VISIÓN MODERNA DE LA HEMOSTASIA: NUEVO MODELO DE COAGULACIÓN

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1 VISIÓN MODERNA DE LA HEMOSTASIA: NUEVO MODELO DE COAGULACIÓN CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A DISTANCIA TALLER DEL LABORATORIO CLÍNICO Nº 2

2 I.S.S.N Título: Taller del Laboratorio Clínico Editor: Asociación Española de Biopatología Médica Maquetación: AEBM Fecha de Distribución: diciembre de 2011

3 Visión moderna de la hemostasia: nuevo modelo de coagulación Eva Menéndez Alonso.- Residente de Bioquímica Clínica, Shaila Rubio Arias.- Residente de Análisis Clínicos, Mª Teresa Sánchez Calvin.- FEA de Análisis Clínicos. Hospital Universitario 12 de Octubre. Madrid. 1. INTRODUCCIÓN La hemostasia permite que la sangre circule libremente por los vasos sanguíneos y cuando existe una lesión, inicia una serie de mecanismos fisiológicos que conducen a la formación del trombo hemostático, a reparar el daño y finalmente disolver el coágulo representando el cese fisiológico de la hemorragia. El sistema de coagulación junto a los mecanismos de retroalimentación asegura la eficacia hemostática, mientras que el sistema fibrinolítico actúa como regulador del sistema de la coagulación, eliminando la fibrina no necesaria para la hemostasia. La hemostasia siempre depende del equilibrio entre ambos sistemas, este equilibrio es perfecto en las personas sanas. Si hay un déficit de los factores de coagulación o si el potencial fibrinolítico sobrepasa el de coagulación, se producirá una hemorragia. Al contrario, si el potencial de coagulación sobrepasa al fibrinolítico o se produce una disminución de los factores de inhibición de la coagulación se producirá una trombosis. Las superficies celulares, plaquetas, células endoteliales, fibroblastos y monocitos principalmente, juegan un papel muy importante dentro de la coagulación sanguínea. Desempeñan dos acciones básicas en la hemostasia. Por una parte proporcionan los factores esenciales que normalmente no están presentes en el plasma y por otra 584

4 proveen una superficie para el ensamblaje de los complejos enzima-cofactor y su interacción con los sustratos para formar el coágulo de fibrina. El sistema de la hemostasia se divide en dos mecanismos de respuesta principales: la hemostasia primaria, donde se lleva a cabo fundamentalmente la interacción entre el endotelio y la plaqueta; y la hemostasia secundaria o coagulación donde participan los factores de coagulación que interaccionan sobre una superficie catalítica para formar una red de fibrina y posteriormente formar el coágulo sanguíneo (1). 2. HEMOSTASIA PRIMARIA Tiene lugar a los pocos segundos de producirse una lesión vascular. La interacción de las plaquetas y la pared vascular juegan un papel esencial para detener la salida de la sangre en capilares, arteriolas pequeñas y vénulas. Las plaquetas son participantes esenciales en el proceso de la hemostasia primaria. Son pequeñas células discoides anucleadas, procedentes de la fragmentación del megacariocito. A pesar de carecer de núcleo, estas células contienen muchos componentes estructurales, metabólicos y de señalización propios de las células nucleadas. Incluso debido a su participación en diversos procesos fisiológicos y su accesibilidad, han servido como modelo de estudio en biología molecular. Las plaquetas, que normalmente circulan en forma inactiva, se adhieren a la pared del vaso dañado, segregando el contenido de sus gránulos e interaccionando con otras plaquetas, formando la base del tapón hemostático. Por otro lado, las plaquetas participan en la activación del sistema de la coagulación proporcionando la superficie sobre la cual se van a ensamblar los complejos que intervienen en esta fase (2). 585

5 La formación del tapón hemostático se produce por una serie de mecanismos: Adhesión de la plaqueta al subendotelio vascular dañado (interviene el factor Von Willebrand) Agregación plaquetaria primaria al activarse el receptor glucoproteico IIb/IIIa y permitir así la unión de las plaquetas Liberación de compuestos intraplaquetarios que provocan agregación secundaria de nuevas plaquetas al tapón hemostático Consolidación y retracción del coágulo Formación del tapón hemostático definitivo con la formación del polímero de fibrina Detención de la hemorragia (1) 3. COAGULACIÓN O HEMOSTASIA SECUNDARIA En esta fase se produce la interacción entre sí de las proteínas plasmáticas o factores de coagulación que se activan en una serie compleja de reacciones que culminarán con la formación del coágulo de fibrina. La fibrina formará una malla definitiva que reforzará al tapón hemostático inicial, formándose un coágulo o trombo definitivo. Intervienen en el proceso varias proteínas procoagulantes (factores de coagulación) y proteínas anticoagulantes (las más importantes son antitrombina III, proteína C y proteína S) que regulan y controlan el proceso de coagulación evitando una coagulación generalizada. Aunque la descripción del mecanismo de la coagulación se divide en diferentes fases, todas ellas guardan relación entre si. Las plaquetas activadas van a acelerar el proceso de la coagulación y a su vez los productos de la coagulación van a inducir la activación de las plaquetas. 586

6 3.1 FACTORES DE COAGULACIÓN Los factores plasmáticos de la coagulación son proteínas procoagulantes (su nomenclatura es internacional). Se denominan utilizando números romanos, asignados en el orden en el que fueron descubiertos (no existe factor VI). A algunos factores plasmáticos no se les ha asignado un número romano, como son la precalicreína, calicreína, y el quininógeno de alto peso molecular (CAPM). Los fosfolípidos plaquetarios no están incluidos en esta clasificación. Todas las proteínas y componentes celulares involucrados en el proceso de coagulación circulan en plasma de forma inactiva en condiciones fisiológicas normales. Durante el proceso de la coagulación serán activados y entonces se representan con el sufijo a después del número romano. Se pueden englobar en dos grandes grupos: Factores dependientes de vitamina K La síntesis de los factores de la coagulación se realiza, principalmente, en el hígado y en el endotelio vascular. Requieren vitamina K para su correcta funcionalidad, aquí se incluyen los factores II, VII, IX y X, así como las dos principales proteínas reguladoras de la coagulación proteína C y proteína S. Todos ellos contienen de 10 a 12 residuos de glutamina, que son carboxilados a ácido carboxiglutámico por una carboxilasa que precisa como cofactor a la vitamina K. Este paso es importante para la unión del ión calcio y necesarios para la interacción de estas proteínas con las membranas plaquetarias (fosfolípidos plaquetarios). Los factores no carboxilados se conocen como P.I.V.K.A. (Protein Induced by Vitamin K Absence) que no son funcionales y poseen actividad anticoagulantes por un mecanismo competitivo sobre los factores carboxilados. 587

7 Cofactores Se dividen en dos grupos: Procofactores plasmáticos: incluyen a los factores V, VIII y quininógeno. El FV circula en plasma como una proteína monomérica y el FVIII circula junto con el factor de von Willebrand (FvW) que al activarse, se disociarán por proteólisis. Procofactores celulares: incluyen al factor tisular (FT) y la trombomodulina (TM). El FT es el único factor que no se encuentra normalmente en la circulación sanguínea, es una proteína específica presente sobre la membrana plasmática de células como monocitos o células endoteliales. El FT se activa únicamente al entrar en contacto con el FVII, momento en el que se inicia la coagulación plasmática. La TM se expresa sobre las células del endotelio vascular, participa como anticoagulante activando a la proteína C (1) 4. FIBRINOLISIS El sistema fibrinolítico consiste en la conversión de una proenzima, el plasminógeno, en su forma activa, la plasmina, la cual es capaz de degradar la fibrina y, así, eliminar el coágulo previamente formado. La transformación del plasminógeno en plasmina se produce mediante la acción proteolítica de dos enzimas: activador tisular del plasminógeno (tpa) y activador del plasminógeno tipo urocinasa (upa). La plasmina degrada la fibrina del coágulo y la transforma en productos de degradación del fibrinógeno (PDF) que contienen residuos de lisina y arginina en posición carboxiterminal. Estos residuos constituyen los sitios de unión para el tpa y el plasminógeno, y son por tanto responsables de amplificar enormemente la cascada de la fibrinolisis. A esta tendencia profibrinolítica se opone una actividad 588

8 antifibrinolítica, de tal modo que sólo un adecuado equilibrio entre ambas fuerzas dará lugar a un correcto funcionamiento del sistema fibrinolítico. La inhibición de la fibrinolisis se produce a diferentes niveles. Por una parte, están los inhibidores de los activadores del plasminógeno: el principal inhibidor de la fibrinolisis in vivo es el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 o PAI-1, que se sintetiza en el endotelio vascular y también en el hígado. Otros inhibidores son el PAI-2, fundamentalmente de origen placentario y el PAI-3, con una menor actividad antifibrinolítica. Se ha descrito también otro mecanismo que regula negativamente la activación del plasminógeno, se trata de la vía del inhibidor de la fibrinolisis activable por trombina (TAFI). Los residuos de los aminoácidos básicos exhibidos en la superficie de la fibrina parcialmente degradada sirven de anclaje al plasminógeno y al tpa. Cuando el plasminógeno y el tpa coinciden en la superficie del coágulo de fibrina, se produce la conversión del plasminógeno a plasmina. A este nivel el TAFI, una vez activado por la trombina (TAFIa), es capaz de eliminar los residuos de lisina y arginina de la superficie de la fibrina, impidiendo la formación de plasmina y, por lo tanto, limitando la cascada de la fibrinolisis. A otro nivel se puede regular la actividad proteolítica de la plasmina por la acción de la α2-antiplasmina, su principal inhibidor fisiológico, y, en menor medida, por la α2-macroglobulina y el TAFIa. Éstos son, básicamente, los factores implicados en la fibrinolisis, de tal modo que una correcta hemostasia depende del balance de fuerzas entre todas estas tendencias opuestas. Hay que resaltar que se trata de un equilibrio dinámico y adaptable a diferentes situaciones tanto fisiológicas como patológicas. (3) 589

9 5. MODELOS DE COAGULACIÓN Distintos modelos de la coagulación in vivo se han descrito desde finales del siglo XIX. Las primeras descripciones estuvieron relacionadas con individuos que desarrollaban trombosis, se demostró que la formación del coágulo de fibrina se genera a partir de su precursor el fibrinógeno mediante una conversión enzimática mediada por la enzima trombina que a su vez provenía de la protrombina. En los siguientes años se realizaron múltiples investigaciones hasta conocer el factor responsable del inicio del proceso de coagulación. En el año 1904 Morawitz describió por primera vez un esquema de la coagulación sanguínea. Afirmó que los tejidos vasculares liberaban una tromboplastina tisular tras la lesión vascular, necesaria para el inicio del proceso de coagulación y propuso cuatro componentes esenciales para la coagulación: protrombina, fibrinógeno, calcio y tromboplastina. Descubrió también la presencia de antitrombinas en la circulación que modulan la trombocinasa, mejor conocida como factor tisular (FT). En el trascurso de los años se fueron descubriendo los factores de la coagulación. Ya en los años 60 dos grupos de investigación por separado, propusieron un modelo de coagulación que incorporaba una complejas reacciones, donde la activación secuencial de los factores de coagulación, daban como resultado la generación de una enzima llamada trombina. En este modelo las vías de coagulación se dividieron en dos sistemas: sistema extrínseco y sistema intrínseco. Le dieron una mayor importancia a la vía intrínseca como iniciadora de la coagulación a través del factor XII. Ambas vías convergían en una vía común y eran capaces de activar al factor X, el cual uniéndose con el cofactor V activado, generaban la trombina. Este modelo denominado Cascada de Coagulación, es razonablemente bueno y de gran utilidad en el laboratorio, para explicar la activación in vitro de la 590

10 coagulación a través del tiempo de protrombina (TP) y tiempo de que corresponden a las vías extrínsecas e intrínsecas respectivamente. tromboplastina parcial activado (TTPa) Figura 1. Cascada de la coagulación Sin embargo en base a los descubrimientos de los últimos años este modelo es inadecuado para explicar las vías fisiológicas de la hemostasis in vivo al no considerar la interacción del sistema con las células que participan en la coagulación. Es evidente que la hemostasia no es posible sin la participación de las plaquetas, y por otra parte el FT es una proteína que está presente en la membrana de diversas células esenciales en la coagulación. Además diferentes células expresan proteínas procoagulantes, anticoagulantes y receptores para diversos componentes de la hemostasia, lo que ha supuesto un paradigma para explicar las reacciones que tienen lugar durante el proceso hemostático. (4) El modelo clásico de la cascada de la coagulación es por tanto inconsistente con el comportamiento clínico de la disfunción de la hemostasia. Se comprobó que ambas vías no operan de forma independiente y que los déficit de factores de la vía intrínseca que prolongan el TTPA no conllevan el mismo riesgo hemorrágico: 591

11 deficiencias de factor XII no cursan con hemorragia y las de XI puede cursar con hemorragia leve, mientras que las deficiencias de factores VIII y IX (hemofilia A y B respectivamente) conllevan hemorragias graves. Otra observación clave fue el hecho de que el complejo FT/VII no sólo activa el factor X, sino también el factor IX (4). Varios grupos han explicado procesos fundamentales que rompen la estructura del modelo clásico de la coagulación: - La interacción FT/VIIa activa no solamente al factor X sino también al IX, llegándose a la conclusión de que la vía extrínseca sería la de mayor relevancia fisiopatológica in vivo. - El evento disparador de la hemostasia in vivo es la formación del complejo FT/FVIIa. - La trombina activa directamente al factor XI en una superficie cargada. De todo ello se ha concluido que es poco probable que el modelo tradicional funcione en condiciones fisiológicas, por lo que Hoffman y otros investigadores han propuesto una alternativa denominada Modelo Celular de la Coagulación (5). 6. MODELO CELULAR DE LA COAGULACIÓN El modelo celular de la coagulación se explica en 3 diferentes etapas INICIACIÓN El FT es el principal iniciador de la coagulación in vivo que actúa como receptor para el factor VII. Se expresa en numerosos tipos de células y está presente en monocitos circulantes y células endoteliales en respuesta a procesos inflamatorios. Las células están localizadas fuera del endotelio, lo que previene la iniciación de la coagulación cuando el flujo es normal y el endotelio está intacto. Es necesario que se produzca una lesión que rompa la barrera que separa al FT y al factor VII. 592

12 Cuando se produce una lesión en la pared vascular, las células subendoteliales que contienen FT entran en contacto con el plasma y se inicia el proceso de generación de trombina al unirse al factor VII creando el complejo FT/VIIa. Éste complejo a su vez activa más VII, y también actúa sobre el factor IX y X. El factor Xa se combina en la superficie celular con el Va para producir pequeñas cantidades de trombina, que jugarán un papel importante en la activación de las plaquetas y del factor VIII en la siguiente fase (4) AMPLIFICACIÓN En esta fase la célula fundamental es la plaqueta. Éstas se adhieren a la matriz subendotelial, siendo activadas en lugares donde se ha expuesto el FT. Las pequeñas cantidades de trombina generadas en la fase anterior junto con el calcio sanguíneo y los fosfolípidos plaquetarios, amplifican la señal procoagulante inicial activando a los factores V, VIII y XI que se ensamblan en la superficie plaquetar para promover posteriores reacciones en la siguiente fase. Esta fase se acaba cuando el factor Va y el VIIIa se unen a la membrana celular de una plaqueta activada para poder formar dos complejos que iniciarán la fase siguiente (6) PROPAGACIÓN Los complejos iniciadores de la propagación son la tenasa (VIIIa/IXa, Ca 2+ y fosfolípidos) y el complejo protrombinasa (Va/Xa, Ca 2+ y fosfolípidos). El complejo tenasa cataliza la conversión del factor Xa, mientras que el complejo protrombinasa cataliza, a nivel de la superficie plaquetar, la conversión de protrombina en grandes cantidades de trombina, lo que se conoce como explosión de trombina necesaria para la formación de un coágulo estable de fibrina. 593

13 La trombina generada, activará al factor XIII o factor estabilizador de fibrina y a un inhibidor fibrinolítico (TAFI) necesarios para la formación de un coágulo de fibrina resistente a la lisis (4). La trombina es la enzima principal de la coagulación, la velocidad y el pico máximo de producción de trombina son factores muy importantes para que todas sus funciones se lleven a cabo. Las principales funciones de la trombina son: activación de las plaquetas, del cofactor V y VIII, del factor XI y XIII, activación de la vía del inhibidor de la fibrinolisis por trombina (TAFI), es la enzima responsable de la transformación del fibrinógeno a fibrina, interviene en la unión al receptor PAR-4 en la superficie de las plaquetas y participa en los procesos de inflamación y cicatrización de heridas (7). Figura 2. Nuevo Modelo celular de la hemostasia (3) En resumen, según el modelo celular de la hemostasia, la coagulación fisiológica depende del contacto del FT subendotelial en el lugar de la lesión con el factor VIIa y del ensamblaje de las reacciones de coagulación a nivel de superficie celular plaquetar, lo que favorece la formación de trombina a nivel local y la generación de 594

14 un coágulo estable de fibrina. Este modelo contempla una vía única y la focalización del proceso en las superficies celulares (4). 7. CONTROL DE LA COAGULACIÓN Existen varios mecanismos que regulan la coagulación para prevenir un exceso de formación de trombina y la posible oclusión del flujo sanguíneo. Existe una expresión de antitrombina III y del inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) que inhiben al factor Xa que no está unido a las células que liberan TF o las plaquetas activadas. Por otra parte la trombina se autorregula al unirse a la trombomodulina y así activar a la proteína C que va a impedir la generación de nuevas moléculas de trombina al escindir irreversiblemente el factor Va y el VIIIa. Esta proteína requiere de un cofactor la proteína S que va a actuar aumentando su afinidad por la membrana celular unas 10 veces. La proteína C inhibirá al factor Va en un endotelio no dañado, pero no lo bloqueará si se encuentra sobre una plaqueta activada. El complejo proteína C-proteína S también inactiva a un importante inhibidor de la fibrinolisis, el inhibidor del activador del plasminógeno. La fibrinolisis es esencial para disolver el coágulo formado por los mecanismos hemostáticos (6). 8. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO (8) 8.1. CONDICIONES PREANALÍTICAS Para la determinación del estudio hemostático lo primero que necesitamos es una correcta obtención de la muestra. Son necesarios tubos con citrato sódico como anticoagulante. Estos tubos contienen una concentración de citrato sódico de 130 mm, que con la sangre se quedará en una concentración final de 13mM, para ello se deben extraer 9 partes de sangre y una de citrato sódico. Para la hematológica básica se debe utilizar un tubo con ácido etilen diamino tetracético (EDTA) como 595

15 anticoagulante EXPLORACIÓN DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA Tiempo de sangría: es el periodo de tiempo desde que se realiza una pequeña incisión en la piel y el momento en que finaliza el sangrado. Es la única prueba que permite medir in vivo la reacción plaqueta-endotelio y demuestra la capacidad hemostática de las plaquetas. Se usa la técnica de Ivy que consiste en practicar una incisión en la cara anterior de antebrazo mediante una hoja especial de 1 cm de longitud y 1 mm de profundidad. El tiempo de hemorragia normal es entre 3 minutos y 30 segundos, y 8 minutos y 30 segundos. Las causas de prolongación del tiempo de sangría son las alteraciones en la pared vascular, trombocitopenias, defectos en la agregación o adhesión plaquetar. Función plaquetaria: para su evaluación estudiaremos el PFA-100, agregometría y el estudio de las glucoproteínas de membrana. Para evaluar el PFA-100 (9) se utiliza sangre total citratada. No es tan específica como el Ivy pero es más rápida y menos dolorosa para el paciente además de evitar los posibles errores producidos por problemas cutáneos del paciente. Se realiza una simulación in vitro del tiempo de hemorragia. Reproduce un flujo constante de sangre que atraviesa una membrana porosa de colágeno y epinefrina o colágeno y ADP. El paso por la membrana produce la activación de las plaquetas y su agregación. El aparato registra el tiempo de obturación del flujo. El tiempo de obturación está aumentado en pacientes con trombocitopenia, enfermedad de Von Willebrand y en pacientes que toman medicación que altera la función plaquetar. 596

16 Otro estudio es la agregometría que se realiza cuando el tiempo de oclusión en PFA-100 esta alterado. Utiliza el método turbidimétrico de Born, que consiste en medir la trasmitancia del plasma del paciente cuando se produce la agregación plaquetar. Obtenemos el porcentaje de agregación plaquetaria frente a un panel de agentes agregantes: ADP, colágeno, ristocetina, adrenalina, ácido araquidónico, trombina, endoperóxidos cíclicos y un ionóforo de calcio. La respuesta de las plaquetas a los diferentes agentes agregantes se divide en cuatro fases sucesivas: el cambio de forma, la agregación, la movilización y la liberación del contenido de los gránulos. Por ello, podemos estudiar donde se produce el fallo en el funcionamiento plaquetario. El último estudio para la determinación de la función plaquetar es la determinación de las glucoproteínas de membrana que se puede estudiar por dos técnicas diferentes: 1- Técnica electroforética en gel de policrilamida donde se detecta y caracteriza la glucoproteína. Esta técnica no permite detectar las propiedades antigénicas de las proteínas ni su interacción con otras proteínas. 2- Técnica inmunológica: citometría de flujo, permite medir diferentes subgrupos dentro de la población plaquetaria estudiada, es capaz de detectar cambios conformacionales en las glucoproteínas (ejemplo: complejo IIb-IIIa) y diferenciar las plaquetas activadas de las que están en reposo. Exploración de la cinética plaquetaria: se realiza un marcaje a las plaquetas con un radionúclido y se mide la radioactividad ligada a las plaquetas circulantes. Nos permite cuantificar la supervivencia plaquetar, la tasa de renovación plaquetaria y los lugares de destrucción periférica en el paciente (habitualmente el bazo). 597

17 Exploración de la adhesividad: se realiza la técnica de Baumgartner que estudia la interacción entre las plaquetas y el subendotelio en condiciones de flujo definidas. Reproduce la circulación sanguínea y permite emular los parámetros reológicos de flujo y coeficiente de cizallamiento. Nos permite observar trastornos hemorrágicos congénitos (por defectos en la unión del Factor von Willebrand al subendotelio y al GPIb). Nuevos métodos de estudio de la función celular global de las plaquetas: transcriptómica y proteómica(10). Se sabe que las plaquetas poseen varios mrna. Existen principalmente dos técnicas transcriptómicas para el estudio de los transcriptos, que son los microarrays y la SAGE (análisis seriado de expresión génica) (11). Las técnicas proteómicas nos proporcionaran conocimientos del contenido proteico plaquetar y de su importancia en las alteraciones de la función plaquetar o su respuesta a fármacos antitrombóticos PRUEBAS DE ESTUDIO DE DIÁTESIS HEMORRÁGICA Tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa): el plasma citratado en presencia de tromboplastina parcial o cefalina y cloruro cálcico se coagula a una velocidad dependiente de la concentración de todos los factores (excepto VII y XIII). Se inicia la reacción añadiendo al plasma una sustancia cargada negativamente (sílice, caolín o ácido elágico). Esta prueba presenta un error sistemático cuando no se cumple la proporción 9:1 de sangre: citrato y nos da un valor de TTPa alargado. La relación (TTPa / TTPa control) > 1,5 se correlaciona con déficit de factores y el riesgo de hemorragia. Podemos detectar hemofilias tipo A y B e inhibidores de la coagulación (anticoagulante lúpico). Se usa para el control del tratamiento con heparina. 598

18 Tiempo de protrombina o de Quick (TP): el plasma citratado en presencia de tromboplastina y cloruro cálcico se coagula a una velocidad dependiente de la actividad de protrombina, de los factores V, VII, X y el fibrinógeno. Evalúa la vía extrínseca. Se usa para el control del tratamiento crónico con cumarínicos. Detecta anomalías de factores y se correlaciona el riesgo de hemorragia junto con TTPa. Los resultados se expresan en la unidad: índice normalizado internacional (INR) es la razón del tiempo de coagulación del paciente respecto al control elevado a un valor llamado ISI (índice de sensibilidad internacional) que es propio de cada tromboplastina. Tiempo de trombina (TT): tiempo que tarda en coagular un plasma citratado al añadir una baja concentración de trombina. Valora la capacidad de polimerizar del fibrinógeno. Se prolonga en niveles muy bajos de fibrinógeno o niveles altos de productos de degradación del fibrinógeno o de la fibrina. Tiempo de reptilasa: tiempo que tarda en coagular un plasma citratado al que se añade reptilasa (reptilasa es una enzima proteolítica extraída del veneno de la serpiente Bothrops atrox que actúa como el fibrinógeno). Se alarga en hepatopatías, disfibrinogenemias e hipofibrinogenemia. Es insensible a la heparina (se usa esta técnica cuando queremos comprobar si un plasma contiene heparina). Concentración de fibrinógeno: se usa el método Von Clauss (12) que utiliza plasma citratado diluido en el que se añade un exceso de trombina. Mide el tiempo de transformación del fibrinógeno a fibrina. Siendo la concentración de fibrinógeno proporcional al tiempo medido por el analizador, extrapolándose el resultado del paciente a la correspondiente curva de calibración realizada en el ensayo. 599

19 Dosificación de la actividad de los factores: Factores II, V, VII y X: Dependiendo de qué factor quieras medir se usa plasma citratado con exceso de los otros factores y se inicia la coagulación con tromboplastina y calcio. El tiempo de coagulación es proporcional a la concentración del factor. Factores VIII, IX, XI y XII: igual que el anterior pero se inicia la coagulación con cefalina y calcio. Factor XIII: se debe activar el factor XIII con trombina y valorar la actividad trasglutaminasa sobre un sustrato o con un sustrato cromogénico. Factor von Willebrand (FvW): puede realizarse por medio de una determinación por aglutinación donde se añade ristocetina para inducir o mimetizar el cambio que se produce en el factor von Willebrand cuando se ha unido al colágeno. Se induce la agregación plaquetaria. Se determina por técnicas de ELISA, electroinmunoensayo. Determinación de dímero D: el dímero D es un producto de degradación de la fibrina. Su exceso nos indica estados de hiperactivación de la coagulación como coagulación intravascular diseminada (CID). También nos orienta a posible tromboembolismo e hiperfibrinolisis. Se detecta por métodos cuantitativos (ELISA o técnicas turbidimétricas) o semicuantitativos (aglutinación por partículas de látex o inmunofiltración). α 2 -antiplasmina: es el principal inhibidor de la plasmina (13). Es una glucoproteína. Se incuba el plasma citratado con exceso de plasmina. Luego se añade un sustrato cromogénico que mide la cantidad de plasmina residual, está será inversamente proporcional a la capacidad antiplasmínica del plasma, debida prácticamente en su totalidad a la α 2 -antiplasmina. 600

20 8.4. DETECCIÓN DE INHIBIDORES El alargamiento de las pruebas básicas de coagulación o la detección de niveles bajos de un factor no siempre son debidas a un déficit o defecto, sino que puede ser consecuencia de la presencia de un inhibidor. Detección de anticoagulante lúpico (AL): son autoanticuerpos dirigidos contra complejos proteína-fosfolípidos que impiden la correcta unión de los factores de coagulación a las superficies fosfolipídicas. Se asocian a una tendencia trombótica. Resultados: se produce alargamiento de la TTPa, o el tiempo de protrombina. Para diagnosticar un paciente con AL deben cumplirse los siguientes criterios: prolongación de al menos una prueba de coagulación que necesite fosfolípidos, confirmación de que la alteración se debe a un inhibidor y no a un defecto de factores, evidencia de que la actividad inhibitoria depende de los fosfolípidos y evidencia de que el inhibidor no va dirigido contra factores de coagulación. Se determina por dos test: Test de Exner, mide el tiempo de coagulación de un plasma mezclado en diferentes proporciones con un plasma control, con caolín y cloruro cálcico. Es sensible a heparina y a los inhibidores específicos contra factores de coagulación. Al ser positivo descartaremos los inhibidores específicos contra factores de coagulación, y el Test de Russell, se coagula un plasma con veneno de la serpiente de Russell, que activa el factor X en presencia de pequeñas cantidades de fosfolípidos. También es sensible a la heparina. Detección de anticuerpos antifosfolípidos: son anticuerpos contra los fosfolípidos (14). Los pacientes presentan episodios trombóticos, abortos recurrentes o trombocitopenia. Se determinan con técnicas ELISA utilizando como antígeno la cardiolipina o la fosfatidilserina. 601

21 Detección de inhibidores contra los factores de la coagulación: se detectan inhibidores contra los factores de la vía intrínseca, los más frecuentes son anticuerpos IgG anti-fcviii. Se utiliza el test descrito por Ewing y Kasper, en el que se valora el TTPa de una mezcla del plasma normal y del paciente, incubados juntos durante dos horas a temperatura ambiente de 37ºC. En presencia de un inhibidor, el TTPa posterior a la incubación es prolongado en comparación con los controles sin inhibidor PRUEBAS PARA VALORAR LA TENDENCIA TROMBÓTICA Cuando a un paciente se le relaciona con una patología trombótica se debe hacer un estudio básico de trombofilia, es decir, antitrombina, proteína C, proteína S, resistencia a la proteína C activada, anticoagulante lúpico, factor VIII, homocisteína, anticuerpos antifosfolípidos, la mutación factor V Leiden y la mutación G20210A del gen de la protrombina. Antitrombina: principal inhibidor fisiológico de las serínproteasas. Su cuantificación funcionalmente se basa en la inhibición de la antitrombina por trombina o factor Xa. Se incuba el plasma citratado problema con un exceso de trombina o de factor Xa en presencia de heparina que acelera la inhibición. A continuación se añade un sustrato cromogénico, con el que se valora la enzima residual, que es inversamente proporcional a la cantidad de antitrombina presente en el plasma. Si en la cuantificación funcional se obtiene niveles bajos de antitrombina se hace la determinación antigénica. Se realiza por métodos de inmunodifusión radial, electroinmunoensayo o ELISA. Si es un defecto de síntesis (los niveles detectados por la cuantificación funcional y la determinación antigénica son los mismos) y si es una proteína disfuncional (son mayores los niveles obtenidos por la determinación 602

22 antigénica que por la cuantificación funcional). Proteína C: es una glucoproteína vitamina K dependiente con acción anticoagulante. Se puede hacer su determinación funcional midiendo la proteína C activada sobre un sustrato. Se puede utilizar el complejo trombina-trombomodulina o veneno de serpiente para activar a la proteína C. La detección se realiza añadiendo un sustrato cromogénico o su sustrato natural (factor Va y VIIIa). El primero es un método colorimétrico y el segundo una técnica coagulativa en la que se valora el alargamiento del tiempo de coagulación por la proteína C activa. Proteína S: es un cofactor no enzimático para la actividad de la proteína C activada sobre los factores Va y VIIIa. En el plasma va unida en un 60% a C4b binding protein (C4bBP) (15). El C4bBP es una glicoproteína de alto peso molecular del complemento, formada por 7 subunidades α idénticas y una subunidad β. Las subunidades α se unen a C4b y la unidad β se une a la proteína S (PS). Para evaluar su concentración hay que conocer la concentración total, la libre y su funcionalidad. La determinación de proteína S libre se realiza eliminando los complejos C4bBP-PS mediante precipitación con polietilenglicol. Luego se mide con una técnica ELISA. La determinación proteína S total se realiza por técnicas ELISA o de electroinmunoensayo. Por último, para la determinación funcional se mide el alargamiento del TTPa o de protrombina en el que el plasma citratado del enfermo se ha diluido en plasma deficiente en proteína S y al que se añade factor V y proteína C activada. El alargamiento del tiempo de coagulación es proporcional a la concentración de proteína S. Hay tres tipos de defectos: Tipo I (niveles bajos de PS total, libre y funcional), tipo II (niveles normales de PS total y libre y disminución de la PS funcional) este 603

23 tipo es poco frecuente y posteriormente se ha comprobado que muchos de los pacientes de este grupo realmente tenían el factor V Leiden mutado, y el tipo III (niveles normales de PS total, bajos de PS libre y funcional). Mutación factor V Leiden: cuando existe una mutación en el nucleótido 1691G>A en el gen del factor V, se produce un cambio de una arginina por una glutamina. Lo que da lugar a una mayor resistencia a la degradación del factor V por la proteína C activada, lo que está asociado a trombofilia. Se analiza el ADN mediante amplificación por PCR del fragmento genómico que contiene el nucleótido y se hace una digestión con una enzima de restricción. Mutación 20210G>A del gen de la protrombina: La mutación se da en el fragmento genómico del gen de la protrombina. Se produce un cambio en la zona 3 (no codificante), en el nucleótido 20210G>A. Se detecta por amplificación de la zona y posterior digestión con una enzima de restricción. La presencia de la mutación se asocia a niveles más elevados de factor II, y a un incremento del riesgo trombótico. Mutación Jak2: JAK2 (16) es una proteína con función tirosinquinasa implicada en la traducción de señal de los receptores de múltiples citoquinas. Se ha descrito una mutación en dominio pseudotirosinkinasa de esta proteína que confiere un estatus de activación permanente a esta proteína, lo que ocurre es que no puede ser inhibida por sus inhibidores. Esta mutación se sitúa en el aminoácido 617 y se produce un cambio de valina por fenilanina. La presencia de esta mutación se ha descrito en la trombocitosis esencial con una sensibilidad del 65% y una especificidad del 100%. Se analiza por High Resolution Melting (HRM), este método se basa en un análisis de PCR a tiempo real para identificar las variaciones en las secuencias de ácidos nucleicos, utilizando las curvas de la temperatura de melting (disociación del ADN). 604

24 9. TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA El diagnóstico de la hemostasia exige la realización de una historia clínica, una exploración física y un estudio complementario de laboratorio TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA (17) Trombocitopenia: se define como valores de plaquetas totales inferiores a /µl. Por debajo de 50000/µl se dan hemorragias espontáneas y por debajo de 10000/µl pueden resultar mortales. La trombocitopenia es resultado de uno o varios de los siguientes procesos: disminución de su producción por la médula ósea, secuestro, por lo general en un bazo crecido, o mayor destrucción de las plaquetas. En primer lugar hay que descartar la posible presencia de una "Pseudotrombocitopenia", sobre todo en pacientes sin una causa manifiesta de trombocitopenia. Es un error in vitro causado por la aglutinación de las plaquetas mediada por los anticuerpos anti-edta. Se debe comprobar el resultado y observar si se ha producido un coágulo en la muestra por incorrecta homogeneización del anticoagulante con la sangre recién obtenida. Descartar la existencia de agregados plaquetarios con la observación de un frotis de sangre periférica al microscopio óptico. Y por último diagnosticar la psedotrombopenia con la realización del recuento plaquetario en sangre recogida en un tubo con citrato de sodio. Los síntomas de los pacientes con trombocitopenia son pequeños sangrados de vénulas pequeñas o capilares en lugar de vasos grandes. La piel de estas personas muestra muchas manchas purpúreas pequeñas, de las que deriva el nombre de púrpura trombocitopénica. La púrpura trombocitopénica es un trastorno adquirido que desencadena la destrucción de plaquetas mediada por factores inmunitarios y también se produce la inhibición de la liberación de plaquetas a partir del 605

25 megacariocito. Trombocitopenia hereditaria, puede darse de forma aislada o como parte de otro síndrome. Es una enfermedad hereditaria autosómica dominante, autosómica recesiva o ligada a X. En la actualidad se sabe que muchas formas de trombocitopenia autosómica dominante están relacionadas con mutaciones en el gen de la cadena pesada de miosina no muscular MYH9. Trombocitosis: casi siempre se debe a una deficiencia de hierro, inflamación, cáncer o infección (trombosis reactiva), o un proceso mieloproliferativo subyacente (trombocitemia idiopática o policitemia verdadera) Trombopatías: dentro del grupo de trombopatías vamos a comentar la enfermedad de Von Willebrand, enfermedad de Bernard-Soulier y la enfermedad de Glanzman. Enfermedad de Von Willebrand: es el trastorno hemorrágico hereditario más frecuente (18). El factor de von Willebrand desempeña dos funciones: como principal molécula de adhesión que fija la plaqueta al subendotelio expuesto y como proteína fijadora para el factor VIII, lo cual trae consigo una prolongación importante de la vida media del factor VIII en la circulación sanguínea. La enfermedad de von Willebrand se ha clasificado en tres tipos principales (1, 2 y 3) y cuatro subtipos del tipo 2 (2A, 2B, 2M y 2N). El tipo 1 es el más frecuente. Los pacientes presentan, sobre todo, hemorragias en mucosas, equimosis excesiva y epistaxis. A menudo, la enfermedad de von Willebrand leve tipo 1 se manifiesta inicialmente durante las extracciones dentales o con la amigdalectomía. Muchos factores influyen tanto en las concentraciones de FvW como en los síntomas de hemorragia, se sabe que influyen el grupo sanguíneo del paciente, su estado hormonal tiroideo, la raza, el estrés y el ejercicio. 606

26 Los pacientes con enfermedad de von Willebrand tipo 2 tienen defectos funcionales en el FvW. La enfermedad de von Willebrand adquirida es un raro trastorno que se observa en pacientes con gammapatías monoclonales, mieloma múltiple y macroglobulinemia de Waldenström. Se sospecha en pacientes con síntomas recientes de hemorragia grave en mucosas, sobre todo en individuos de edad avanzada. Enfermedad de Bernard-Soulier: Enfermedad con herencia autosómica recesiva que se manifiesta por hemorragias desde la infancia. Existe un déficit del receptor plaquetario GpIb-IX-V. Enfermedad de Glanzman: Enfermedad hereditaria autosómica recesiva, caracterizada por un déficit del receptor de plaquetas GpIIb-IIIa TRASTORNOS DE LA COAGULACIÓN Trombosis venosa: Es el resultado de la formación de un coágulo obstructivo en las venas. Ocurre principalmente en las venas profundas de la pierna, desde donde algunas fracciones del coágulo a menudo embolizan hacia los pulmones. Los síntomas de trombosis venosa no son específicos y requiere estudios por imágen. El tratamiento con anticoagulantes debe ser rápido y adecuado. Los factores de riesgo para la trombosis, están relacionados con la inmovilización o con la hipercoagulabilidad. Trombofilia hereditaria: Estos pacientes tienen una tendencia genéticamente determinada al tromboembolismo venoso. Su primer episodio de trombosis suele aparecer alrededor de los años. No son recomendables los anticonceptivos orales que contienen estrógenos y se considerará la profilaxis anticoagulante después del parto en mujeres con trombofilia hereditaria. 607

27 Hemofilias: La hemofilia es una enfermedad hemorrágica recesiva ligada a cromosoma X producida por mutaciones en el gen F8 (hemofilia A o hemofilia clásica -> déficit factor VIII) o el gen F9 (hemofilia B -> déficit factor IX). Afecta a 1: varones, las mujeres son portadoras de la enfermedad. Clínicamente la hemofilia A y la hemofilia B son indistinguibles. El fenotipo de la enfermedad se correlaciona con la actividad residual del factor VIII o el IX y se clasifica como grave (<1%), moderada (1 a 5%) o leve (6 a 30%). En las formas grave y moderada, la enfermedad se caracteriza por episodios hemorrágicos en articulaciones, partes blandas y músculos después de un traumatismo menor o incluso en forma espontánea. Los pacientes con enfermedad leve experimentan hemorragias poco frecuentes que por lo general son consecutivas a traumatismos. Entre aquellos con actividad residual de factor VIII o IX de más de 25% del valor normal, la enfermedad se descubre únicamente por la hemorragia que se presenta posterior a un traumatismo importante o durante las pruebas de laboratorio que por lo general se realizan antes de una intervención quirúrgica. Las pruebas globales de la coagulación muestran sólo una prolongación aislada del análisis de TTPa. Los pacientes con hemofilia tienen tiempos de sangrado y recuentos plaquetarios normales. El diagnóstico se establece después de la determinación específica de la actividad coagulante de factor VIII o factor IX. Coagulación intravascular diseminada (CID): es un síndrome caracterizado por la formación incontrolada de fibrina intravascular en respuesta a la exposición de la sangre a concentraciones patológicas de fosfolípidos de los tejidos que da lugar a un consumo de factores de coagulación y plaquetas con una hiperfibrinólisis secundaria. Se produce un depósito de fibrina en zonas de microcirculación que ocluyen los 608

28 vasos en la microcirculación y puede derivar a un fallo multiorgánico. Las causas más frecuentes son la sepsis bacteriana, trastornos malignos como tumores sólidos, leucemia promielocítica aguda y causas obstétricas. La púrpura fulminante es una forma grave de coagulación intravascular diseminada debida a trombosis de zonas extensas de la piel. Los análisis de laboratorio deben incluir pruebas de coagulación (TTPa, TP y TT), marcadores de productos de la degradación de la fibrina (dímero D), recuentos plaquetarios y eritrocíticos y análisis del frotis sanguíneo al microscopio óptico, con la observación de esquistocitos (fragmentos de eritrocitos). Déficit de vitamina K: el déficit de la vitamina K se ha relacionado con las deficiencias combinadas de todas las proteínas dependientes de vitamina K, incluidas las proteínas procoagulantes protrombina, VII, IX y X, y los anticoagulantes proteína C y proteína S (19). La vitamina K es una vitamina liposoluble y es el cofactor para la carboxilación del carbono gamma de los residuos de ácido glutámico en los factores dependientes de vitamina K. El déficit de vitamina K en un paciente produce episodios hemorrágicos leves a graves. 609

29 BIBLIOGRAFÍA 1. Jaime Pereira. La fisiopatología de la hemostasia. Algunos aspectos sobre la vida y muerte de las plaquetas en la circulación. Boletín Escuela de Medicina U.C., Pontificia Universidad Católica de Chile 2008;33: Henán Bayona, Carlos Martínez, Alexandra Gómez. La coagulación normal. Un enfoque práctico para el neurólogo. Acta Neurol Colomb 2010;26: J. A. Páramo, E. Panizo, C. Pegenaute, R. Lecumberri. Coagulación 2009: una visión moderna de la hemostasia. Rev Med Univ Navarra 2009;53: Raúl Carrillo, Yisel Yudy, Jorge Raúl Carrillo. Modelo celular de la hemostasia y utilidad del factor VII recombinante activado en la práctica clínica. Acta Médica Grupo Ángeles 2007;5: Carlos Martínez-Murillo. Mecanismos de activación de la coagulación. Rev Med Inst Mex Seguro Soc 2006;44: P. Marco, J. C. Reverte. Nuevos aspectos clínicos y biológicos de la fibrinolisis. Haematologica/edición española 2009;94: S. Quintana González, C. Martínez Murillo. Modelo celular de la coagulación. Rev Hemo Trombo 2008;2: Mateo J, Santamaría A, Fontcuberta J. Hematología clínica. Fisiología y exploración de la hemostasia 2006; Elsevier 5ª Edición. 9. Chen A, Teruya J. Global hemostasis testing thromboelastography: old technology, new applications. Clin Lab Med 2009; Jun;29(2): Tuñón J, Martín-Ventura JL, Blanco-Colio LM, Lorenzo O, López JA, Egido J. Proteomic strategies in the search of new biomarkers in atherothrombosis. J Am Coll Cardiol 2010; May11;55(19):

30 11. Høgh AL, Nielsen KL. SAGE and LongSAGE. Methods Mol Biol 2008;387: Miesbach W, Schenk J, Alesci S, Lindhoff-Last E. Comparison of the fibrinogen Clauss assay and the fibrinogen PT derived method in patients with dysfibrinogenemia. Thromb Res 2010; Dec;126(6):e Carpenter SL, Mathew P. Alpha2-antiplasmin and its deficiency: fibrinolysis out of balance. Haemophilia 2008; Nov;14(6): Favaloro EJ, Wong RC. Laboratory testing for the antiphospholipid syndrome: making sense of antiphospholipid antibody assays. Clin Chem Lab Med 2011; Mar;49(3): Maurissen LF, Thomassen MC, Nicolaes GA, Dahlbäck B, Tans G, Rosing J, et al. Re-evaluation of the role of the protein S-C4b binding protein complex in activated protein C-catalyzed factor Va-inactivation. Blood 2008; Mar 15;111(6): Qian J, Lin J, Yao DM, Chen Q, Xiao GF, Ji RB, et al. Rapid detection of JAK2 V617F mutation using high-resolution melting analysis with LightScanner platform. Clin Chim Acta 2010; Dec 14;411(23-24): Fauci A, Braunwald E, Kasper D, Hauser S, Longo D, Jameson L, et al. Harrison Principios de Medicina Interna. Mc Graw-Hill. 17 a edición 18. Castaman G, Rodeghiero F. Advances in the diagnosis and management of type 1 von Willebrand disease. Expert Rev Hematol 2011; Feb;4(1): Lapecorella M, Napolitano M, Bernardi F, Pinotti M, Sbrighi PS, Marchetti G, et al. Effective hemostasis during minor surgery in a case of hereditary combined deficiency of vitamin K-dependent clotting factors. Clin Appl Thromb Hemost 2010; Apr;16(2):

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