Terapia Génica de la Ataxia de Friedreich Resumen

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1 Filip Lim feb 2014 Terapia Génica de la Ataxia de Friedreich Resumen La perdida de movimiento voluntario es una tragedia a cualquier edad pero muchos victimas de la ataxia de Friedreich son jóvenes a quienes esta enfermedad cruel ha intercambiado una niñez activa por una posible muerte precoz. Esta desorden neurológica tiene una prevalencia en Europa de 1-2 enfermos por cada habitantes y es la ataxia hereditaria más frecuente. Al igual que muchas otras enfermedades neurológicas, la falta de tratamiento farmacológico urge la exploración de otras estrategias terapéuticas como la terapia génica, una rama de medicina todavía en su infancia. Todas las experiencias en la clínica hasta la fecha indican la necesidad de mejorar ciertos aspectos básicos como la regulación de los genes terapéuticos, para que asemejen más a los genes naturales, y el desarrollo de métodos de administración que son seguros y eficaces. Nuestro grupo lleva más de 8 años con el objetivo de desarrollar una terapia génica para la ataxia de Friedreich y actualmente estamos en el proceso de trasladar estos conocimientos a la clínica. El proyecto propone un estudio de toxicología y eficacia en células neurales derivadas directamente de pacientes de la ataxia de Friedreich.

2 Terapia Génica de la Ataxia de Friedreich: Generación de Vectores para el uso en humano Por qué la Ataxia de Friedreich es en un importante ejemplo de enfermedad rara? Imagina tu hijo a los 13 años, con la emoción y el desafío de ser mayor. Como sus amigos, le empiezan a sobrar las piernas y se convierte en un adolescente patoso, pero en cambio de los demás que dejan atrás esta fase, notas que se tropieza cada vez más. Las voces de muchos chicos de su clase ya están cambiando pero tu hijo empieza mascullar como un borracho. Mientras que sus compañeros demuestran la destreza de los dedos con su nuevo móvil, el tuyo casi no consigue agarrar al cepillo de dientes. Imagina una enfermedad que le desconecta a tu hijo su cerebro de sus músculos, la degeneración de la medula espinal progresivamente robándole cuerpo y movimiento. Imagina decir a tu hijo que no existe cura ni tratamiento. La ataxia de Friedreich le dejará en silla de ruedas contemplándolo y a ti con la angustia de que además, tu hijo podría morir muy joven. El impacto de la ataxia de Friedreich en la calidad de vida es devastador no sólo para la víctima, sino también para los amigos y familia alrededor, haciendo hincapié en un problema común de muchas enfermedades raras. También pone de relieve la escasez de terapias eficaces para los trastornos neurológicos, ya sea rara o no. Por otro lado, es la más común de las ataxias hereditarias, por lo que un número suficiente de pacientes pueden ser reclutados en los estudios multicéntricos, asi haciendo más fácil obtener resultados estadísticamente significativos en colaboraciones nacionales e internacionales. Por qué utilizar la terapia génica para la ataxia de Friedreich? Al igual que muchas otras enfermedades neurológicas, aunque la ataxia de Friedreich padece de tratamiento, la causa genética subyacente ha sido identificado. El descubrimiento en 1996 de que la enfermedad tiene su origen en un defecto en el gen de la frataxina[1], ha impulsado la investigación en las consecuencias moleculares, para buscar fármacos que podrían intervenir. Sin embargo, hasta la fecha no se ha descubierto ningún medicamento capaz de detener o revertir la ataxia de Friedreich. Nosotros hemos abarcado otra estrategia terapéutica que aprovecha del conocimiento que la enfermedad se debe a un gen defectuoso. Los genes son las instrucciones que dirigen a las células para que produzcan los millones de proteínas diferentes que componen la maquinaria que nos mantiene vivos. La terapia génica es una técnica que introduce en las células, nuevas instrucciones que pueden corregir los problemas derivados de genes defectuosos, un tipo de cirugía molecular con la potencial de efectuar mejoras de por vida después de la intervención. Aunque todavía en sus inicios, esta tecnología ya cuenta con casi ensayos clínicos, con el primer producto de terapia génica comercial aprobada en Significativamente, se desarrolló este producto (Glybera) para el tratamiento de una enfermedad hereditaría muy poco común (lipoproteína de deficiencia de la lipasa), lo que subraya la importancia de la terapia génica para el tratamiento de enfermedades raras. En 2007 logramos demostrar que la terapia génica puede revertir los síntomas de la ataxia de 1

3 Friedreich en un estudio a corto plazo en ratones[2]. Introducimos un gen sano de frataxina en el sistema nervioso de los ratones utilizando partículas portadoras (vectores) fabricadas con herpesvirus inactivado; estos resultados prometedores nos animaron a perseguir el desarrollo de una terapia genética para los pacientes con ataxia de Friedreich. Cuáles son los obstáculos conocidos en el uso de genes para terapia? En nuestro estudio de prueba de concepto a corto plazo se utilizó un "minigen" sintético similar a los que se están utilizando en muchos ensayos clínicos de terapia génica en otras enfermedades. El pequeño tamaño de los mini-genes ha favorecido su uso debido a su rápida construcción y la posibilidad de administrarlos con vectores (herramientas que portan los genes) pequeños que pueden ser fabricados fácilmente por proveedores comerciales. Sin embargo, existen unas limitaciones con los minigenes actuales: Actividad no duradera En la mayoría de los pacientes que se han sometido a la terapia génica con minigenes, se ha observado la desaparición de los efectos terapéuticos con el tiempo, debido al fenómeno conocido como silenciamiento génico. Una estrategia común para resolver este problema ha sido aumentar la cantidad de vector inyectada, o utilizar elementos genéticos que provocan una mayor actividad génica. Sin embargo, aunque esto puede resulta en muchas células que muestran actividad génica duradera, no aborda el problema de cómo mantener una actividad moderada o baja en todas las células infectadas, o qué peligros están involucrados en una sobredosis de las células con genes (véase el siguiente punto). Insuficiente control sobre la actividad génica Otro obstáculo que se encuentra con los minigenes es la dificultad de regular su actividad con la misma precisión que presentan los genes naturales. El problema se asemeja al control del paso de agua con una llave de palanca corta o larga. Como es bien conocido en la farmacología, la dosis y la cinética de un medicamento influyen profundamente a su eficacia y su seguridad. Desde luego varios estudios han revelado que la sobrecarga de frataxina conduce a la muerte celular[3, 4] tanto como su falta en la enfermedad, subrayando la importancia de ejercer un control fino de la dosis. Los mini-genes han facilitado mucho el traslado a la clínica por la facilidad de su construcción, pero para efectuar la terapia génica con niveles sostenidos y fisiológicos será importante mimetizar más a los genes naturales[5], con todos sus elementos regulatorios que aseguran una actividad apropiada dentro el rango que se encuentra normalmente en las células. No se reproducen todas las funciones normales del gen Los genes naturales no son simples interruptores que se activan o desactivan, sino que contienen elementos sensores que les permiten responder a los cambios en su entorno, como el tipo de tejido y el estrés fisiológico. La secuenciación del genoma humano nos ha dado testimonio resaltando esto, al igual que el punto anterior - los genes humanos son mucho más grandes que sus homólogos en organismos más simples, lo que refleja la mayor precisión en la regulación necesaria para los organismos complejos. De hecho, un estudio reciente ha revelado que según el tipo de tejido, el gen natural de la frataxina produce distintas cantidades de 2

4 distintas isoformas de frataxina que pueden jugar un papel importante en la patología de la ataxia de Friedreich[6]. Tomando todo esto en cuenta, en 2011, en otro estudio en ratones, demostramos que la terapia génica puede ser duradera con una actividad regulada, si empleamos el gen natural de la frataxina[7] en vez de un minigen. Así, el escenario está listo para el traslado de estos resultados en el ser humano. Qué hay que hacer para empezar la terapia génica en pacientes con ataxia de Friedreich? Para trasladar nuestra terapia génica para la ataxia de Freidreich a la clínica, estamos desarrollando nuevos vectores que superarán dos grandes obstáculos: Insuficiente capacidad de los vectores actuales El gen natural de la frataxina es inusualmente grande y no encaja en los vectores disponibles comercialmente, que se derivan de especies de virus pequeños y simples. Nuestra estrategia es emplear vectores derivados de un virus más grande, en concreto, el herpesvirus HSV-1. Además de su gran capacidad, el neurotropismo natural de vectores derivados de este virus[8], les permite llegar a neuronas enterradas profundamente en el sistema nervioso central, tales como las de la médula espinal que se ven afectados en la ataxia de Friedreich. Administración segura de los genes Nuestro desarrollo de nuevos HSV-1 vectores también aborda el segundo reto que enfrenta la terapia génica neurológica: la producción de grandes cantidades de vectores no tóxicos y un procedimiento seguro para entregarlos en los pacientes, sin poner en peligro las delicadas estructuras del sistema nervioso ya debilitado. Aunque los vectores actuales derivados de HSV-1 no son fáciles de producir en escala industrial, ya se han utilizado en muchas pruebas clínicas sin ningún efecto adverso grave en pacientes hasta la fecha. Cabe destacar que en un reciente ensayo clínico en Michigan para aliviar el dolor en pacientes de cáncer, las inyecciones intradérmicas de vectores de HSV- 1 fueron utilizadas con éxito para introducir genes en las neuronas de la medula espinal[9]. El excelente perfil de seguridad de los vectores de HSV- 1 en el sistema nervioso humano apunta a su potencial para estrategias de terapia génica en enfermedades neurológicas. En concreto la ataxia de Friedreich representa un caso ideal, ya que las neuronas de la médula espinal son objetivos importantes, y hemos verificado que vectores portando genes de frataxina producen efectos terapéuticos. En 2013 iniciamos una colaboración con el grupo de Michigan (Dr. Marina Mata y Dr. David Fink ) y en menos de un año hemos podido generar un vector HSV-1 no-tóxico similar al suyo, pero con una mayor capacidad capaz de llevar el gen natural de frataxina. En la siguiente foto se ve el espectáculo éxito de este vector en transferir un gen marcador (color verde) a la gran mayoría de células en cultivos sin apenas provocar efectos tóxicos. 3

5 Nuestross novedosos vectores de HSV-1 pueden portar genes mucho más grandes que otros vectores, y introducirles en células sin toxicidad. Para tener una mejor idea de cómo nuestros nuevos vectores actuarán en la clínica, ahora vamos a ponerlos a prueba en células neurales derivados de pacientes con ataxia de Friedreich. Ya hemos desarrollado un procedimiento para cultivar este tipo de células a partir de biopsias nasales de pacientes y mediantee una colaboración con el Dr. José Luis Muñoz Blanco en el Hospital Gregorio Marañón de Madrid hemos establecido cultivos celulares derivados de pacientes con ataxia de Friedreich. En estas células vamos a confirmar la seguridad de nuestro vector de terapiaa génica mediante la medición de los posibles efectos secundarios tóxicos, así como su eficacia en la corrección de los defectos conocidos de estas células, tales como su debilidad al estréss oxidativo. Que experiencia tiene nuestro grupo que le posiciona como único en este campo? He tenido una ampliaa experiencia ( más de 20 años, más de 30 publicaciones ) en el diseño y uso de vectores virales para la transferencia de genes de células del sistema nervioso. En Boston ( ) desarrollé la tecnología para generarr altas concentraciones de vectores del virus del herpes[10] y participé en el desarrollo del primer sistema " libre de helper " de estos vectores (véase la patente[11]). En Madrid empecé la investigación el año 2000 sobre el uso de vectores del herpesvirus en ratones para desarrollarr terapias génicas para trastornos del movimiento[12]. Este trabajo fue seguido por un estudio de prueba de concepto que demuestra el rescate génico de déficit neurológico en un modelo de ratón de la ataxia de Friedreich por vectores de HSV-1 que expresan frataxina[2]. En colaboración con Richard Wade- Martins (Universidad de Oxford) generamos vectores de HSV-1 que codifican el locus genómico entero de FXN y demostramos que estos vectores pueden rescatar la sensibilidad al estrés oxidativo de los fibroblastos de pacientes de ataxia de Friedreich[13]. Más recientemente, demostramos que estos vectores del locus genómico de FXN pueden mantener una expresión persistentee de la frataxina en el sistema nervioso adulto[7]. El trabajo de mi grupo se centra en los mecanismos de reparación del sistema nervioso. Tecnologías especializadas en las que tenemos experiencia son: la transferencia de genes con vectores virales (lentivectores, vectores del virus del herpes), inmunocitoquímica, la ingeniería genética de los genomas grandes, cultivo de células neurales humanas y 4

6 neurodifferentiation, inyección estereotáxica de vectores virales y estudios de comportamiento en los ratones. De especial importancia son nuestras colaboraciones : Dra. Marina Mata y Dr. David Fink, de la Universidad de Michigan. El grupo de Michigan ha publicado recientemente los resultados de un ensayo clínico Fase I que describe el uso seguro de vectores derivados de HSV- 1 para el tratamiento de pacientes con cáncer que sufren de dolor intratable grave. En esta estrategia terapéutica, los vectores de HSV-1 inyectados por vía intradérmica sufren transporte axonal retrógrado y logran a introducir el transgén preproencefalina en las neuronas ganglionares de la raíz dorsal. Dr. Fink ha aceptado actuar como asesor para nuestro proyecto e informa que sus vectores de HSV-1 se han confirmado como seguros en un estudio de Fase 2. En nuestro proyecto estamos construyendo un vector de HSV-1 parecido y utilizaremos la misma estrategia de inyección / administración para introducir el transgén de la frataxina a las neuronas ganglionares de la raíz dorsal. Dr. José Luis Muñoz Blanco, Hospital Gregorio Marañón, de Madrid. La unidad del Dr. Muñoz Blanco es uno de los centros de referencia nacionales de España para la ataxia de Friedreich y nos ha proporcionado biopsias de pacientes para estudiar esta enfermedad. Cómo va a contribuir el proyecto en la lucha contra otras enfermedades? Nuestro proyecto tiene como objetivo establecer dos pruebas de concepto para la terapia génica humana de las enfermedades neurológicas. 1. La inyección no invasiva de vectores de herpesvirus en la piel / músculo para efectuar la terapia génica de neuronas localizadas profundamente dentro de la médula espinal 2. El uso de un gran gen natural para conseguir niveles de actividad persistentes y fisiológicamente seguras Estos estudios tienen relevancia para muchas otras enfermedades neurológicas, dado que el sistema nervioso es especialmente frágil y de difícil acceso, y todas las experiencias de la terapia génica clínica hasta la fecha indican que la correcta regulación de los genes administrados es de suma importancia para el éxito terapéutico. La confirmación de que nuestros nuevos vectores son capaces de transportar grandes genes y introducirlos eficiente y específicamente en las neuronas localizadas profundamente dentro de la médula espinal abrirá el camino de su aplicación en otras estrategias de terapia génica in vivo para otras enfermedades. Objetivo del proyecto Para luchar contra la degeneración en pacientes de ataxia de Friedreich, nuestro objetivo actual es armar nuestro vector novedoso con el gen natural de la frataxina. Una vez superado esta tarea, empezaremos el proceso de confirmar la biocompatibilidad de nuestra terapia para una prueba clínica. Ya hemos comenzado una colaboración con el grupo del 5

7 Dr. Fink en Michigan para una evaluación preliminar de la biodistribución, la toxicología y la duración de nuestra terapia en ratones, pero en la esta solicitud ahora buscamos apoyo en esta solicitud para: Un estudio de toxicología y eficacia en células neurales derivadas directamente de pacientes de la ataxia de Friedreich. Plan de trabajo y tiempo previsto Actualmente las biopsias recogidas de pacientes de enfermedades neurológicas están limitadas a células no-neurales. Sin perjuicio de la importancia que tienen estos modelos, nosotros creemos que es una alta prioridad obtener modelos neurales que reflejan el problema molecular y que nos sean útiles para evaluar nuevas vías de intervención terapéutica. Recientemente hemos descrito una nueva técnica de cultivar células neurales derivados de biopsias nasales de pacientes[14] y hemos logrado obtener muestras derivadas de pacientes de la ataxia de Friedreich. Estos cultivos demuestran ciertas defectos que reflejan la enfermedad como la sensibilidad al estrés oxidativo, y nos sirven como los modelos humanos más próximos al sistema nervioso de los pacientes en que pretendemos aplicar nuestra terapia génica en el futuro. La evaluación de nuestros vectores para su capacidad de revertir los defectos celulares sin provocar una toxicidad importante aportará datos imprescindibles para el dossier de datos necesario para una prueba clínica. En concreto, los ensayos que vamos a llevar a cabo son: inmunocitoquímica y western blot para determinar la expresión de frataxina rtpcr para evaluar la expresión de diferentes isoformas de frataxina reportados a ser importantes en la patología de la enfermedad[6] la actividad citostática, midiendo la perturbación en la formación de colonias de células después de la infección a alta moi similar a los ensayos efectuados con otros vectores de HSV-1[15] citotoxicidad, como hemos descrito anteriormente[16] mediante la medición de la captación de calceına-propidio y por el ensayo MTT (para medir la integridad mitocondrial) liberación de moléculas proinflamatorias (en particular, TNF α, IL- 6, IL- 1 e IFN γ ) en respuesta a la infección[17]. Fluidos recogidos se procesarán para la detección de citoquinas empleando kits comerciales de ELISA (Quantikine immune assays; R&D systems) Los resultados de este estudio preliminar aportarán datos importantes sobre la seguridad y la eficacia de nuestro vector HSV-1 para los ensayos en humanos. Esto será importante antes de la próxima fase de invertir recursos considerables en el traslado de los resultados del laboratorio a los estudios GMP. El tiempo previsto para llevar a cabo esta evaluación preliminar es de 18 meses. 6

8 Personal La generación de vectores y su caracterización se lleva a cabo actualmente por 2 estudiantes de doctorado. Para efectuar los estudios necesarios en cultivos neurales derivados de pacientes con ataxia de Friedreich, solicitamos la contratación de un técnico. Presupuesto por año total salario de 1 técnico materiales para cultivo celular, bioquímica, inmunoquímica, biología molecular presupuesto total 18 meses Bibliografía [1] Campuzano, V., L. Montermini, M.D. Molto, L. Pianese, M. Cossee, and F. Cavalcanti (1996) Friedrich's ataxia: autosomal recessive disease caused by an intronic GAA triplet repeat expansion. Science, 271, [2] Lim, F., G.M. Palomo, C. Mauritz, A. Gimenez Cassina, B. Illana, F. Wandosell, and J. Diaz Nido (2007) Functional recovery in a Friedreich's ataxia mouse model by frataxin gene transfer using an HSV 1 amplicon vector. Mol Ther, 15, [3] Fleming, J., A. Spinoulas, M. Zheng, S.C. Cunningham, S.L. Ginn, R.C. McQuilty, P.B. Rowe, and I.E. Alexander (2005) Partial correction of sensitivity to oxidant stress in Friedreich ataxia patient fibroblasts by frataxin encoding adeno associated virus and lentivirus vectors. Hum Gene Ther, 16, [4] Navarro, J.A., J.V. Llorens, S. Soriano, J.A. Botella, S. Schneuwly, M.J. Martinez Sebastian, and M.D. Molto (2011) Overexpression of human and fly frataxins in Drosophila provokes deleterious effects at biochemical, physiological and developmental levels. PLoS One, 6, e [5] Porteous, D., Gene Therapy, in Doctors to the Genome: From conception to maturity, I.A.H.R.M. Gardiner, Editor. 1998, Royal College of Physicians of London: London. p [6] Xia, H., Y. Cao, X. Dai, Z. Marelja, D. Zhou, R. Mo, S. Al Mahdawi, M.A. Pook, S. Leimkuhler, T.A. Rouault, and K. Li (2012) Novel frataxin isoforms may contribute to the pathological mechanism of Friedreich ataxia. PLoS One, 7, e [7] Gimenez Cassina, A., R. Wade Martins, S. Gomez Sebastian, J.C. Corona, F. Lim, and J. Diaz Nido (2011) Infectious delivery and long term persistence of transgene expression in the brain by a 135 kb ibac FXN genomic DNA expression vector. Gene Ther, 18, [8] Lim, F. (2013) HSV 1 as a Model for Emerging Gene Delivery Vehicles. ISRN Virology, 2013, Article ID , 12 pages. [9] Fink, D.J., J. Wechuck, M. Mata, J.C. Glorioso, J. Goss, D. Krisky, and D. Wolfe (2011) Gene therapy for pain: results of a phase I clinical trial. Ann Neurol, 70, [10] Lim, F., D. Hartley, P. Starr, P. Lang, S. Song, L. Yu, Y. Wang, and A.I. Geller (1996) Generation of hightiter defective HSV 1 vectors using an IE 2 deletion mutant and quantitative study of expression in cultured cortical cells. Biotechniques, 20, [11] Fraefel, C., A.I. Geller, and F. Lim, Helper virus free herpesvirus vector packaging system, in US Patent & Trademark Office. 1998, Children's Medical Center Corporation (Boston, MA): USA. [12] Agudo, M., J.L. Trejo, F. Lim, J. Avila, I. Torres Aleman, J. Diaz Nido, and F. Wandosell (2002) Highly efficient and specific gene transfer to Purkinje cells in vivo using a herpes simplex virus I amplicon. Hum Gene Ther, 13,

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