se les atribuyen algunas desventajas, tales como menor vida comercial y un menor desarrollo de las plantas, comparadas a las obtenidas por semilla. Sin embargo, varios especialistas, entre ellos Padrón (1991), coinciden en que en la propagación por injerto los problemas que se presentan deben ser atribuidos a una mala selección del patrón, el cual puede ser poco vigoroso, mal adaptado al suelo o tener una compatibilidad deficiente Métodos biotecnológicos de propagación Microinjertación Esta técnica desarrollada primeramente por Murashige et al. (1972) y puesta en práctica por Navarro et al. (1975) y Francis (2001), permite la obtención de plantas libres de virus, mediante la inducción al desarrollo de un explante de meristemo apical, sobre el epicotilo decapitado de una plántula originada a partir de una semilla, en un medio apropiado y bajo condiciones asépticas. De acuerdo con Navarro et al. (1975) es posible lograr entre un 30% - 50% de éxito en la aplicación de esta técnica y en algunos casos se ha reportado hasta un 90% (Chen et al., 1992). La técnica de microinjerto posee además la ventaja de que permite la eliminación no solo del virus de la tristeza sino también de otros virus como la psorosis y la exocortis (Monteverde et al., 1999; González et al., 1980), como indicaran Gravina y Piestum (1991), quienes mencionan que la no detección de virus en 400 plantas de distintas variedades de Citrus obtenidas por microinjerto y cuya fuente original se encontraba afectada por uno o más de los virus de psorosis, amarillamiento, concavidad gomosa, hoja rasgada, infección jaspeada, xyloporosis, exocortis y Spiroplasma citri, entre otros, demuestra la alta eficiencia de esta técnica para la eliminación de distintas razas de estos virus. Por otra parte, se ha indicado (Navarro et al., 1975) que los microinjertos obtenidos no muestran características de juvenilidad, lo que les permite incluso florecer y 21

23 fructificar en menos de un año. Es por ello que esta técnica se ha utilizado en muchos países cítrícolas del mundo para obtener yemas libres de virus, con vistas a su uso en la propagación comercial de cítricos (González et al.,1977; Starrantino, 1992; Monteverde et al., 1999; Gravina y Piestum, 1991; Paiva et al., 1993; Zarei y Rahimian, 1997; Mukhopadhyay et al., 1997; Parthasarathy et al., 1997). La frecuencia de éxito de los microinjertos se incrementa con el tamaño del explante meristemático, pero disminuye el porcentaje de plantas libres de virus (Navarro et al., 1975), aunque muchas veces esta relación depende del patógeno (Litz et al.,1985). Por ello, se considera óptimo, para lograr un buen equilibrio entre el porcentaje de microinjertos prendidos y la eliminación de virus, el empleo de explantes meristemáticos cuyos tamaños oscilan entre mm y que posean de 2 a 4 primordios foliares (Navarro et al.,1975; Gravina y Piestum,1991). En México, como apuntara Chagolla (1990), se han logrado obtener plantas de cítricos libres de virus, siguiendo la metodología propuesta por Navarro et al. (1975) gracias entre otros, a los trabajos desarrollados en el Campo Experimental de "General Terán" del INIFAP Embriogénesis somática De igual forma, se ha logrado inducir en cítricos el proceso de embriogénesis somática especialmente en aquellas especies poliembriónicas (Kunitake et al., 1991; Gill et al., 1994; Gill et al., 1995; Belkoura et al., 1995). Sin embargo, los callos embriogénicos producidos, pueden presentar cierta inestabilidad genética, que no los hacen muy apropiados para su uso como método de propagación (Pierik, 1990). 22

24 Inducción de embriones nucelares Los primeros trabajos de propagación in vitro en cítricos se realizaron desde la década de los sesenta con la inducción de embriones nucelares en tres especies monoembriónicas de cítricos (Rangan et al., 1968). Desde entonces se han venido desarrollando numerosos trabajos para la propagación de cítricos a partir de tejidos nucelares de óvulos fertilizados (Rangan et al., 1969; Chaturvedi y Mitra, 1974) y no fertilizados (Button y Borman, 1971). Sin embargo, los métodos antes mencionados son tediosos y poseen entre otros inconvenientes el que solamente se puedan disponer de óvulos que se encuentren en un estadio apropiado de desarrollo en un corto período del año, además de que las plántulas obtenidas por esta vía muestran características de juvenilidad (Chaturvedi y Mitra, 1974). Estas características se manifiestan en forma de árboles muy altos y espinosos, más lentos para entrar en fructificación, producción alternante más marcada, un mayor grosor de la corteza del fruto y de la pulpa (Monteverde et al., 1999) Organogénesis directa También ha sido muy empleada la regeneración de plantas de cítricos, principalmente por la vía de la organogénesis directa (Litz et al.,1985). Esta técnica ha sido descrita en diversos tejidos como raíces (Sauton et al., 1982; Starrantino y Caruso, 1986; Raman et al., 1992) secciones de hojas (Chaturvedi y Mitra,1974) y secciones de tallo (Moore,1986; Raman et al., 1992 ; Mas et al., 1994; Harada y Murai, 1996; Thirumalai y Thamburaj, 1996; Pérez Molphe-Balch y Ochoa- Alejo, 1997). Dentro de éstas se han logrado muy buenos resultados con el empleo en particular de explantes a partir de segmentos de tallo (Can et al., 1992; Pérez-Molphe- Balch y Ochoa-Alejo,1997). 23

25 Algunos autores (Rangaswamy, 1961; Murashige y Tucker, 1969), consideran que las condiciones de cultivo más adecuadas para la inducción de la organogénesis en cítricos, implican mantener los cultivos a una intensidad lumínica de 3,000 luxes por un período diario de 12 a 16 horas y a una temperatura de 25 a 30 C. Los mismos autores coinciden en señalar que la sacarosa satisface los requisitos en la mayoría de los tejidos de cítricos si se emplea en una concentración de 5% (p/v). De forma general, el análisis de los resultados sobre cultivo in vitro en cítricos muestran diferencias en las respuestas de los explantes aún usando técnicas similares, dada la influencia entre otros de factores como son: tipo de tejido, preparación de los mismos, composición química del medio de cultivo y condiciones de cultivo (Espinoza,1994) Cultivo de meristemos El cultivo de meristemos, que ha resultado exitoso en varias especies vegetales para limpiar materiales infectados por virus, no siempre ha dado buenos resultados en cítricos (Litz et al., 1985 ; Gravina y Piestum, 1991). Esta técnica es la que constituye la ruta más fácil y la que menos cambios genéticos provoca ya que no requiere de la iniciación y diferenciación de órganos adventicios, sino solamente desarrollar los puntos de crecimiento presentes en las yemas. Esta vía ha sido empleada, entre otros, por Mosella y Ascui (1985), Lukman et al. (1990), Omura y Hidaka (1992) y Baruah et al. (1996). Hoy en día, como indicara Baldwin (1993), el cultivo de meristemos se ha adaptado muy bien para la producción comercial de yemas de cítricos libres de virus, fundamentalmente en Florida. Lukman et al. (1990) obtuvieron mejores resultados en el cultivo de meristemos de Citrange troyer empleando primeramente medio MS líquido (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 1 mg.l -l de ácido giberélico (AG 3 ) y 24

26 0.8 mg.l -1 de benciladenina (BA) y luego medio MS sólido suplementado con 0.01 mg.l -1 de ácido naftalenacético (ANA), 0.5 mg.l -1 de BA y 1.0 mg.l -1 de AG 3. Singh et al. (1994) lograron inducir un mayor número de brotes (alrededor de 6 brotes por yema) a partir de cultivo de ápices de 5 a 6 mm de longitud provenientes de plantas maduras de Citrus reticulata Blanco cv. mandarina "Khasi" y C. limon Burm f. cv. "limón Asam" en medio MS, suplementado con BAP (6- bencilaminopurina), ANA y cinetina (6- furfurilaminopurina). Estos autores constataron la importancia del empleo de una combinación de ANA, AIB (ácido indolbutírico) y BAP para lograr un mayor éxito en la formación de brotes múltiples y durante el proceso de enraizamiento, y recomendaron el empleo del medio MS suplementado con 1 mg.l -1 de BA, 0.5 mg.l -1 de cinetina y 0.5 mg.l -1 de ANA para lograr una tasa más elevada de proliferación de brotes en ambas especies Cultivo de segmentos nodales Con este nombre se le conoce al aislamiento de una yema junto con una porción de tallo, para obtener un vástago o brote a partir de la yema. Este es el método más natural de propagación vegetativa de las plantas in vitro, ya que también puede aplicarse in vivo. Cada una de las yemas que se encuentran en las axilas de las hojas idénticas a las del ápice del tallo, pueden ser cultivadas en un medio nutritivo, intentándose así su desarrollo in vitro, realizándose los repicados cuando son necesarios (López y Avitia, 1991). Cuando se obtiene un número suficientemente grande de vástagos o brotes, éstos son enraizados y finalmente se realiza la transferencia al suelo (López y Avitia, 1991). El aislamiento de yemas y ápices del vástago, es una técnica donde en principio no se añaden citocininas para romper la dominancia apical (Pierik, 1990). En algunos casos, las giberelinas y las citocininas pueden estimular la ruptura de la dormancia de las yemas. La etiolación (causada por la oscuridad o la baja irradiancia) puede producir la ruptura de la dormancia de las yemas (Pierik, 1990). Esta técnica no es recomendable 25

27 cuando existen infecciones internas. La velocidad de propagación depende del número de yemas disponibles y de la tasa de multiplicación in vitro (Pierik, 1990) Importancia del cultivo in vitro en cítricos El empleo de las técnicas biotecnológicas como la micropropagación, ya sea a través del cultivo de meristemos y de microinjertos, en combinación o no con las técnicas de termoterapia, así como la inducción del proceso de embriogénesis somática, constituyen en la actualidad alternativas muy prometedoras para obtener plantas de cítricos libres de virus (Duran-Vila y Marín, 1991; Iglesias et al., 2000; Francis, 2001). Es por ello que en los últimos años se ha puesto un mayor énfasis en el empleo de las técnicas de cultivo de células somáticas y otras técnicas moleculares en el mejoramiento genético de los cítricos (Gill et al.,1995). En particular en cítricos, los métodos de multiplicación aséptica presentan numerosas ventajas con respecto a los métodos tradicionales de propagación, debido entre otras, a que permiten obtener altas tasas de multiplicación en corto tiempo, empleando espacios reducidos y sin las limitaciones impuestas por la época del año, además de que posibilitan la eliminación de patógenos no obligados y promueven la liberación de patógenos sistémicos (Chagolla,1990). Asimismo, como indicaran Mas et al. (1991), mediante esta vía se facilita el transporte e introducción de material vegetativo, sin el riesgo de transmisión de enfermedades. 26

28 MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Localización La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Genética Forestal de la Universidad Veracruzana, ubicado en el Parque Ecológico "El Haya", en el kilómetro 1.5 carretera vieja Xalapa- Coatepec, Ver., durante el período comprendido entre Septiembre de 1998 al mes de Marzo del Material Vegetal Para el desarrollo del presente trabajo se emplearon semillas importadas de Citrange troyer (C. troyer) y Citrange carrizo (C. carrizo) (Citrus sinensis Osbeck X Poncirus trifoliata Raf.) provenientes de Willits & New Comb, Inc. Arvin California, Estados Unidos (ANEXO 1) Medios de Cultivo El medio base de cultivo utilizado para la presente investigación fue el de Murashige y Skoog (1962) y las vitaminas de Gamborg (ANEXO 2) conteniendo 6 g.l -1 de agar y 30 g.l -1 de sacarosa. El medio se ajustó a un ph de 5.7 ± 0.1 con una solución de NaOH 0.1 N. En todos los experimentos in vitro se utilizaron tubos de ensaye de 120 X 25 mm; a cada tubo se le añadió una alícuota de 25 ml de medio. Los tubos fueron sellados con papel aluminio y Kleenpack*. La esterilización se efectuó en una autoclave a 121 C y a una presión de vapor de 27

29 1.05 Kg.cm -2 durante 15 minutos. Los medios esterilizados y gelificados a temperatura ambiente fueron mantenidos en área aséptica hasta su siembra Condiciones de incubación Las semillas se cultivaron en completa oscuridad, a 27 ± 1 C. Para la inducción de brotes y enraizamiento de las partes aéreas, se mantuvieron a 25 ± 2 C con una intensidad lumínica de 1,200 lux, utilizando lámparas Osram* Daylight. Los tubos de ensaye fueron sellados con papel aluminio y Kleenpack * a fin de evitar la contaminación exógena, y posteriormente se colocaron en gradillas sobre anaqueles, a una distancia de 50 cm de las lámparas de luz blanca Procedimiento experimental Para el desarrollo del presente estudio fue seguido el esquema de trabajo que se muestra en la Figura 1. 28

30 C. carrizo (C. sinensis Osbeck X P. trifoliata Raf.) SELECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL C. troyer (C. sinensis Osbeck X P. trifoliata. Raf.) Experimento 1: CARACTERIZACION MORFOMÉTRICA DE SEMILLAS DE C. troyer y C. carrizo (C. sinensis Osbeck X Raf.). Experimento 2.- ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS ASÉPTICOS DE PATRONES C. troyer, C. carrizo (C. sinensis Osbeck X P. trifoliata Raf.) TOLERANTES A VTC. Experimento 3.- INDUCCION DE BROTES A PARTIR DE SEGMENTOS NODALES DE C. Troyer y C. carrizo (C. sinensis Osbeck X P. trifoliata Raf.) TOLERANTES A VTC. Experimento 4.- DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE AUXINAS SOBRE LA FORMACION DE RAICES EN PARTES AEREAS DE C. troyer y C. carrizo (C.sinensis Osbeck X P. trifoliata Raf). Experimento 5.- ACLIMATACION DE PATRONES DE C. troyer y C. carrizo (C.sinensis Osbeck X P. trifoliata Raf). ESTABLECIMIENTO Y METODOLOGIA PARA LA MICROPOPAGACION DE PATRONES DE CITRICOS TOLERANTES A VTC FIGURA 1. Procedimiento experimental empleado para el establecimiento de una metodología para la micropropagación de dos patrones de Cítricos tolerantes al VTC. 29

31 Experimento 1. Caracterización morfométrica de semillas de C. troyer y C. carrizo (C. sinensis Osbeck X P. trifoliata Raf.) Para la caracterización morfométrica de la semilla de los dos patrones en estudio se tomó una muestra aleatoria de 30 semillas, a fin de evaluar los caracteres: largo, ancho, grosor, relación largo/ancho y peso de la semilla. Las mediciones morfométricas fueron realizadas con una regla vernier. Se utilizó película Kodak 35 mm, ASA 200 para la fotografía de las semillas de los dos patrones en estudio. Los datos se procesaron estadísticamente por medio de un análisis de varianza (ANOVA) de clasificación simple de efectos fijos, mediante el programa STATISTICA (Versión 4.5). Se calcularon los valores de Coeficiente de Variación (CV) y Factor de Variación (FV). Este último se determinó mediante la metodología propuesta por el CIAT (1985). Se empleó el Programa Excel (versión 97) para la presentación gráfica de los resultados obtenidos Experimento 2. Establecimiento de cultivos asépticos de los patrones C. troyer y C. carrizo (C. sinensis Osbeck x P. trifoliata Raf.) tolerantes al VTC Desinfección y termoterapia de la semilla La predesinfección de la semilla se llevó a cabo con abundante agua y jabón; enjuagándose por tres veces con agua destilada. Para la desinfección de las semillas de los patrones fue empleada la metodología propuesta por Navarro et al. (1975) en donde se aplicaron diferentes tratamientos con Benomyl (Metil 1- butil carbamoil) -2- bencimidazol carbamato) (González, 1988), conocido comercialmente como Benlate* (1 g.l -1 ) y Clorox* (Tabla 2), y tres enjuagues posteriores con agua destilada estéril. Por último, fueron sometidas a diferentes 30

32 tratamientos de temperatura, según lo recomendado por Gravina y Piestum (1991), Calavan et al. (1972), y Roistacher y Calavan (1972). Tabla 2. Tratamientos de desinfección y termoterapia de las semillas de patrones de C. troyer y C. carrizo TRATAMIENTOS BENLATE* HIPOCLORITO DE (1g.l -1 TEMPERATURA )/TIEMPO SODIO (%)/TIEMPO ( C)/TIEMPO (min) (min) (min) 1 20 min. 25 / C / min. 25 / C / min. 30 / C / min. 30 / C / min. 25 / C / min. 25 / C / min. 30 / C / min. 30 / C / Siembra de semilla Las semillas se manejaron bajo condiciones asépticas, en cámara de flujo laminar. Realizada la desinfección y la termoterapia, se extirpó el tegumento a las semillas con una pinza estéril y bisturí, bajo el microscopio estereoscópico con aumento de 10X. Estas se sembraron bajo un diseño completamente aleatorizado, con 5 repeticiones por tratamiento, en medio MS al 50%, adicionando 6 g.l -1 de Agar. A cada tubo de ensaye, de 120 X 25 mm, se le añadió una alícuota de 25 ml de medio, ajustado a un ph de 5.7 ±. 0.1 con una solución de NaOH 0.1N. Finalmente los cultivos se incubaron bajo completa oscuridad, a 27 ± 1 C, por 15 días, según lo recomendado por Gravina y Piestum (1991). A las 72 horas de incubación, se evaluó visualmente la contaminación bacteriana y fúngica, manifestadas por turbidez y/o presencia de hifas en el medio 31

33 de cultivo. Se contabilizó el número de semillas contaminadas por tratamiento, así como el número de semillas germinadas, a los 15 días posteriores a la siembra. Para efectuar la prueba serológica de ELISA, para el diagnóstico de VTC, se enviaron 5 muestras de plantas de ambos patrones al Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa, A.C. (LATEX). Se empleó un diseño experimental con arreglo factorial de 2 X 8 (2 patrones X 8 tratamientos) y gráficas de barras del programa Excel (versión 97) para la presentación de los resultados. Se utilizó película Kodak* 35 mm, ASA 200, para la fotografía de los mismos Experimento 3. Inducción de brotes a partir de segmentos nodales de C. troyer y C. carrizo (C. sinensis Osbeck X P. trifoliata Raf.) tolerantes al VTC Efecto de diferentes combinaciones hormonales en la inducción de brotes a partir de segmentos nodales utilizando BAP, ANA y AG 3 A fin de conocer el efecto de diferentes reguladores de crecimiento sobre el proceso morfogenético en cítricos, se sembraron bajo condiciones asépticas, en campana de flujo laminar, secciones de segmentos nodales de aproximadamente 2 cm de longitud de los 2 patrones en estudio (Pierik, 1990). Estas se sembraron bajo un diseño completamente aleatorizado con tres repeticiones por tratamiento hormonal aplicados en tubos de 120 X 25 mm, con alícuotas de 20 ml de medios de MS, conteniendo las combinaciones hormonales que se indican en la Tabla 3, así como las vitaminas de Gamborg, 6 g.l -1 de agar, 30 g.l -1 de sacarosa. En todos los casos se ajustó el medio a un ph de 5.7 ± 0.1 con una solución de NaOH 0.1 N. 32

34 Tabla 3.- Tratamientos hormonales empleados en el proceso de inducción de brotes en los patrones C. troyer y C. carrizo. TRATAMIENTO PATRONES BAP (mg.l -1 ) ANA (mg.l -1 ) AG 3 (mg.l -1 ) 1 C. troyer C. troyer C. troyer C. carrizo C. carrizo C. carrizo Los cultivos fueron mantenidos a 25 ± 2 C, con 16 horas luz y 8 de oscuridad, bajo una intensidad lumínica de 1,200 lux, con lámparas Osram* Daylight de 22 W. Después de 15 y 30 días se evaluaron las siguientes variables: Número de brotes por explante, callo, vigor y longitud del brote. El vigor se determinó en base a la siguiente escala: 1. Plantas poco vigorosas. De color verde pálido en hojas y tallo, de 1 a 2 cm de altura. 2. Plantas vigorosas. De color verde intenso en hojas y tallos, de 2 a 3 cm de altura. Los datos se procesaron estadísticamente efectuándose el análisis de varianza (ANOVA) bifactorial 3 X 2 (3 tratamientos hormonales X 2 patrones) mediante el programa STATISTICA (versión 4.5). Para la presentación de los resultados se emplearon gráficas de barra del programa Excel (versión 97) y se utilizó película Kodak* 35 mm, ASA 200, en la fotografía. 33

35 Evaluación de diferentes concentraciones de BAP en los procesos de inducción de brotes en dos patrones de cítricos: C. troyer y C. carrizo Las plántulas de los dos patrones provenientes del experimento número 2, se manejaron bajo condiciones asépticas en campana de flujo laminar. Estas se seccionaron con un bisturí en varios segmentos nodales de aproximadamente 2 cm de longitud (Pierik, 1990). Los segmentos nodales obtenidos se sembraron bajo un diseño completamente aleatorizado, con tres repeticiones por cada tratamiento aplicado, a cada patrón en estudio (Tabla 4). La siembra se efectúo en tubos de 120 X 25 mm con alícuotas de 20 ml de medio MS, adicionado con vitaminas de Gamborg, 6 g.l -1 de agar y 30 g.l -1 de sacarosa; el medio se ajustó a ph de 5.7 ± 0.1 con una solución de NaOH 0.1N. Tabla 4.- Tratamientos hormonales empleados en el proceso de inducción de brotes de C. troyer y C. carrizo PATRONES TRATAMIENTOS DE BAP C. troyer 2 mg.l -1 4 mg.l -1 6 mg.l -1 C. carrizo 2 mg.l -1 4 mg.l -1 6 mg.l -1 Los cultivos se mantuvieron a una temperatura de 25 ± 2 C, con 16 horas luz y 8 de oscuridad, bajo una intensidad lumínica de 1,200 lux, con lámparas Osram* Daylight de 22 W. A los 30 días se evaluaron las siguientes variables: Número de brotes por explante, longitud del brote y vigor (de acuerdo a la escala definida con anterioridad). Los datos se procesaron estadísticamente efectuándose el análisis de varianza (ANOVA) bifactorial 3 X 2 (3 concentraciones X 2 patrones) mediante el programa STATISTICA (versión 4.5). 34

36 Se emplearon gráficas de barra de acuerdo con el programa Excel (Versión 97) y se tomaron fotografías con película Kodak* 35 mm, ASA 200 para la presentación de los resultados Experimento 4. Efecto de tratamientos de auxinas sobre la formación de raíces en C. troyer y C. carrizo (C. sinensis Osbeck x P. trifoliata Raf) Enraizamiento Se seleccionaron los brotes mayores de 2 cm de longitud, se seccionaron con un bisturí y se sembraron para estimular la formación de raíces en el medio de MS, adicionado con las combinaciones hormonales (Tabla 5), bajo un diseño completamente aleatorizado con arreglo factorial y tres repeticiones por tratamiento. Además, se adicionaron vitaminas de Gamborg, 6 g.l -1 de agar y 30 g.l -1 de sacarosa. A cada tubo de 120 X 25 mm se le adicionó una alícuota de 20 ml de medio ajustado a un ph de 5.7 ± 0.1 con una solución de NaOH 0.1N. Tabla 5.- Combinaciones hormonales empleadas en la inducción del proceso de rizogénesis en brotes de los patrones C. troyer y C. carrizo TRATAMIENTO PATRONES ANA (mg.l -1 ) AIB (mg.l -1 ) 1 C. troyer C. troyer C. troyer C. carrizo C. carrizo C. carrizo

37 Los cultivos se mantuvieron a una temperatura de 25 ± 2 C, con 16 horas luz y 8 de oscuridad, bajo una intensidad lumínica de 1,200 lux, con lámparas Osram* Dayliht de 22 W. La evaluación del porcentaje de brotes enraizados y longitud de la raíz, se realizó a los 15 y 30 días. Los datos se procesaron por análisis de varianza (ANOVA) bifactorial 3 X 2 (3 tratamientos hormonales X 2 patrones). Se emplearon gráficas de barra del programa Excel (Versión 97) y se fotografiaron con película Kodak* 35 mm, ASA 200, para presentar los resultados Experimento 5. Aclimatación de patrones de C. troyer y C. carrizo C. sinensis Osbeck X P. trifoliata Raf). Las vitroplántulas provenientes del experimento 4, que mostraron de 2 a 3 hojas expandidas y una longitud del tallo oscilando entre 4-6 cm, fueron extraídas del tubo de ensaye y se lavaron perfectamente con agua corriente. Estas se transfirieron, de acuerdo con lo recomendado por Hurtado y Merino (1994), a bolsas de polietileno de color negro (10 X 20 cm), conteniendo: Tierra negra (testigo) y lombricomposta al 10 y 20 %. Se empleó un diseño completamente aleatorizado con arreglo factorial y tres repeticiones para cada combinación en estudio (combinación de dos patrones y dos concentraciones del sustrato) (Tabla 6). Para efectuar la prueba serológica de ELISA para el diagnóstico de VTC, se enviaron 5 muestras de plantas de ambos patrones al Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa, S.C. (LATEX). 36

38 Tabla 6.- Tratamientos empleados para la aclimatación de dos patrones de cítricos. PATRON TRATAMIENTOS LOMBRICOMPOSTA (%) C. troyer C. carrizo Una vez transplantadas, se colocó a cada bolsa un soporte de madera en forma de cruz, para cubrir adecuadamente cada vitroplántula con una bolsa de polietileno transparente (30 X 40 cm). Al momento del transplante y cada tercer día, por un período de 10 días, se adicionó a cada bolsa, aproximadamente 40 ml de agua corriente. Las bolsas se cerraron con una liga y se colocaron en un área sombreada a 26 ± 2 C con una humedad relativa de 80 a 90 %. A los 11 días de efectuado el transplante, se retiraron las bolsas de polietileno y a partir de ese momento se efectúo un riego semanal, hasta terminar el experimento. A los 30 y 45 días (6 semanas) se evaluaron los siguientes caracteres en todas las plantas: largo del tallo, número de hojas, grosor del tallo y vigor. Este último se determinó en base a la siguiente escala: 1. Plantas poco vigorosas. De color verde pálido en hojas y tallo, de menos de 4 cm de altura. 2. Plantas vigorosas. De color verde intenso en hojas y tallos, de 4 a 6 cm de altura. 37

39 Los datos obtenidos se procesaron estadísticamente efectuando el análisis de varianza (ANOVA), bifactorial 2 X 2 (2 patrones X 2 sustratos). Posteriormente se realizó la prueba de Dunnet (Steel y Torrie, 1988) para comparar las medias de los tratamientos con respecto a un grupo testigo. 38

40 RESULTADOS Y DISCUSION 4.1. Experimento 1. Caracterización morfométrica de semillas de C. troyer y C. carrizo (C. sinensis Osbeck X Poncirus trifoliata Raf.) Los resultados obtenidos de los análisis de varianza (ANOVA), efectuados, no arrojaron diferencias significativas para las variables morfométricas evaluadas en las semillas de los 2 patrones en estudio (Tabla 7). Tabla 7.- Características morfométricas de las semillas de C. troyer y C. carrizo (C. sinensis Osbeck x P. trifoliata Raf.) Patrones Relación Largo Ancho Grosor Peso largo/ancho (mm) (mm) (mm) (g) (mm) C. troyer x ± EE 1.24 ± ± ± ± ± C. carrizo x ± EE 1.23 ± ± ± ± ± ( x ): Media general (EE): Error estándar El análisis de los valores de Coeficientes de Variación (CV) y Factor de Variación (FV) de las variables morfométricas examinadas, permitió constatar (Figura 2) que los caracteres: grosor, relación largo/ancho y peso de la semilla, mostraron los mayores valores, contrastando con los menores valores de estos indicadores mostrados por los caracteres largo y ancho de la semilla. 39

41 Coeficiente de Variación Factor de Variación Largo Ancho Grosor Peso Largo/Ancho Variables Figura 2. Valores de Coeficiente de Variación y Factor de Variación de las variables morfométricas en estudio. En la Figura 3, se puede apreciar la notable similitud en las características de las semillas de los patrones en estudio, que sustenta los resultados estadísticos obtenidos. Figura 3. Semillas de C. troyer y C. carrizo. 40

42 Número de Plantas Estos resultados sustentan la existencia de una estrecha relación genética entre C. troyer y C. carrizo, dada la similitud en cuanto al origen genético de los mismos (Palacios, 1978; Morín et al., 1985). Diversos autores (Gravina, 1989; Kent y Levi, 1990; Chávez y González, 1999), han detectado de igual forma similitudes en las características morfogenéticas de frutos y semillas de ambos patrones Experimento 2. Establecimiento de cultivos asépticos de patrones de C. troyer y C. carrizo (C. sinensis Osbeck X P. trifoliata Raf.) tolerantes a VTC Los resultados obtenidos con C. carrizo, mostraron que de los 8 tratamientos de desinfección y termoterapia aplicados a las semillas, solo cuatro de ellos (1, 2, 3 y 4) resultaron ser los mejores con el 100 % de vitroplántulas no contaminadas (Figura 4), con rangos de contaminación de 1 a 3 tubos. Germinadas No Contaminadas T1 T2 T3 T4 Tratamientos T5 T6 T7 T8 Figura 4. Eficiencia de diferentes tratamientos de desinfección en semilla de C. carrizo sobre el número de plantas no contaminadas y germinadas 41

43 Los tratamientos 2 (Benlate*/20 minutos; Clorox* 25%/10 minutos a C/5 minutos) y 4 (Benlate*/20 minutos; Clorox* 30%/5 minutos a C/5 minutos), aplicados a la semilla de C. carrizo permitieron obtener un mayor porcentaje de germinaron in vitro (Figura 4) en comparación con el menor porcentaje de germinación que se obtuvo en los tratamientos 1 (Benlate*/20 minutos; Clorox* 25%/10 minutos a C/10 minutos) y 3 (Benlate*/20 minutos; Clorox* 30%/5 minutos a C/10 minutos), en los que se observaron también un mayor control de la contaminación. En la Figura 5, se muestran semillas de C. carrizo germinadas in vitro, luego de aplicarse los tratamientos 2 y 4 de desinfección y termoterapia. Figura 5. Germinación de semillas de C. carrizo, empleando los tratamientos 2 y 4. Por otra parte, en C. troyer se detectaron dos tubos contaminados en el tratamiento 6 (Benlate*/25 minutos; Clorox* 25%/10 minutos a C/5 minutos) (Figura 6). En los tratamientos restantes, se pudo lograr un adecuado control de la contaminación, siendo ésta del 100 %. 42

44 Número de Plantas Germinadas No Contaminadas T1 T2 T3 T4 Tratamientos T5 T6 T7 T8 Figura 6. Eficiencia de diferentes tratamientos de desinfección en semilla de C. troyer sobre el número de plantas no contaminadas y germinadas El tratamiento 5 (Benlate*/25 minutos; Clorox* 25%/10 minutos a C/10 minutos), a diferencia de los restantes en los que se logró un adecuado control de la contaminación, fue el que mostró los mayores porcentajes de germinación in vitro de las semillas (Figura 6). En la Figura 7 se pueden apreciar semillas de C. troyer germinadas in vitro, empleando el tratamiento de desinfección número 5. 43

45 Figura 7. Germinación de semillas de C. troyer, empleando el Tratamiento 5 De manera general, los resultados obtenidos mostraron un 100 % de efectividad en los tratamientos de desinfección 2 y 4, en semillas de C. carrizo y el tratamiento 5, en semillas de C. troyer. Es posible que la mayor efectividad obtenida en el control de la contaminación de este trabajo se deba, entre otras, a la mayor concentración de hipoclorito de sodio empleada, en relación con la empleada por otros autores como Normah et al. (1997) y García et al. (1999). Cabe destacar, sin embargo, que los bajos porcentajes de contaminación obtenidos en este trabajo resultaron ser menores a los obtenidos en cítricos por Rodríguez (1986), quien obtuvo el 90 % de tubos sin contaminación. Con respecto al porcentaje de germinación, se apreciaron diferencias en la respuesta a los diferentes tratamientos en ambos patrones (Figuras 4 y 6). En general los valores de germinación detectados en ambos patrones no sobrepasaron al 55%. Es posible que los tratamientos de desinfección y 44

46 termoterapia empleados hayan afectado el proceso germinativo tal como ha sido reportado, entre otros, por Gravina (1989) y Boxus (1998). Resultó interesante constatar, las diferencias mostradas por las semillas de los dos patrones ante los tratamientos de desinfección y termoterapia empleados. De hecho, a diferencia de lo observado en C. carrizo, el tratamiento 5 resultó ser el más adecuado para lograr un mejor control de la desinfección y un porcentaje más elevado de germinación en C. troyer. Otro apecto a destacar de estos resultados es que las pruebas de diagnóstico al VTC empleados en esta fase, resultaron ser negativos (Anexo 3). Estos resultados concuerdan con lo esperado si se tiene en cuenta los indicado por diversos autores (Gravina y Piestun, 1991; Monteverde, 1999), en relación a que los virus y viroides de cítricos se transmiten en bajo porcentaje a través de la semilla. Por otra parte, el uso de tratamientos de temperatura, como el empleado en este trabajo han resultado efectivos para la eliminación de algunos patógenos como la tristeza, psorosis, concavidad gomosa e impietratura (Calavan et al., 1972; Roistacher y Calavan, 1972) Experimento 3. Inducción de brotes a partir de segmentos nodales de C. troyer y C. carrizo (C. sinensis Osbeck X P. trifoliata Raf.) tolerantes al VTC Inducción de brotes a partir de segmentos nodales con BAP, ANA y AG 3 Los resultados obtenidos del análisis bifactorial efectuado en 15 días, mostraron que no existieron diferencias significativas entre los tratamientos, entre los patrones, ni entre la interacción para las variables número de brotes, callo, vigor y longitud del brote (Tabla 8). 45

47 Tabla 8.- Cuadrados medios resultantes del ANOVA bifactorial de los caracteres evaluados a los 15 días para el proceso de inducción de brotes a partir de segmentos nodales con BAP, ANA y AG 3. Fuente de variación Número de brotes Formación de Callo Vigor de los brotes Longitud de los brotes Tratamiento (A) Patrón (B) A X B Error x ± EE ± ± ± ± (*): Nivel de significancia p 0.05 Los resultados obtenidos del análisis bifactorial efectuado a los 30 días, mostraron diferencias significativas entre tratamientos y la interacción entre patrones y tratamientos para la mayoría de las variables examinadas, con excepción de la longitud de los brotes, en donde no se apreciaron diferencias significativas para los mismos (Tabla 9). Tabla 9. Cuadrados medios resultantes del ANOVA bifactorial de los caracteres evaluados a los 30 días para el proceso de inducción de brotes a partir de segmentos nodales con BAP, ANA y AG 3 Fuente de variación Número de brotes Formación de Callo Vigor de los brotes Longitud de los brotes Tratamiento (A) * * * Patrón (B) * A X B * * * Error x ± EE ± ± ± ± (*): Nivel de significancia p

48 Para la variable número de brotes, se constató la existencia de diferencias significativas para los tratamientos, patrones e interacción entre ambos factores (Tabla 9). En la Tabla 10 se puede apreciar la respuesta promedio en el número de brotes en función de la interacción entre los patrones y tratamientos. Tabla 10.- Comparación de medias para la variable número de brotes en la interacción entre patrones y tratamientos Tratamiento Patrón Medias 2 Carrizo a 1 Carrizo a 2 Troyer a 3 Troyer ab 3 Carrizo bc 1 Troyer c (*):Medias con letras diferentes son significativamente distintas según décima de Tukey con p Para la variable longitud del brote, no se detectaron diferencias significativas entre los tratamientos, ni entre los patrones, ni en la interacción entre ambos (Tabla 9). De acuerdo con estos resultados el tratamiento 2 (BAP 2 mg.l -1, ANA 0.0 mg.l -1 y AG 3 2 mg.l -1 ), resultó en general como el más adecuado para lograr una mayor inducción de brotes en ambos patrones (Tabla 10). Se observó una diferencia en la respuesta morfogenética en la inducción de brotes en ambos patrones ya que el tratamiento 1 (BAP 1 mg.l -1, ANA 0.5 mg.l -1 y AG 3 2 mg.l -1 ) fue igualmente satisfactorio que el tratamiento 2 en C. carrizo, no así para C. troyer. 47

49 Para la variable formación de callo, se encontraron diferencias significativas entre tratamientos y la interacción entre ambos (Tabla 9). En la tabla 11 se puede apreciar la respuesta promedio en el número de callos formados en función de la interacción entre los patrones y tratamientos. Tabla 11.- Comparación de medias para la variable formación de callos en la interacción entre patrones y tratamientos. Tratamiento Patrón Medias 2 Troyer a 2 Carrizo a 1 Carrizo ab 3 Troyer ab 1 Troyer ab 3 Carrizo b (*):Medias con letras diferentes son significativamente distintas según décima de Tukey con p De acuerdo con estos resultados el tratamiento 2 fue el que mostró valores ligeramente superiores en cuanto a formación de callo en ambos patrones. Sin embargo el tratamiento 3 (BAP 2 mg.l -1, ANA 0.5 mg.l -1 y AG 3 2 mg.l -1 ) fue el único que difirió significativamente para esta variable en C. carrizo (Tabla 11). Para la variable vigor, se observó la existencia de diferencias significativas entre tratamientos y la interacción entre ambos (Tabla 9). En la Tabla 12 se puede apreciar la respuesta promedio en el vigor en función de la interacción entre los tratamientos y patrones examinados. 48

50 Tabla 12.- Comparación de medias para la variable vigor en la interacción entre patrones y tratamientos Tratamiento Patrón Medias 2 C.carrizo a 1 C. carrizo a 3 C. troyer a 2 C. troyer a 3 C. carrizo b 1 C. troyer b (*):Medias con letras diferentes son significativamente distintas según décima de Tukey con p Se encontró una tendencia similar en la respuesta observada para la variable vigor de los brotes que para la de número de brotes. En este caso el tratamiento 2 fue el que mejor resultado mostró para esta variable en ambos patrones, seguido por el tratamiento 1 en C. carrizo y el tratamiento 3 para C. troyer (Tabla 12). Desde el punto de vista cualitativo se observó que el tratamiento 1 fue el que produjo en el patrón C. carrizo como media 2 brotes por explante, los cuales mostraron una apariencia vigorosa (Figura 8). Sin embargo, en C. troyer no se produjeron brotes con este tratamiento. 49

51 Figura 8. Inducción de brotes a partir de segmentos nodales en C. carrizo, sembrados en el tratamiento 1. De manera similar, se observó que el tratamiento 2 (Figura 9) produjo en promedio 2 brotes por explante en C. carrizo y 1 brote por explante en C. troyer. Cabe mencionar que en este tratamiento se formó un callo mucho más distintivo a partir de los cuales se regeneraron los brotes en ambos patrones. 50

52 Figura 9.- Inducción de brotes a partir de segmentos nodales en C. troyer, sembrados en el tratamiento 2. En el tratamiento 3 (Figura 10) se observó, por otra parte, la formación de pocos brotes por explante en ambos patrones. En este tratamiento, al igual que los anteriores, se detectó la presencia de callo fundamentalmente en C. troyer así como la presencia en la mayoría de los casos de cierta anormalidad en los brotes formados (deformación de los tallos), probablemente asociada con la mayor concentración de BAP aplicada. 51

53 Figura 10.- Inducción de brotes a partir de segmentos nodales en C. troyer en el tratamiento 3. En resumen, de acuerdo con estos resultados el tratamiento 1 fue el mejor para la inducción de brotes en C. carrizo y el tratamiento 2 para C. troyer. Diversos autores han logrado obtener un número de brotes similares a lo obtenido en este estudio empleando segmentos nodales en diversas especies vegetales (Pérez-Molphe y Ochoa-Alejo, 1997; Normah et al., 1997; Hernández y Mejía, 1994; García et al., 1999). La diferente respuesta morfogenética observada en este estudio entre los dos patrones puede deberse a la influencia del genotipo en el proceso de inducción de brotes. 52

54 En C. carrizo Moore et al. (1992), reportó la inducción de brotes por organogénesis directa sin formación de callo, sin embargo en otros genotipos de cítricos se ha reportado que este proceso transcurre por organogénesis indirecta (Raj y Arya, 1978; Durán-Vila et al., 1989). Estudios al respecto efectuados en C. troyer por García et al. (1999) mostraron que la vía morfogenética depende de la exposición del explante y que de los explantes sembrados en posición vertical se originaban brotes del cambium vascular por un proceso de morfogénesis directa, mientras que aquellos explantes, en los que su extremo apical se encontraba en contacto con el medio, se producia un proceso de regeneración indirecta. Es posible que lo anterior pueda también haber influido en la variación de las respuestas morfogenéticas detectadas en este estudio, sin descartar la influencia como indicara Espinoza (1994), de otros factores relacionados con la composición química del medio de cultivo y condiciones de cultivo Efecto de diferentes concentraciones de BAP (2, 4 y 6 mg.l -1 ) en el proceso de inducción de brotes Los resultados obtenidos del análisis bifactorial, efectuados a los 30 días para el efecto de diferentes concentraciones de BAP en el proceso de inducción de brotes en dos patrones de cítricos en estudio, se muestran en la Tabla 13. Se pudo observar que existieron diferencias significativas entre tratamientos para las variables número de brotes (Figura 11), vigor (Figura 12) y longitud de los brotes (Figura 13). 53

55 No. promedio de brotes Tabla 13.- Cuadrados medios resultantes del ANOVA bifactorial de los caracteres evaluados a los 30 días para el proceso de inducción de brotes a partir de segmentos nodales con BAP. Fuente de variación Número de brotes Formación de Callo Vigor de los brotes Longitud de los brotes Tratamiento (A) * * * Patrón (B) A X B Error x ± EE ± ± ± ± (*).- Nivel de significancia p 0.05 Como se aprecia en las figuras 11, 12 y 13, los caracteres; numero promedio de brotes, vigor de los brotes y la longitud promedio de brotes, mostraron los valores más elevados en la concentración de 2 mg.l -1 de BAP. 2.5 a E.E.=0.170* b mg.l-1 4 mg l-1 6 mg l-1 Tratamientos de BAP c Figura 11.- Diferencias entre tratamientos en el número promedio de brotes por explante. 54

56 Longitud promedio de brotes (cm) Vigor promedio de brotes a 2 mg.l-1 4 mg.l-1 6 mg.l-1 b Tratamientos de BAP E.E.=0.127* ***** c Figura 12.- Diferencias entre tratamientos en el vigor de los brotes E.E.= 0.156* a b c 2 mg.l-1 4 mg.l-1 6 mg.l-1 Tratamientos de BAP Figura 13.- Diferencias entre tratamientos en la longitud promedio de brotes. 55

57 En el tratamiento de 2 mg.l -1 de BAP, el número de brotes por explante en C. carrizo fue de 0 a 2 (Figura 14) y para C. troyer fue de 1 a 3 (Figura 15). Figura 14.- Inducción de brotes a partir de segmentos nodales en C. carrizo, empleando 2 mg.l -1 de BAP Figura 15.- Inducción de brotes a partir de segmentos nodales en C. troyer, empleando 2 mg.l -1 de BAP. 56

58 Los resultados obtenidos en este estudio con el empleo de BAP se encuentran en concordancia con lo indicado por varios autores en relación con la inducción de brotes múltiples a partir de diversos explantes de especies vegetales, incluyendo al género Citrus (Durán-Vila et al., 1989;Beloualy, 1991 y Normah et al., 1997). Los valores más bajos detectados en todas las variables examinadas al elevarse la concentración de BAP en el medio, pueden estar dados por la presencia de inestabilidad genetica, que como apuntarán Evans y Sharp (1986) y Christopher y Rajam (1994), acompañan por lo regular al empleo de dosis elevadas de esta citocinina Experimento 4. Efecto de la concentración de auxinas sobre la formación de raíces en C. troyer y C. carrizo (C. sinensis Osbeck X P. trifoliata Raf) Los resultados obtenidos del análisis bifactorial, efectuado a los 15 días, revelaron la no existencia de diferencias significativas en los tratamientos empleados para la inducción del proceso de rizogénesis en ambos patrones; es decir, no existieron diferencias significativas ni entre tratamientos, patrones e interacción (Tabla 14). Tabla 14.- Valores de los cuadrados medios resultantes del ANOVA bifactorial de los caracteres evaluados a los 15 días en el proceso de rizogénesis. Fuente de variación Presencia de Raíz Longitud de Raíz Callo Tratamiento (A) Patrón (B) A X B Error x ± EE ± ± ± (*): Nivel de significancia p

59 Longitud Promedio de la raíz En los resultados obtenidos del análisis bifactorial efectuado a los 30 días (Tabla 15) se pudieron observar diferencias significativas entre los tratamientos para las variables longitud promedio de la raíz (Figura 16) y formación de callo (Figura 17), siendo necesario evaluar a los 30 días. Tabla 15.- Cuadrados medios resultantes del ANOVA bifactorial de los caracteres evaluados a los 30 días en el proceso de rizogénesis. Fuente de variación Presencia de Raíz Longitud de Raíz Callo Tratamiento (A) * * Patrón (B) A X B Error x ± EE ± ± ± (*): Nivel de significancia p a b E.E.= * 2,5 2 1,5 1 b 0,5 b Tratamientos Figura 16. Diferencias entre tratamientos para la longitud promedio de la raíz. 58

60 No. promedio de callos 1,2 1 a E.E.= * ab 0,8 0,6 0,4 b 0, Tratamientos Figura 17.- Diferencias entre tratamientos para la variable formación de callos. El efecto de las auxinas para la inducción del proceso de rizogénesis ha sido puesto de manifiesto por diversos autores trabajando en diferentes especies vegetales (Vargas y González, 1991; Hernández y Mejía, 1994; Ramírez y Ochoa, 1996; Normah et al., 1997). Dentro de éstos, el ANA como el AIB se han destacado como los más empleados en el enraizamiento de plantas leñosas (Pierik 1987). Con el tratamiento 3 (ANA 0.5 mg.l -1, AIB 0.5 mg.l -1 ) se observó la formación de callo, lo cual concuerda con lo obtenido en cítricos por diversos autores (Barlass y Skene, 1982; Moore, 1986; Durán-Vila et al., 1989; Burgarín y Lozoya, 1992). En el presente estudio se constató que los mejores resultados se obtuvieron con el tratamiento 2 conteniendo AIB 1.0 mg.l -1 (Figura 18). Con este 59

61 tratamiento no se presenta la formación de callo y la raíz llega a alcanzar una longitud media de 5 cm en C. troyer y en C. carrizo hasta de 6 cm. Estos resultados son similares a los obtenidos por Moore (1992) y por Pérez-Molphe- Balch y Ochoa-Alejo (1997); sin embargo, difieren de lo obtenido por Kitto y Young (1981) y Normah et al. (1997), quienes encontraron que el ANA inducía mejor enraizamiento que el AIB en C. carrizo. Figura 18. Inducción de rizogénesis en C. troyer, a partir de segmentos nodales en el tratamiento 2. 60

62 4.5. Experimento 5. Efecto de dos sustratos sobre el proceso de aclimatación de los patrones de cítricos C. troyer y C. carrizo (C. sinensis Osbeck X P. trifoliata Raf). Los resultados obtenidos del análisis de varianza bifactorial efectuado a los 30 días (Tabla 16) en que se apreciaron diferencias significativas entre los patrones para la variable grosor del tallo (Figura 19). El resto de las características evaluadas, no mostraron diferencias significativas, ni entre los patrones, ni entre las concentraciones del sustrato, así como tampoco hubo un efecto de interacción entre ambos factores. Tabla 16.- Valores de los cuadrados medios del ANOVA bifactorial de los caracteres evaluados a los 30 días en el proceso de aclimatación Fuente de Variación Largo del tallo Número de Hojas Vigor de los brotes Grosor del tallo Patrón (A) * Sustratos (B) (A x B) Error x ± EE 6.05 ± ± X ± ± 0.01 (*).- Nivel de significancia p

63 Grosor del tallo (cms) E.E.=0.021* 0.25 a b C. troyer C. carrizo PATRON Figura 19.- Diferencias entre patrones para la variable grosor del tallo, con lombricomposta al 20% a los 30 días. Las vitroplántulas obtenidas de C. carrizo, mostraron en promedio un mayor grosor en los tallos (0.17 cm) a diferencia de los obtenidos a partir de C. troyer que mostraron valores promedios para esta variable de 0.11 cm (Figura 20). La variación detectada en este estudio, puede ser explicada si se tienen en cuenta las pequeñas diferencias agronómicas, que de acuerdo con Coto y Rodríguez (1998) y Padrón (2001), presentan ambos patrones. 62

64 Figura 20.- Plántulas de 30 días en fase de aclimatación de C. carrizo y C. troyer. Por otro lado, los resultados del análisis efectuado a los datos de la primera evaluación (30 días) para las variables largo del tallo, número de hojas, vigor, grosor del tallo, comparados con los grupos testigo (prueba de Dunnet) se presentan en la Tabla 17. Tabla 17.- Comparación de Dunnet sobre las respuestas promedio obtenidas a los 30 días, en las combinaciones patrón-concentración, respecto al testigo, en el proceso de aclimatación Patrones Conc. sustrato (%) Largo tallo (cm) Testigo Número de hojas Testigo Vigor Testigo Grosor tallo Testigo C. troyer C. troyer C. carrizo * 0.32* C. carrizo * 1.41* * 0.32* (*).- Nivel de significancia p

65 Para las variables largo del tallo y vigor, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas con respecto a los grupos de testigo para ambos patrones y concentración de sustratos (Tabla 17). Para la variable número de hojas, se encontraron diferencias significativas en la respuesta del experimento con el 20 % para C. carrizo, en relación con el grupo testigo. Para C. troyer no se encontraron diferencias significativas con respecto al grupo testigo (Tabla 17). Para la variable grosor del tallo se encontraron diferencias significativas en las respuestas del experimento con ambas concentraciones para C. carrizo en relación con el grupo testigo. Para C. troyer no se encontraron diferencias significativas con respecto al grupo testigo (Tabla 17). Los resultados obtenidos del análisis de varianza bifactorial efectuado en la segunda evaluación (45 días) (Tabla 18), muestra que para las variables largo del tallo, número de hojas y vigor, no mostraron diferencias significativas entre los patrones, ni entre las concentraciones, así como tampoco hubo un efecto de interacción entre ambos factores. Tabla 18.- Cuadrados medios resultantes del ANOVA bifactorial de los caracteres evaluados a 45 días en el proceso de aclimatación. Fuente de Largo del Grosor del No. de Hojas Vigor Variación tallo tallo Patrón (A) * Sustrato (B) (A x B) Error x ± EE 6.90 ± ± ± ± 0.01 (*).- Significancia p

66 Grosor del tallo (cms) Para la variable grosor del tallo se encontraron diferencias significativas solo entre patrones (Figura 21), pero no así para las concentraciones ni tampoco un efecto de interacción entre ambos factores a E.E.=0.016* b C. troyer C. carrizo PATRON Figura 21.- Diferencias en el promedio del grosor de tallo entre patrones de C. troyer y C. carrizo, con lombricomposta al 20 % a los 45 días. El patrón que mostró un mayor promedio en el grosor de los tallos fue el C. carrizo con 0.30 cm, siendo más bajo para el patrón C. troyer con 0.21 cm. En conclusión, los resultados en las evaluaciones a los 30 y 45 días fueron similares, en los cuales el patrón C. carrizo, resultó tener el mayor promedio para esta misma variable (grosor de tallo) (Figura 22). 65

67 Figura 22.- Plantas de C. carrizo y C. troyer a los 45 días del proceso de aclimatación. Los resultados del análisis estadístico de la segunda evaluación (45 días) para las variables largo del tallo, número de hojas, vigor y grosor del tallo, comparados con los grupos testigo (prueba de Dunnet), utilizando promedios de cada variable analizada, se muestran en la Tabla

68 Tabla 19.- Comparación de Dunnet sobre las respuestas promedio obtenidas en las combinaciones patrón-concentración respecto al testigo a los 45 días, en el proceso de aclimatación Patrón Conc. sustrato (%) Largo tallo (cm) Testigo Número de hojas Testigo Vigor Testigo Grosor tallo Testigo C. troyer C. troyer C. carrizo * 0.20* C. carrizo * 2.00* * 0.20* (*).- Nivel de significancia p 0.05 Se encontraron diferencias significativas para las variables grosor del tallo, en ambas concentraciones del sustrato (10 y 20 %) en C. carrizo y para el número de hojas (al 20 %) en el mismo patrón. Pocos trabajos de investigación contemplan a la aclimatación como fase importante de la propagación in vitro, siendo ésta la culminación de un trabajo arduo, el cual involucra al medio ambiente (irradiancia, temperatura y humedad) bien equilibrados para garantizar la función autótrofa de la planta (Hurtado y Merino,1994). En el presente estudio se obtuvo el 88.8 % de vitroplántulas aclimatadas al suelo, comparables con las obtenidas por Parthasarathy et al. (1999) quienes obtuvieron el 90 al 97 % de establecimiento al suelo; Normah et al. (1997) obtuvieron el 83.3 %, siendo estos porcentajes muy superiores a los obtenidos por Singh et al. (1994) quienes obtuvieron el 60 %. A las vitroplántulas obtenidas en este trabajo no se les proporcionó, durante la fase de aclimatación, medio líquido y sustrato estéril, como lo indican los protocolos clásicos de Murashige et al. (1972), Navarro et al. (1977), Alskief (1978), y Hurtado y Merino (1994). 67

69 Las vitroplántulas se lavaron con agua corriente, aún así el porcentaje de sobreviviencia fue alto; esto demuestra que las plantas adquieren rápidamente la capacidad de ser autótrofas y pueden sobrevivir a transplantes bruscos con un tiempo de aclimatación mínimo de 45 días. Después de la aclimatación de las plantas se llevó a cabo un segundo diagnóstico de VTC con la prueba de ELISA, resultando plantas libres de virus (ANEXO 4) 68

70 CONCLUSIONES En base al estudio realizado sobre el establecimiento de una metodología para la micropropagación de patrones tolerantes al virus de la tristeza de los cítricos (VTC) se pudo arribar a las siguientes conclusiones: 1. Se comprobó que el mejor tratamiento para lograr desinfección y termoterapia adecuadas en las semillas de ambos patrones, consistió en el empleo de Benlate* por 25 minutos, hipoclorito de sodio 25% (v/v) de la concentración comercial 10 minutos a C por 10 minutos. 2. Se comprobó que la combinación hormonal más efectiva para la inducción de brotes en C. carrizo y C. troyer fue la que contenía BAP 2.0 mg.l -1, y AG mg.l El factor de crecimiento AIB en 1.0 mg.l -1, favoreció notablemente el desarrollo armónico de la raíz en las plantas en un período de 30 días. 4. El tratamiento de lombricomposta al 20 % resultó el más adecuado para lograr un elevado porcentaje de aclimatación (88.8 %) en ambos patrones. 5. Se constató que no existieron diferencias significativas para las variables morfométricas evaluadas en las semillas de los 2 patrones en estudio, lo que reafirma la notable similitud genética de las mismas. 6. La metodología propuesta permite la producción de vitroplántulas libres de VTC con una tasa de multiplicación de 0.076, en un período de 105 días. 69

71 RECOMENDACIONES Utilizar la metodología propuesta para la micropropagación (Figura 23) de genotipos valiosos de Citranges: C. troyer y C. carrizo, como variante alternativa de la propagación vegetativa con vistas a: 1.- La multiplicación y regionalización a corto plazo de genotipos promisorios; mantener la colección in vitro de variedades y establecer las bases para los trabajos futuros relacionados con la producción masiva de estos patrones. 2.- Desarrollar estudios futuros encaminados a evaluar la homogeneidad genética del material micropropagado. 3.- Emplear el esquema propuesto como base metodológica para el establecimiento de la misma en otras especies cítricas de interés. 4.- Continuar profundizando en los estudios genético-fisiológicos y de aclimatación para elevar la precisión de pruebas de progenie en estudios de interacción genotipo-ambiente y en la selección temprana de caracteres deseables. 70

72 5.- Continuar evaluando genéticamente las poblaciones obtenidas por esta vía de propagación in vitro, con vistas a obtener información valiosa para su mejor explotación en la práctica productiva. 71

73 Fase I Desinfección y Termoterapia Benlate* 25 minutos Hipoclorito de sodio: 25%/10 min. Temperatura: C/10 min. Incubación (15 días) MS/2 27±1 C/completa osc. Fase IV Aclimatación (30 días) Lombricomposta 20% Temperatura: 26 ± 2 C Humedad relativa: 80-90% Fase III Enraizamiento (30 días) MS+Vit Gamborg+ANA 0.0 mg AIB 1.0 mg. 1-1 Temperatura: 25-2 C± C Fotoperiodo: 16 hrs. luz/8 hrs. de Osc. Iluminación: 1200 Lux Fase II Brotes (30 días) MS+Vit Gamborg+BAP 1.0 mg ANA 0.5 mg AG3 2.0 mg. 1-1 Temperatura: 25 ± 2 C Fotoperiodo: 16 hrs. Luz/8 hrs. osc. Iluminación: 1200 lux Figura 23. Esquema propuesto para la micropropagación de segmentos nodales de patrones tolerantes a VTC. 72

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85 ANEXOS 1. Certificado fitosanitario de la semilla. 2. Medio de Murashige y Skoog (1962) y vitaminas de Gamborg. 3. Primer diagnóstico de VTC, mediante la prueba de ELISA. 4. Segundo diagnóstico de VTC, mediante la prueba de ELISA. 84