BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR. DESARROLLO DE UNA NUEVA VACUNA

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1 PATOLOGÍA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR. DESARROLLO DE UNA NUEVA VACUNA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR. DESARROLLO DE UNA NUEVA VACUNA ALBERTO GINER Pfizer Salud Avícola Introducción La Bronquitis Infecciosa Aviar BI- es una enfermedad de etiología viral que afecta a las aves -pollos y gallinas-. Fue descrita por vez primera en 1931 en EE.UU., en Dakota del Norte. Actualmente se considera que su distribución es mundial. La BI causa, como indica su nombre, enfermedad respiratoria, pero también puede afectar al tracto urogenital, provocando problemas renales y reproductivos. Virus de la bronquitis infecciosa aviar El virus de la bronquitis infecciosa aviar VBIA- es un coronavirus que pertenece al Grupo 3 de los Coronaviridae. Debe su nombre a las proyecciones en su superficie, que le dan un aspecto de corona -ver foto-, llamadas espículas. Es un virus pleomórfico, aunque Virus de la bronquitis infecciosa aviar generalmente es redondeado, envuelto y presenta una cadena simple de ARN. El VBIA tiene 4 proteínas estructurales: una proyección en la superficie, la espícula - S de spike o espícula en inglés y las proteínas de la nucleocápside -N-, de la membrana -M- y de la envoltura -E-, habiéndose identificado las regiones que codifican esas proteínas a nivel del genoma (fig. 1). La glicoproteína S, específicamente la subunidad S1 de la espícula, es la responsable de la antigenicidad del virus y, por lo tanto, de la respuesta protectora del ave, que va dirigida contra ella. La respuesta inmune de las aves tiene como blanco la subunidad S1 y pequeños cambios en su conformación pueden provocar que el virus evada la respuesta del ave. Variabilidad de los virus de bronquitis Como otros virus de tipo ARN de una sola cadena, la polimerasa del VBIA no tiene función de ediciónreparación/corrección de lectura, siendo esta enzima la responsable de copiar el genoma viral durante la replicación. Si durante la misma se produce un error en la copia del genoma, la enzima no es capaz de repararlo, produciéndose un virus con un genoma modificado, hecho que confiere al mismo una alta capacidad de mutación, capacidad que también le permite una adaptación más rápida y cambio, como respuesta a la presión de selección o a la respuesta inmunitaria específica del hospedador. Esta característica se manifiesta especialmente en el gen responsable de la proteína S de la espícula. Artículo patrocinado por SELECCIONES AVÍCOLAS AGOSTO 2011 Pág. 7

2 de campo tipo Massachussets, de origen holandés. Por pruebas de neutralización cruzada en huevos embrionados se demostró que estos brotes fueron causados por virus distintos a los americanos. Se describieron 4 serotipos, D207, D212, D3128 y D3896. Esto llevó al desarrollo de vacunas con alguno de estos virus variantes, por ejemplo, el D274. Década de 1990 También existe la posibilidad de generar nuevos genotipos de virus por medio de la recombinación que se puede producir al coincidir dos o más cepas en una misma célula hospedadora, pudiéndose combinar secciones del genoma de los distintos virus. Continuamente se están produciendo cambios en su genoma, pero se cree que la gran mayoría son letales para su supervivencia, o no le dan ninguna ventaja con respecto a los genotipos ya establecidos ya que, a pesar de todo, las apariciones y más importante aún, la permanencia y establecimiento de nuevos genotipos ocurren con frecuencia relativa. A estas cepas nuevas que surgen cada cierta cantidad de años, las que reciben el nombre de variantes, por la variación que presentan en su antigenicidad, le debemos que la BIA continúe siendo un reto para la industria avícola mundial. HISTORIA DE LOS VIRUS VARIANTES DE BI EN EUROPA Década de 1980 Fig. 1. Proteínas estructurales del VBIA Durante muchos años se consideró que en Europa el único serotipo presente era el Massachussets, virus que, presuntamente, había sido traído al continente con aves infectadas. Sin embargo, en los años 80 se demostró en Holanda la existencia de brotes de bronquitis en aves inmunizadas con vacunas comerciales con las cepas H52 y H120, que estas eran las únicas vacunas disponibles en su tiempo, ambas derivadas de un aislamiento A principios de los años 90, en el Reino Unido se informó de un nuevo virus de BI, al que se llamó 793B, el cual difería en la región hipervariable del gen que codifica la subunidad S1 de la espícula de los serotipos Massachussets y de las variantes holandesas. Esto llevó al desarrollo de vacunas homólogas a este virus -ejemplo, la 4-91, CR88-, también llamadas vacunas variantes de bronquitis. Año 2000 en adelante Genotipo Italy02. En esta década han emergido 2 importantes variantes. La primera llamada Italy02, que originalmente se identificó en el año 2002, aunque estudios retrospectivos han determinado que ha estado presente desde antes del 2002 que indica su nombre. Se desconoce su origen, pero ha estado ampliamente distribuido por Europa. Es genéticamente distinto a las cepas Mass y a otras. Las vacunas de tipo Massachussets por si solas no son protectivas frente a esta variante. La Italy02 alcanzó su mayor difusión en el oeste de Europa en al año 2003, pero desde entonces ha estado en declive. En España desplazó al genotipo 793B como el más predominante, siendo hasta los momentos actuales el único país europeo donde continúa siendo la cepa de campo predominante. Existen diversos trabajos de laboratorio y de campo, donde se demuestra que frente a esta variante, el uso de programas de vacunación donde se combinan cepas vacunales de distinto origen, se consigue una protección adecuada -ejemplo, las H120 + D274 y Mass Esto es lo que llamamos Protectotipos, en donde cepas de distinto serotipo y/o genotipo presentan protección frente a determinadas cepas variantes. El mecanismo de esto se cree está relacionado con el hecho de que aunque los virus variantes presentan ciertos cambios en partes del genoma que codifica la porción de la espícula S1, la gran mayoría del genoma permanece inalterado, permitiendo que se produzca esta protección cruzada. Pág. 8 SELECCIONES AVÍCOLAS AGOSTO 2011

3 Genotipo Qx. El segundo genotipo en emerger en Europa ha sido el llamado Qx -D388 en Holanda-, Este es un virus con casi un 100% de identidad con la secuencia de la espícula S1 del primer virus descrito en China en 1996 con el nombre de Qx, el cual se aisló de broilers con proventriculitis. En Europa se detectó por vez primera entre los años 2003 y 2004, en los Países Bajos, desde donde se difundió lentamente hacia Alemania 2003-, Francia y Bélgica En Italia se detectó por primera vez en el 2005 y en el Reino Unido a finales de En España su primer aislamiento se hizo a finales de año Se ha informado sobre una similitud en la difusión desde el sudeste de Asia hacia Europa de la cepa Qx con la cepa de influenza aviar H5N1, tanto en difusión como en el tiempo, aunque en el caso del virus H5N1 se explica por la difusión a través de aves acuáticas migratorias, pero con la cepa Qx no existen informes de especies silvestres capaces de llevar a tales distancia virus de BI. Informes de Rusia de un primer aislamiento de la cepa Qx en el año 2001, muy cerca de la frontera china y apenas un año después a Km de distancia, hacen pensar en que los movimientos de aves de consumo o subproductos de carne de pollo, por el tren transiberiano o por transporte aéreo hayan sido los responsables de esta difusión en ese país. La cepa Qx se ha asociado, entre otras cosas, a proventriculitis, lesiones respiratorias, lesiones renales severas y a síndrome de falsas ponedoras. Todo esto sugiere que esta cepa tiene tropismo por gran cantidad de tejidos y una alta patogenicidad, aunque el efecto de aislamientos individuales varía grandemente. Evolución del genotipo Qx en Europa Como puede verse en las figuras 2 y 3 en el trabajo de identificación realizado durante los años 2002 al 2007 por la Universidad de Liverpool y la empresa Fort Dodge S.A. con muestras procedentes de países del oeste de Europa, la cepa de mayor crecimiento los últimos años ha sido la Qx. Fig. 2. Genotipos detectados en países del oeste de Europa del 2002 al Fig. 3. Evolución del genotipo Qx en países de Europa del 2001 al En países como Holanda, Francia y Alemania, donde a pesar de contar con experiencias de aplicar programas vacunales mixtos, en los que se combinan diferentes cepas para ampliar el espectro de protección -protectotipos-, incluyendo distintas vacunas variantes de bronquitis, la cepa Qx ha seguido causando grandes problemas en la industria avícola, llevando al desarrollo de una vacuna homóloga, tal como se hizo en décadas pasadas al desarrollarse vacunas con las cepas variantes D274 y 793B. Existen publicados ensayos de laboratorio que hacen referencia a la protección conferida por la combinación de 2 cepas distintas, caso H120- D274 y Mass+4-91, pero experiencias prácticas en países como Holanda, Francia y Alemania parecen no confir- SELECCIONES AVÍCOLAS AGOSTO 2011 Pág. 9

4 Tabla 1. Resultados de identificaciones por PCR Estudio Pfizer Animal Health mar completamente esos estudios de laboratorio. Es de resaltar que ambos estudios se realizaron con virus Qx aislados en Italia, existiendo publicaciones que hacen referencia a que puede haber distintos grados de patogenicidad, al comparar aislamientos de virus Qx de distintos orígenes, lo cual pudiera explicar estas diferencias. DESARROLLO DE UNA VACUNA HOMÓLOGA FRENTE AL NUEVO GENOTIPO QX Debido a la elevada exposición que se ha producido por la cepa Qx en países como Holanda, Francia y Alemania y las dificultades encontradas para su control con las vacunas disponibles actualmente en el mercado, en el año 2009 se decidió iniciar los estudios para el desarrollo de una vacuna homóloga contra la cepa Qx. Origen de la cepa vacunal Se utilizó un aislamiento de campo de la cepa Qx, realizado por la Universidad de Liverpool, de nombre L1148, procedente de broilers con enfermedad respiratoria. El virus provino del fluido alantoideo del séptimo pasaje en huevos embrionados. Estudios de seguridad de la cepa L1148 Se realizaron 2 estudios, uno para evaluar la seguridad de los distintos niveles de atenuación de la cepa sobre el tracto respiratorio y otro sobre los riñones, en aves SPF. Para la realización de los estudios de seguridad siguiendo los lineamientos de la Farmacopea Europea, las aves se vacunaron con 10 veces el título máximo, el cual en este caso fue de EID 50 por dosis, al primer día de vida. Para estos estudios se utilizaron los pases 8, 25, 40, 50, 65 y 80. Durante la duración de los estudios de seguridad, no se observó ningún signo clínico. Tracto respiratorio: Se realizaron test de ciliostasis a los 5, 7 y 10 días post-vacunación, según los requerimientos de la Farmacopea Europea. El test de ciliostasis se realizó extrayendo las tráqueas, enjuagándolas y almacenándolas en solución fisiológica salina a 37ºC. Se cortaron secciones transversales de tráquea de 0,6 mm de grosor. Se determinó la actividad ciliar de tres, cuatro y tres secciones respectivamente de las partes superior, media e inferior de las tráqueas, por observación con microscopio de luz con un aumento de 400x. Se dio un valor de 0 si la sección completa de la tráquea mostraba movimiento, de 1 si entre el 67 y el 100% de los cilios mostraban actividad, de 2 si entre el 33 y el 67% de los cilios mostraban actividad, de 3 si los cilios mostraban movimiento en menos del 33% pero más del 0% y de 4 si no se mostraba ninguna actividad ciliar. Para cada grupo se calculó el promedio de ciliostasis. Como puede observarse en la tabla 2, el pase 8 de la cepa L1148, tuvo la máxima puntuación promedio de ciliostasis (40), a los 5 y 7 días y una puntuación de 38 a los 10 días. En el pase 25 se observó una gran disminución en las puntuaciones promedio, de 18. Sorprendentemente en los pases 40 y 50 se produjo un incremento en las puntuaciones promedio y en el pase 50 la puntuación fue de 31. Con respecto a los pases 65 y 80, se produjo una disminución de las puntuaciones promedio de ciliostasis, que fueron de 21 y 11, respectivamente. Riñones: Según podemos ver en la tabla 3, en el estudio A en los pases 8, 25, 40 y 50, algunos riñones tenían afecciones que se podían ver macroscópicamente, estando inflamados y pálidos, las cuales no se observaron en el estudio B en los pases 65 y 80. Pág. 10 SELECCIONES AVÍCOLAS AGOSTO 2011

5 Tabla 2. Resultados de los test de seguridad con diferentes pases de la cepa de BI L1148 a una dosis de EID 50, para el tracto respiratorio de pollos SPF: puntuación de ciliostasis. A nivel histológico se pudo observar una disminución en la severidad de las lesiones renales a medida que se incrementaba el número de pases, de 8 al 50. En los pases 8 y 25 se pudieron observar lesiones de cierta severidad, siendo las puntuaciones de ++ hasta el día 10 postvacunación. A mayores pases (40 y 50), las lesiones no superaron +. Lesiones de +++ no fueron observadas en ningún grupo. En el estudio B se pudo observar que el pase 65, apenas causó algún efecto a nivel histológico, mientras que el pase 80 no produjo ninguno. Tracto reproductivo: Se realizó un estudio de seguridad del pase 80, utilizando 2 grupos de 50 aves SPF hembras, un grupo vacunado a 1 día de vida y otro a 7 días de vida, siguiendo los estándares de la Farmacopea Europea; en este estudio se utilizó la vacuna con título de EID 50 por dosis, administrada por gota ocular. Durante el mismo se observó diariamente a las aves buscando signos clínicos. Once semanas después de la vacunación se sacrificaron y se observó microscópicamente el oviducto completo, externa e internamente buscando la presencia de sacos císticos, estructuras, deformación o aplasia. Durante las 11 semanas del estudio no se observó ningún signo clínico. En el grupo vacunado al día de vida, se observaron lesiones en 6 de 48 aves -dos aves murieron por causas ajenas al estudio-, Las aves presentaban oviductos císticos y aplasia del segmento superior. Estas cavidades císticas estaban presentes, sobre todo, en la parte media de los oviductos. El grupo de aves vacunadas a los 7 días de vida no presentó ninguna lesión en los oviductos. En el grupo control, todos los oviductos estaban en buen estado. Tabla 3. Resultados de los test de seguridad con diferentes pases de la cepa de BI L1148 a una dosis de EID 50, para riñones de pollos SPF. (*) Las lesiones de riñones se valoraron de la siguiente forma: -, sin lesiones; +, algo de infiltración de linfocitos localmente; ++, fuerte infiltración de linfocitos en todo el riñón. NR, no realizado. b Mas de 5 muestras evaluadas. c una de las 5 muestras se perdió. SELECCIONES AVÍCOLAS AGOSTO 2011 Pág. 11

6 Estudios de Eficacia frente a cepa de campo tipo Qx Los estudios de protección se realizaron utilizando la cepa tipo Qx, con nombre D388, suministrada por el Animal Health Center, de Deventer, Holanda. Aves SPF: No se observaron signos clínicos después de la vacunación. Los resultados de las tráqueas examinadas para lesiones, por medio del test de ciliostasis, se muestran en la tabla 4. Se puede ver que en las aves no vacunadas y expuestas el daño de los cilios fue máximo -mayor puntuación de ciliostasis posible-, mientras que las tráqueas de las aves no vacunadas y no expuestas estaban normales. Tabla 4. Resultados del test de ciliostasis después de la exposición de aves SPF vacunadas al día de vida con diferentes dosis del virus BI L1148 y con diferentes números de pases de atenuación (*) Las aves vacunadas con los pases 82 y 85 mostraban escasamente algún daño en las tráqueas. Los resultados cumplen con los requerimientos de la Farmacopea Europea, la cual prescribe que al menos 80% de las aves vacunadas deben estar protegidas de la ciliostasis. En las aves vacunadas con el pase 101 no se cumple con la Farmacopea Europea. Aves comerciales con anticuerpos maternos contra VBI: En este estudio, realizado con aves comerciales positivas a anticuerpos maternos para bronquitis infecciosa, se evaluaron los títulos por serología -ELISA-, teniendo niveles promedio de log , lo cual se considera normal. Después de la vacunación y de la exposición no se observaron signos clínicos. Los resultados de la tabla 5 muestran que el máximo daño a las tráqueas -la mayor puntuación de ciliostasis posible- después de la exposición ocurrió en el grupo de aves no vacunadas. En el grupo vacunado con IB L1148 a EID 50 con 85 pases, las aves estaban protegidas. La diferencia en el nivel de protección observado en los grupos vacunados comparados con el grupo no vacunado fue estadísticamente significativa. En este grupo se incluyó un grupo de aves SPF debido a que es una recomendación de la Farmacopea Europea en los estudios de eficacia utilizando aves con anticuerpos maternos. El 95% de las aves SPF incluidas en este estudio estaban protegidas contra el daño del epitelio ciliado traqueal por la exposición, lo cual está en línea con los resultados del estudio en aves SPF. Conclusiones (*) Se consideraba protegida a un ave si por lo menos 9 de 10 anillos traqueales por ave mostraban actividad ciliar normal. NA, no aplicable. Tabla 5. Resultados del test de ciliostasis después del desafío de aves con anticuerpos maternos vacunadas al día de vida con el virus BI L1148 en el pase 85 (*) (*) Se consideraba protegida a un ave si por lo menos 9 de 10 anillos traqueales por ave mostraban actividad ciliar normal. NA, no aplicable. Muchas vacunas avícolas están basadas en cepas vacunales vivas atenuadas. Ejemplos de cepas atenuadas vivas de BI son D274, H52, H120, 4-91, MM, Ma5 y CR88. El procedimiento clásico para la atenuación de los virus de BI es por pases en huevos embrionados. En este estudio, se requirieron 80 pases para obtener una cepa viral que fuera lo suficientemente atenuada para cumplir con los requerimientos de seguridad para las vacunas vivas de BI. Esto está en línea con el número de pases requeridos para atenuar otras cepas de BI. No existe umbral definido para distinguir cepas de BI seguras de no seguras, pero en la Farmacopea Europea, un valor promedio de 25 ha sido indicado como tal durante muchos años, aunque actualmente el requerimiento es que se debe realizar un análisis de riesgo-beneficio tomando en cuenta la puntuación promedio de ciliostasis y los beneficios esperados con la vacuna. Pág. 12 SELECCIONES AVÍCOLAS AGOSTO 2011