3. METODOLOGÍA 3.1 Metodología general de recolección de las aguas residuales del proceso de aprovechamiento de desechos de crustáceos

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1 3. METODOLOGÍA 3.1 Metodología general de recolección de las aguas residuales del proceso de aprovechamiento de desechos de crustáceos Durante el proceso de extracción de quitina y quitosano se consideran cuatro pasos importantes: lavado somero, desmineralización, desproteinización y desacetilación. Cada una de estas etapas es seguida por un proceso de lavado en el cual se recupera la fracción sólida desechando completamente la fracción líquida representando esto un efluente del proceso. En total se tuvo la producción de cuatro diferentes efluentes correspondientes a las etapas de procesamiento, y se obtuvo un efluente complejo mezclando la totalidad de estos. En la Figura 8 se muestra el proceso general de extracción los puntos de generación de efluentes. 3.2 Caracterización de los efluentes Los efluentes producidos en cada etapa del procesamiento se recolectaron en su totalidad, tomando alícuotas para su análisis. Se analizaron diversos parámetros como: DQOt, DQOs, perfil de sólidos suspendidos totales y volátiles, ph, amonio, conductividad y nitrógeno orgánico En la Tabla 7 de la sección de resultados se muestran los diversos parámetros analizados, explicando la aplicación de técnicas analíticas en el apartado de métodos analíticos descrito más adelante. 3.3 Estudios en Lote Los estudios en lote para la determinación de la actividad metanogénica específica, actividad desnitrificante, pruebas de inhibición y de biodegradabilidad, se realizaron por triplicado en botellas serológicas de 120 ml. Las condiciones de operación en lo que respecta al volumen y relación sustrato/biomasa (S/X) se modificaron según el análisis realizado. Se taparon con tapones de caucho y arillos de aluminio, y la temperatura de incubación fue de 35 C. El arreglo experimental para el monitoreo de producción de biogás fue en continuo por desplazamiento de una solución de NaOH al 3% como se muestra en la Figura 9.

2 Materia Prima (caparazón de jaiba) Lavado Somero (LS) Efluente 1 Secado Desmineralización (DM) Lavado y Secado Efluente 2 Desproteinización (DP) Efluente Compuesto Lavado y Secado Efluente 3 Quitina Desacetilación (DA) Lavado y Secado Efluente 4 Quitosano Figura 8. Proceso de extracción para el aprovechamiento de desechos de crustáceos y puntos de generación de efluentes.

3 2 1 3 Figura 9. Medición de biogás. 1) Botella Serológica, 2) Solución de NaOH al 3% y 3) Probeta para medir NaOH desplazado.

4 Actividad Metanogénica Especifica (AME) La actividad metanogénica específica (AME = gdqo-ch 4 gssv -1 d -1 ) se define como la velocidad de producción de metano, expresado como DQO, con respecto a la biomasa medida como el contenido de sólidos suspendidos volátiles (SSV). La determinación de la AME se realizó con un volumen de operación de 100 ml y una relación S/X=0.72 gdqo gssv -1. La cinética se monitoreó cada 2 horas durante un periodo de 24 horas. Se utilizó acetato como fuente de carbono. Mediante la Ecuación 1, se determinó la actividad metanogénica específica. El volumen de gas producido con respecto al tiempo fue recalculado tomando en cuenta la temperatura de la cinética y la presión atmosférica de la ciudad de Hermosillo, Sonora. AME = m γ CH4 X DQO Ec 1. En donde: Pendiente = m = LCH 4 d Biomasa = X = gssv L STP Conversión de metano γ CH4 = 0.35 LCH 4 DQO gdqo Se usó el medio mineral de Visser (1995) mostrado en la Tabla Pruebas de Inhibición Las pruebas de inhibición permiten conocer la concentración a la cual la actividad biológica se ve reducida en un 50% y en un 100%, respectivamente, y se expresa como IC 50 e IC 100 para un compuesto dado.

5 Para la realización de las pruebas de inhibición se siguió la misma metodología que en la sección La concentración utilizada de NH 4 + y NO 3 - se varió de 1 a 4 g L -1, realizando cinéticas de inhibición para cada compuesto, así como la mezcla de los dos con una relación de gno 3 - :gnh 4 + de 1:1, 1:2, 1:3, 2:2, 2:3, 3: Pruebas de Biodegradabilidad Metanogénica de la mezcla compuesta En pruebas de biodegradabilidad anaerobia se mide la velocidad de degradación de un compuesto en relación a un compuesto patrón (por ejemplo, acetato) determinando sus AME. Las pruebas de biodegradabilidad se llevaron a cabo en botellas serológicas con un volumen de operación de 100 ml y un espacio de cabeza de 20 ml. La muestra problema se diluyó en una relación 1:10 dando como resultado una relación S/X=0.68 gdqo gssv -1. Se siguió la cinética de degradación por un lapso de tiempo de 72 horas, realizando muestreos cada 4 horas las primeras 24 horas y de 6 horas hasta finalizar la cinética Actividad Desnitrificante La actividad desnitrificante (gno 3- gssv -1 d -1 ) se define como la velocidad de consumo de nitrato, con respecto a la biomasa expresada como el contenido de sólidos suspendidos volátiles (SSV). Se utilizo medio mineral descrito en la Tabla 5 y un volumen de operación de 100 ml, estableciendo un ph neutro con NaHCO 3. Con una relación S/X= gno 3- gssv -1, y una C/N=3, siendo esta la usada en la operación del reactor en continuo.

6 Tabla 4. Medio mineral propuesto por Visser (1995) para pruebas en lote. Macronutrientes Compuesto mg L -1 NaH 2 PO 4 H 2 O 703 K 2 HPO NH 4 Cl 280 MgSO 4 7H 2 O 111 CaCl 2 2H 2 O 6 NaHCO Extracto de levadura 20 Soln. de elementos traza 1 ml L -1 Solución de elementos traza Compuesto mg L -1 FeCl 2 4H 2 O 2000 MnCl EDTA 500 Na 2 SeO H 3 BO 3 50 ZnCl 2 50 (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 4H 2 O 50 AlCl 3 50 NiCl 3 6H 2 O 50 CoCl 2 2H 2 O 50 CuCl 2 2H 2 O 50 HCl concentrado 1 ml L -1 EDTA: Ácido Etileno Diamino Tetracético

7 Tabla 5. Composición del medio mineral desnitrificante. Compuesto mg L -1 KH 2 PO CaCl Na 2 MoO 4-2H 2 O 69.1 MgSO 4-7H 2 O C 6 H 12 O FeCl 3-6H 2 O CuSO NaNO Fuente: Martínez-Hernández, 2003

8 3.4 Estudios en continuo Armado y montaje de reactores Los reactores utilizados para el tratamiento fueron los siguientes: un reactor de lecho expandido de lodos granulares (EGSB) y un filtro aerobio empacado con zeolita natural. La configuración de los reactores es similar, difiriendo solamente en el empaque de la columna del reactor. En la Figura 10 se presenta la configuración de los reactores. En la Figura 11 se muestra el diagrama esquemático de los reactores conectados en serie. Este arreglo permitió unir los dos sistemas teniendo así un sistema anaerobio-aerobio Reactor desnitrificante Los estudios se llevaron a cabo en un reactor EGSB de acrílico con un volumen de operación de 3.8 L, 1.2 m de altura y un diámetro interno de columna de 4.6 cm., con un tiempo de residencia hidráulica (TRH) de 1 día, velocidades ascensionales (Us) de 2.4 a 10 m h -1 a 30 ºC y sin regulación de ph. Operándose básicamente en dos etapas descritas en los siguientes apartados. En la Figura 10 se muestra el diagrama del reactor EGSB. a) Inoculo El reactor se inoculó con 400 ml de biomasa con un contenido de SST y SSV de 62.7 y g L -1 respectivamente, provenientes de un digestor anaerobio de la Planta Tratadora de Aguas Residuales de Cervecería Modelo del Noroeste S.A de C.V. Estos lodos fueron adaptados a condiciones desnitrificante usando glucosa y nitrato de sodio. b) Arranque y Aclimatación (Medio Mineral Sintético) En esta etapa se usaron concentraciones de glucosa y acetato de sodio de 1 gc 6 H 12 O 6 L -1 y 1.78 gnano 3 L -1 respectivamente, dando una relación C/N de 1.4, las relaciones C/N se modificaron gradualmente hasta 4. El medio mineral utilizado en la etapa de aclimatación y arranque del reactor se presenta en la Tabla 5.

9 Figura 10. Configuración de los reactores anaerobio y aerobio. 1) Cabezal, 2) Columna, 3) Tornillos de acero inoxidable, 4) Salida (Efluente), 5) Entrada (Influente) y 6) Salidas laterales para toma de muestra.

10 Figura 11. Diagrama esquemático de los reactores en serie. 1) R. Desnitrificante, 2) Filtro Aerobio Nitrificante, 3) Empaque de Zeolita Natural, 4) Sedimentador, 5) Columna de Aireación, 6) Reservorio-Sedimentador, 7) Medidor de Biogás y 8) Bombas peristálticas.

11 c) Operación con efluente real Una vez finalizado los periodos de aclimatación y arranque, se procedió a la formulación del medio con efluente real (mezcla compuesta) del proceso de aprovechamiento de desechos de jaiba. La mezcla compuesta de diluyó en una relación 1:10 para ajustar a una concentración de DQO de 2 gdqo L -1 aproximadamente. Se adicionó con 1.3 g NO 3 - y se neutralizó el ph con NaOH 10N Filtro aerobio nitrificante Los estudios en continuo se llevaron a cabo en una columna de acrílico de 1.2 m de altura y un diámetro interno de columna de 5.3 cm, con un volumen de operación de 3 L. La columna fue empacada con zeolita natural, tamizada en malla No.2 y No.4 (4.76 mm), dando como resultado un volumen operacional de 1.7 L. Se fijó un TRH de 1 y 0.5 días en las etapas de arranque y aclimatación, respectivamente, con velocidades ascensionales de 8 a 10 m h -1, a 30 ºC, y sin regulación del ph. La fuente de oxígeno fue proporcionada con aire atmosférico, utilizando una columna de saturación externa. El filtro aerobio (Figura 11) se operó básicamente en dos etapas, descritas en los siguientes apartados. a) Inoculo El filtro se inoculó con biomasa aerobia de las lagunas aireadas de Cervecería Modelo del Noroeste S.A de C.V. b) Arranque y Aclimatación (Medio Mineral Sintético) El arranque del filtro aerobio se inició con una velocidad de carga de 4gDQO L -1 d -1 y una carga de nitrógeno de 0.16 gnh 4+ L -1 d -1, a fin de permitir la rápida colonización del reactor. En esta etapa, dicho reactor se operó como un proceso de lodos activados; una vez logrado este propósito, la carga orgánica se redujo gradualmente hasta omitir por completo la fuente de carbono, manteniendo la carga de nitrógeno y dejando así condiciones completamente nitrificantes. En la operación bajo condiciones nitrificantes se utilizó una relación estequiométrica C/N de 1.7, hasta alcanzar eficiencias de remoción de amonio mayores de 90%. La carga de amonio se aumentó gradualmente de 0.16 hasta un máximo de 0.5 gnh 4+ L -1 d -1. El

12 medio mineral utilizado en la etapa de aclimatación y arranque del reactor se presenta en la Tabla 6. c) Operación con efluente real Una vez finalizado los periodos de aclimatación y arranque teniendo altas eficiencias de remoción de compuestos carbonados y nitrogenados, se procedió a la conexión en serie de los reactores teniendo así, un sistema acoplado o tren de tratamiento de los efluentes de dos etapas: la primera etapa consiste en la aplicación de un proceso anaerobio desnitrificante para la remoción de nitrato y DQO, con la producción de cantidades significativas de amonio y biogás (nitrógeno molecular principalmente) y una segunda etapa en la que se utilizó un proceso aerobio nitrificante en la cual se oxida el amonio producido durante el proceso anaerobio produciendo nitrato, el cual puede ser recirculado a la primera etapa. En la Figura 12 se muestra la metodología general del tratamiento anaerobio/aerobio de efluentes contaminados.

13 Tabla 6. Composición del medio mineral nitrificante. Compuesto mg L -1 NH 4 Cl 980 KH 2 PO CaCl-2H 2 O 66.5 MgSO 4-7H 2 O NaHCO NaCl 1000 Fuente: Martínez-Hernández, 2003

14 Figura 12. Tren de tratamiento de las aguas residuales del procesamiento de desechos de jaiba.

15 Parámetros operacionales de los reactores en continuo S = Concentración de DQO g L -1 á Tasa de recirculación R RF L d Flujo de recirculación F L d Flujo de alimentación ó % 100 í 1 Donde: ó Á

16 3.5 Métodos analíticos Demanda Química de Oxígeno (DQO) Se determinó la DQO mediante la técnica de reflujo cerrado. Se tomaron las muestras a la entrada y salida del reactor. A 2 ml de muestra, se les adicionó 1 ml de solución digestora de K 2 Cr 2 O 7 con sulfato de mercurio y 2 ml de ácido sulfúrico con sulfato de plata, posteriormente se homogenizaron en un agitador tipo vortex durante 1 minuto y se digirieron en una parrilla de calentamiento a 150 C durante 2 horas. Se cuantificó la concentración DQO en un espectrofotómetro UV visible a 620 nm y haciendo uso de la curva estándar de glucosa anhídrida, (sección A.1) Nitrato (NO - 3 ) Su cuantificación se realizó con el kit Nitra-Ver de alto rango Hach. A 10 ml de muestra tomada del influente y efluente de los reactores, se les adicionó un sobre de reactivo, posteriormente se mezclaron por 1 minuto y de dejaron en reposo por espacio de 5 minutos. La concentración de las muestras fue determinada en un espectrofotómetro UV visible a 500 nm y haciendo uso de la curva estándar de nitrato de sodio anhídrido, se cuantificó el NO 3 - (sección A.3) Nitrito (NO - 2 ) Se determinó con el kit Nitri-Ver de bajo rango Hach. A 10 ml de muestra de influente, así como al efluente de los reactores, se les adicionó un sobre de reactivo, posteriormente se mezclaron por 1 minuto y de dejaron en reposo por espacio de 10 minutos. La concentración de las muestras fue determinada en un espectrofotómetro UV visible a 500 nm y haciendo uso de la curva estándar de nitrito de sodio anhídrido, se cuantificó el NO - 2 (sección A.4) Amonio La determinación de nitrógeno (NH 3 ) en la caracterización de los efluentes del proceso de aprovechamiento de desechos de jaiba se realizó por métodos estándares (1998). La concentración de amonio (NH + 4 ) de los influentes y efluentes de los reactores se determinó por el método de Bower y Holm-Hansen (1980). El procedimiento se realiza

17 de la siguiente manera: se toma 1mL de muestra diluida, se añaden 120µL de reactivo de salicilato-catalizador y 200µL de solución combinada de hipoclorito de sodio-citrato, y se mezcla en un agitador tipo vortex por 30 segundos, posteriormente se resguardan en oscuridad durante 2 horas y se leen en un espectrofotómetro UV visible a 640 nm. La cuantificación de la concentración se realizó en base a la curva estándar de amonio (sección A.2) Sólidos suspendidos La medición de los sólidos suspendidos se realizó siguiendo métodos estándares (1998). Para la determinación de los sólidos suspendidos totales, la muestra es secada a 110º C durante una hora. Posteriormente, para cuantificar los sólidos suspendidos fijos, la muestra es calcinada durante una hora a 550º C. La cantidad de sólidos suspendidos volátiles presentes en la muestra es obtenida por diferencia entre los sólidos suspendidos totales y los fijos y es considerada como la biomasa presente en el lodo. La concentración de sólidos suspendidos totales (gsst L -1 ) se calcula de la siguiente manera: Donde: A = peso del crisol (g) gsst L B = peso del crisol + muestra (g) a 110 C V = volumen de la muestra (L) A - B = V Para los sólidos fijos (gssf L -1 ), la formula es la siguiente: gssf L = C - A V

18 Donde: C = peso del crisol + muestra (g) a 550 C Por último, los sólidos suspendidos volátiles (gssv L -1 ) son obtenidos por diferencia: gssv L = gsst L - gssf L Oxígeno disuelto (OD) El análisis del oxigeno disuelto mide la cantidad de oxigeno gaseoso (O 2 ) en una solución acuosa, esta se realiza en muestras tomadas recientemente y se analizan inmediatamente. La concentración de OD (mg L -1 ) se determinó con un electrodo OBD de Fisher Scientific modelo SSP. La medición de oxígeno disuelto se midió directamente en el cabezal del filtro aerobio nitrificante Potencial de hidrogeno (ph) Para su determinación se utilizó un potenciómetro marca Accumet modelo XL60 de Fisher Scientific, calibrado diariamente con buffers ph 4, 7 y 10. Las muestras a las cuales se les determinó este parámetro fueron al influente y efluente de cada reactor Conductividad eléctrica La determinación se midió con un conductímetro Myron modelo DCH4 calibrado previamente. Este parámetro se determinó para las aguas residuales del proceso de aprovechamiento de desechos de jaiba Cuantificación de Biogás El biogás producido se midió mediante la técnica de desplazamiento (Figura 13) de una solución saturada de NaCl (300 gnacl L -1 ), ajustada a un valor de ph menor a 2 con HCl concentrado para impedir la disolución de CO 2 y como indicador del cambio de ph por disolución de H 2 CO 3 se usó rojo de metilo. El volumen desplazado se midió en una columna de 4.45 cm de diámetro interno con una altura de 25 cm, cuya capacidad de medición de biogás fue de ml biogás cm -1 desplazado.

19 Figura 13. Medidor de Biogás. 1) Columna de Biogás, 2) Solución saturada de NaCl, 3) Entrada de Biogás y 4) Válvula de purga.

20 La determinación del volumen de biogás producido se realizó de la siguiente manera: Á 4 Volumen por centímetro desplazado = cm 3 = ml = A r h Producción de Biogás = ml d = A r h t Donde: = diámetro de la columna = cm h = altura desplazada en la columna = cm t = tiempo transcurrido de la medición = día Alcalinidad La medición se realizó de acuerdo a métodos estándares (1998). Para su determinación se tomaron 50 ml de muestra de influentes y efluentes de los reactores y se titularon con acido sulfúrico 0.1N, registrando los valores de ácido gastado. Posteriormente se procedió al cálculo de las concentraciones de carbonato (CO - 3 ) y bicarbonato (HCO - 3 ) de la siguiente manera: Resultados Volumen de ácido gastado correspondiente a: Bicarbonato (HCO - 3 ) Carbonato (CO - 3 ) P = 0 T 0 P < ½ T T 2P 2P P = ½ T 0 2P P > ½ T 0 2(T - P) P = T 0 0 P = ml de ácido gastados a ph=8.1 (si el ph es menor, P = 0) T = ml de ácido gastados a ph=4.5

21 Bicarbonato: HCO - 3 mg A N = L M Carbonato: CO = 3 mg L = A N M Donde: A = ml de ácido gastado N = normalidad del ácido M = ml de muestra 61 y 30 = peso molecular del bicarbonato y carbonato, respectivamente 1000 = factor de conversión de ml a Litros