Práctica 3 : Introducción a la microscopia celular

Transcripción

1 Práctica 3 : Introducción a la microscopia celular I. - OBJETIVOS Al final del laboratorio el estudiante debe ser capaz de: * Identificar y manejar las diferentes partes de un microscopio compuesto. * Aprender a colocar el microscopio en posición de trabajo. * Aplicar los procedimientos para preparar materiales y observarlos en el microscopio. * Identificar algunas estructuras celulares y sus respectivas funciones. * Realizar esquemas de las estructuras celulares y rotularlos adecuadamente utilizando el aumento del microscopio. II. Introducción Según la teoría celular, la célula es la estructura biológica más pequeña y simple que posee todas las características básicas de la vida. Todos los organismos vivos están compuestos de una o más células y toda actividad que realiza un organismo vivo está relacionada con las actividades metabólicas de las células. Así, para entender los procesos de la vida se necesita entender la estructura y la función de la célula. Las células, sin embargo, se encuentran por debajo del límite de la resolución del ojo humano, haciendo necesario la utilización de un instrumento con capacidad de amplificación visual y alta resolución. El microscopio es un instrumento diseñado para hacer posible la observación y el examen de objetos muy pequeños, los cuales no podrían ser vistos sin la ayuda de lentes amplificadores. Hay dos tipos de microscopio según la fuente utilizada para su funcionamiento: el microscopio de luz y el microscopio electrónico. Dentro de los microscopios de luz existen variaciones; los más usados y conocidos son los microscopios simples o lupa, el microscopio compuesto y el microscopio binocular estereoscopio. Podemos encontrar otros tipos de microscopios de uso más especializado en determinados campos de la biología y otras ciencias, tales como el microscopio de contraste de fase, de fluorescencia, UV, de luz polarizada, confocal., etc.) Los microscopios que se utilizan en entornos científicos cuentan con varias mejoras que permiten un estudio integral del espécimen. El microscopio óptico común está conformado por tres sistemas: (a) sistema mecánico, constituido por una serie de piezas en las que van instaladas las lentes, y que permiten el movimiento para el enfoque, (b) sistema óptico que comprende un conjunto de lentes dispuestas de tal manera que produce el aumento de las imágenes que se observan a través de ellas, y (c) sistema de iluminación que comprende las partes del microscopio que reflejan, transmiten y regulan la cantidad de luz necesaria para efectuar la observación a través del microscopio.

2 Para la formación de la imagen, el microscopio óptico de luz dispone de una distribución específica de grupos de lentes que permiten una gran amplificación. La fuente luminosa es un filamento de tungsteno cuya luz es dirigida hacia un sólo punto mediante la lente condensadora. El haz luminoso incide por debajo de la preparación que debe ser lo bastante fina como para que la luz pueda atravesarla. Al pasar por la muestra, parte de la luz es absorbida por ésta y la diferencia de absorción de la luz en diferentes partes del espécimen produce contrastes que revelan detalles de su estructura. Tras atravesar la muestra, la luz pasa a través de los lentes objetivos localizados por encima de la preparación. Existen diferentes lentes objetivos con diferentes capacidades de amplificación de la muestra y resolución de la imagen que pueden ir intercambiándose a lo largo del estudio: 4X Este objetivo magnifica la imagen 4 veces su tamaño real. Este objetivo es utilizado para localizar el objeto que se va a estudiar, antes de observarlo con mayor magnificación. 10X Este es un objetivo de bajo poder que magnifica 10 veces la imagen 40X Este es un objetivo de alto poder que magnifica 40 veces la imagen. Finalmente, la luz pasa a través de los lentes oculares a través de los cuales, el investigador observará la preparación. Los oculares amplían en 10 veces (10X) la imagen. Por lo tanto, la magnificación total de cualquier preparación que se observa a través del ocular será el producto de la magnificación del lente ocular y del lente objetivo. La mayoría de los microscopios que se usan en los laboratorios de investigación tienen un objetivo adicional denominado 100X, que requiere la utilización de aceite de inmersión para obtener buena resolución y evitar daño al objetivo. Con este objetivo se obtiene una amplificación de 100 veces el tamaño real de la imagen. En el laboratorio no vamos a usar este objetivo. Los microscopios cuentan ademán con un lente condensador y un diafragma que se localizan justo debajo de la platina. El primero permite capturar y enfocar la luz desde la lámpara, directamente hacia el objeto en estudio, mientras el diafragma permite ajustar la cantidad de luz que pasa a través de la preparación. Dado que la imagen de la muestra es invertida y ampliada muchas veces, es difícil moverla de forma manual. Por ello los soportes de los microscopios científicos de alta potencia están montados en una plataforma que se puede mover con tornillos micrométricos. Algunos microscopios cuentan con soportes giratorios. El microscopio compuesto es utilizado con altos poderes de amplificación para hacer observaciones de objetos sumamente pequeños, los cuales tienen que estar finamente cortados y puestos sobre vidrios especiales denominados portaobjetos. Además, deben ser transparentes para que la luz pueda atravesarlos. Es frecuente también cubrir los objetos con otros vidrios especiales más pequeños que los anteriores llamados cubreobjetos. Cuando se trabaja en el laboratorio, es de gran importancia conocer el poder o grado de aumento, el poder de resolución y la distancia de trabajo. El grado de aumento es la magnificación total que sufre la imagen del objeto debido al efecto de los lentes oculares y objetivos. Se obtiene multiplicando el número de veces que aumenta el lente ocular por el número de veces que aumenta el lente objetivo. Por ejemplo, si el ocular aumenta 10 veces el tamaño de una muestra observada con un objetivo 40X, la magnificación total en este caso será: 10X x 40X = 400X. En la misma forma se procede cuando se trabaja con otros lentes de mayor poder. Este resultado permite saber cuántas veces más grande estamos viendo la imagen de un objeto. Igualmente importante es el poder de resolución, que es la posibilidad de distinguir dos puntos muy cercanos entre sí. Cuanto mayor sea el poder de resolución, menor será la distancia entre dos puntos

3 pueden distinguirse como tales. El poder de resolución de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda de la fuente luminosa y de la apertura numérica (propiedad óptica de la lente). Cualquier objeto cuyo diámetro sea menor que 0.1 mm es demasiado pequeño para poder ser observado a simple vista. La mayor utilidad del microscopio es la capacidad de ampliar el poder de resolución de la vista humana para objetos cuyo diámetro es menor que 0.1mm. Por tanto, un microscopio sirve fundamentalmente para dos cosas: primero provee aumento y, segundo, permite ver detalles de objetos tan pequeños que no podrían ser vistos normalmente. De esta forma, el poder de resolución es quizá la característica más importante de un buen microscopio ya que de nada sirve una imagen muy grande del objeto, si ésta se ve borrosa y no pueden distinguirse sus detalles. Finalmente, se conoce como distancia de trabajo a la distancia comprendida entre los objetos en observación y el lente frontal del objetivo. Es inversamente proporcional al aumento; es decir, cuanto mayor sea el aumento del lente objetivo menor será la distancia de trabajo. El siguiente cuadro muestra las distancia de trabajo para cada objetivo, en el microscopio disponible en el laboratorio. Objetivo 4X 10X 40X 100X Distancia de Trabajo (mm) Las preparaciones biológicas que se van a estudiar al microscopio se colocan sobre una lámina de vidrio llamada portaobjetos. Los portaobjetos están hechos de vidrio de borosilicato o silicato y generalmente se utilizan junto con un vidrio pequeño y muy delgado llamado cubreobjetos, el cual mantiene la preparación fija y la protege de movimientos inadvertidos, al mismo tiempo que previene el contacto de la preparación con los objetivos. Para obtener una imagen clara y nítida es importante que tanto el portaobjeto como el cubreobjeto estén limpios y secos. Para limpiar el portaobjeto, tómelo con los dedos por los bordes, frótelo con un pañuelo limpio y seco o con una toalla absorbente. Los cubreobjetos son muy frágiles y deben ser tratados con mucho cuidado. Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrir a: A. Preparación seca: para éste tipo de preparación, se requiere de una sección muy delgada de la muestra que se coloca en el centro del portaobjeto. En caso de tener una muestra opaca, es importante obtener cortes muy delgados de la preparación. B. Preparación húmeda. Se coloca la muestra en una suspensión (generalmente agua, glicerina, agua salada o aceite de inmersión). Para observar la muestra al microscopio, se coloca una gota la suspensión en el portaobjeto, se posiciona el cubreobjeto formando un ángulo con el portaobjeto y lentamente se cubre la preparación, evitando la formación de burbujas. portaobjeto cubreobjeto C. Preparación fijada. Se coloca una suspensión homogénea de la muestra en una gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos). Frecuentemente una vez fijada la preparación, se utilizan distintas técnicas de tinción para aumentar el contraste en la imagen microscópica Las muestras que se observan al microscopio deben tener suficiente contraste para discriminar entre los diferentes componentes celulares o tisulares. A diferencia de los tejidos de origen vegetal, los tejidos animales son en su gran mayoría incoloros excepto aquellos que poseen algún tipo de pigmento. En las plantas, sin embargo, existe una mayor variedad de pigmentos naturales (clorofila, carotenos, suspension con la muestra

4 antocianinas, etc.) que, sumado a la presencia de una pared celular, facilita la delimitación celular y la discriminación entre diferentes tejidos. En la mayor parte de los casos, el contraste de la muestra se obtiene artificialmente mediante el uso de reacciones de tinción cuyo objetivo sea aumentar el contraste de las estructuras biológicas para facilitar su observación e identificación, según la afinidad que tengan para determinados colorantes. TINCIONES Un colorante es una sustancia que se adhiere por afinidad a un tipo celular o a una parte específica de la muestra. La coloración resultante aumenta el contraste de la imagen al microscopio, permitiendo realizar un análisis más detallado de la muestra. Las técnicas de tinción se basan en la afinidad diferencial de los colorantes a los distintos organismos o a sus componentes celulares Los colorantes pueden aplicarse a organismos vivos (colorantes vitales) si el tinte no altera la estructura o vitalidad del organismos estudiado; o pueden utilizarse una vez la muestra ha sido previamente tratada con fijadores. Los colorantes pueden ser de 3 tipos: catiónico (azul de metileno, cristal violeta, azul de toluidina o safranina) los cuales pueden penetrar al interior celular; distintos tipos; aniónico (eosina, azul de anilina) los cuales tiñen el contorno celular al no tener la capacidad de atravesar la membrana (son repelidos por la carga negativa del citoplasma), y liposolubles (negro Sudán) los cuales reconocen los componentes lipídicos de la membrana. Las tinciones pueden ser: A. Simples. es una técnica que se basa en la utilización de un solo colorante con afinidad diferencial al tipo o componente celular (no al medio) y consiste en sumergir la muestra (fijada o no) en el colorante, seguido por un proceso de lavado previo a su observación al microscopio. En algunos casos es necesario utilizar un compuesto químico adicional que reacciona con el colorante para formar un precipitado insoluble pero coloreado. Es una técnica muy útil para estudiar la morfología celular o la naturaleza de su contenido. B. Diferenciales. esta técnica utiliza dos o más colorantes. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción. Al igual que la tinción simple, la tinción diferencial es muy útil en estudios de morfología celular pero adicionalmente, provee información acerca de la composición (grosor) de la membrana celular. Un ejemplo muy conocido de esta técnica es la tinción de Gram. C. Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej.; tinción con hematoxilina.- eosina (el primer colorante tiñe el núcleo de una célula fijada, por ser catiónico y el segundo tiñe el citoplasma, por ser aniónico). Entre los colorantes o tintes más comúnmente utilizados en microscopía podemos mencionar:

5 Marrón Bismarck - Marrón Bismarck, le imparte un color amarillo a las mucinas ácidas en tejido vivo. Carmín es un colorante de un intenso color rojo que puede ser utilizado como sal de litio para teñir glicógeno, mientras que las sales de alumbre-carmín son colorantes que se adhieren al núcleo. Las tinciones con carmín requieren del uso de un mordiente, que usualmente es aluminio o alumbre. Azul Coomassie - conocido como azul brillante, es un colorante que tiñe en forma no específica a todas las proteínas con un fuerte color azul. Se utiliza frecuentemente para teñir las corridas de proteínas en las electroforesis en gel. Cristal de Violeta - al ser combinado con un mordiente adecuado, tiñe las paredes celulares de color púrpura. El cristal violeta es un componente importante en la coloración de Gram. Eosina - se utiliza más frecuentemente como contracoloración de la hematoxilina, impartiendo un color que va del rosado al rojo al material citoplasmático, membrana celular, y algunas estructuras extracelulares. Bromuro de Etidio - se intercala en el ADN y le otorga un color rojo naranja fluorescente, utilizado para detectar células en apoptosis o muerte celular. Fucsina - utilizada para colorear colágeno, músculo liso o mitocondrias. Forma parte de la coloración tricrómica de Mallory donde se utiliza para colorear núcleo y citoplasma. Hematoxilina es un colorante nuclear. Utilizado con un mordiente, la hematoxilina tiñe a los núcleos celulares de color azul violeta a negro. Iodo usado como indicador de almidón. Lugol o Lugol yoduro (IKI) es una solución de color marrón que se torna azul oscuro en presencia de almidones y puede ser utilizada para colorear células. Azul de Metileno - se utiliza para teñir células animales, para hacer más visibles sus núcleos. Es también utilizado para teñir los extendidos de sangre para ser utilizados en citología. Azul Nilo - tiñe a los núcleos de color azul en células vivas. Sudan - se utiliza para destacar la presencia de lípidos en la muestra Rodamina - es una tinción fluorescente específica para proteínas utilizada comúnmente en microscopía fluorescente. Safranina - es un colorante nuclear. Colorea los núcleos celulares de rojo, y se utiliza principalmente como contracoloración. También puede ser utilizada para darle una coloración amarilla al colágeno. Azul de Toluidina - en suspensión presenta un color azul y cuando se expone a estructuras ricas en enlaces amínicos (cromatina) tomando un color rojo. III. Procedimiento en el laboratorio. Durante esta sesión de laboratorio se realizarán cinco ejercicios que le permitirán adquirir habilidades y destrezas necesarias para trabajar con un microscopio de luz compuesto. Para ello, cada subgrupo realizará y analizará los 5 experimentos, siguiendo las indicaciones de su instructor. Al finalizar los experimentos, se hará una discusión de los resultados obtenidos. Cada subgrupo debe estar preparado para discutir sus resultados. Esta práctica tiene como objetivo principal, el desarrollar destrezas y habilidades en los participantes del curso. Por lo tanto, no se requiere el diseño de hipótesis y predicciones; únicamente, seguir detenidamente las indicaciones de su instructor y asistente.

6 Este ejercicio lo realizarán simultáneamente con el instructor al inicio del laboratorio. A. Método de trabajo y cuidados del microscopio. 1. Con la ayuda del instructor/asistente el estudiante identificará cada componente del microscopio y el estereoscopio y hará una descripción de sus funciones. Rotule los esquemas que se presentan en el reporte. 2. Coloque el microscopio sobre la mesa de trabajo. Cuando traslade el microscopio, hágalo sosteniéndolo con las dos manos, con la derecha sujete firmemente el brazo y posicione la mano izquierda bajo la base. Ejercicio 1 Los siguientes pasos deben ser seguidos en orden cada vez que utilice el microscopio a los largo del presente ciclo lectivo 1. Antes de usar el microscopio, observe si todas sus partes se encuentran limpias y en buen estado. Si el ocular y los objetivos se encuentran sucios, proceda a limpiarlos cuidadosamente, utilizando un papel de seda. No utilice cualquier tipo de papel o limpiador. Si aún después de haber limpiado los lentes permanecen sucios u opacos, consulte con el asistente, quien procederá a limpiarlos siguiendo el procedimiento descrito en el siguiente cuadro. Cualquier daño debe ser informado inmediatamente al instructor. Procedimiento de Limpieza Coloque los objetivos y/o oculares sobre una superficie libre de polvo (por ejemplo papel de aluminio). Los demás componentes ópticos que van a ser limpiados deben estar tan accesibles como sea posible. 1. Remueva todas las partículas de polvo sueltas con un ventilador o con aire a presión. 2. Remueva toda la suciedad soluble en agua con agua destilada. Si esto resulta insuficiente, repita usando una solución diluida de jabón líquido para manos. Remueva cualquier residuo remanente con un hisopo de algodón seco. 3. Para remover aceite, emplee inicialmente una solución de jabón líquido para manos. Si esto no produce un resultado satisfactorio, repita la limpieza usando un solvente (85% de solución de limpieza para piezas ópticas y %15 de isopropanol). 4. La grasa siempre debe ser removida usando un solvente. 5. La limpieza debe realizarse usando un movimiento en espiral desde el centro hacia el borde. Nunca limpie usando movimientos en zig-zag ya que esto solo va a extender la suciedad. Con superficies ópticas más grandes (por ejemplo lentes de tubo), el movimiento en espiral comienza inicialmente en el borde antes de desplazarse hacia el medio y solo entonces es seguido por un movimiento de limpieza desde el centro hacia el borde. Normalmente, se aconsejan, varias limpiezas en espiral. Se recomienda éter de petróleo puro volátil o solución de limpieza para piezas ópticas.

7 Limpie utilizando un movimiento en espiral. Nunca use un movimiento en zig-zag! 6. Limpieza de las superficies pintadas: Evite el uso de cualquier solvente orgánico (por ejemplo disolvente, xileno, éter, alcohol, etc.) para la limpieza de las superficies pintadas del instrumento. Estas superficies pueden limpiarse con un paño de microfibra apenas humedecido. 7. El polvo suelto y otras suciedades pueden removerse usando un cepillo de pelo suave el cual se emplee solo para este propósito. Manual del usuario. Olympus CX22 2. Encienda la luz y ajuste la intensidad 3. Ponga el objetivo de bajo poder (4x) en línea, haciendo girar el revólver suavemente hasta que el lente quede en posición de trabajo. Nunca mueva los objetivos haciendo presión en los objetivos, use el revólver. 4. Ponga la preparación a estudiar sobre la platina, asegurándose de que esté bien prensada y que no toque el lente frontal del objetivo. Mantenga seca la platina. 5. Examine el condensador en su microscopio y asegúrese que esté en una posición lo más cercano a la platina. 6. Verifique que la cantidad de luz regulada por el diafragma sea directamente proporcional al aumento utilizado. Mire por el lente ocular y ajuste el diafragma para que todo el campo óptico esté homogéneamente iluminado. 7. Una vez hecha la observación y antes de quitar la preparación, coloque el objetivo de bajo poder en posición de trabajo. 8. La luz debe permanecer apagada mientras el microscopio no está en uso. 9. Asegúrese que el microscopio esté limpio antes de entregarlo al concluir sus observaciones. R E C U E R D E! Siempre que monte o remueva laminillas de la platina, el lente objetivo colocado en posición vertical debe ser el de de 4x ó el de 10x. Los objetivos de 40x o 100x quedan muy cerca del portaobjeto, lo que aumenta grandemente la probabilidad de rayar el objetivo o romper el portaobjeto. B. Procedimiento para enfocar correctamente el microscopio 1. Antes de iniciar, verifique que el lente objetivo y la platina estén a una distancia lo más separado posible. Si no, utilice el macrométrico para separarlos. Recuerde iniciar la observación de la muestra con el objetivo 4X. 2. Ponga una lámina de prueba (cuadrado, letra, palabras, etc.) sobre la platina del microscopio, de tal manera que la porción del portaobjetos que contiene la muestra quede directamente sobre la abertura circular. Sujete el portaobjetos con las pinzas del carro. 3. Mientras observa por un lado del microscopio, mueva el macrométrico lentamente Observe el movimiento del sistema óptico o de la platina. cuando gire la perilla del macrométrico hacia delante o hacia atrás (algunos modelos de microscopios están construidos de tal forma que no es el tubo óptico el que se acciona con las perillas del enfoque, sino que es la platina). Anote hacia cuál dirección debe girar el macrométrico para acercar o alejar la platina (y el portaobjeto) de la preparación.

8 4. Sin dejar de mirar por un lado del microscopio, gire la perilla del macrométrico hasta que el lente objetivo de bajo poder esté lo más cercano posible al portaobjeto, sin romperlo. Hasta este punto, usted no ha utilizado los oculares para observar la preparación. 5. Mirando ahora por el ocular, accione lentamente la perilla del macrométrico en la dirección contraria (objetivo de aleja de la preparación). Gire el macrométrico hasta que aparezca claramente la imagen de las letras impresas en el campo óptico. 6. A partir de entonces, será el micrométrico el que se usará para apreciar los detalles y los planos de la preparación. Con la perilla del micrométrico ajuste suavemente el foco hasta obtener una imagen nítida de las letras. Nuevamente, anote hacia cual dirección debe girar el micrométrico para acercar la platina con el portaobjeto al objetivo con la cual se está trabajando. 7. Mueva el carro de tal forma que la preparación se mueva alejándose de usted y observe por el ocular. En qué dirección se observa el movimiento de la imagen? 8. Mueva ahora el carro de izquierda a derecha cuál es la dirección del movimiento de la imagen observada por el ocular. 9. Ajuste la distancia interpupilar. Si la luz es demasiado intense, ajuste el diafragma hasta que la intensidad de la luz se siente confortable. 10. Una vez que haya centrado y enfocado claramente la preparación con el objetivo de menor aumento (4X) rote el revolver hasta colocar el objetivo de mediano aumento (10X) en línea con la preparación. Cuando el lente está en la posición correcta, queda aprisionado por una pieza mecánica que sujeta el revólver al cuerpo del microscopio. 11. Utilize cuidadosamente el micrométrico hasta enfocar la preparación con este objetivo. 12. Repita los pasos 9 y 10 con el objetivo del alto poder (40x). 13. Cuando se observa con lentes de mayor aumento, es la iluminación igual, mayor o menor, que cuando se observa con el lente de bajo poder? Recuerde hacer los cambios y ajustes necesarios con el diafragma para obtener una iluminación óptima. 14. Complete las preguntas del ejercicio 1 del reporte C. Procedimiento para enfocar correctamente el estereoscopio El microscopio estereoscópico tiene dos lentes objetivos y posee una profundidad de foco mucho mayor que la del microscopio compuesto; ambas características le permiten producir imágenes tridimensionales. El poder de resolución y de aumento del estereoscopio son mucho menores que las del microscopio compuesto y por esta razón el estereoscopio se usa para estudiar objetos y especímenes relativamente grandes (razón por la cual también se le llama microscopio de disección). Las partes de este microscopio son prácticamente las mismas que las discutidas para el microscopio compuesto. En este ejercicio se aprenderá el uso correcto del estereoscopio. Siga la explicación dada por el Instructor/Asistente R E C U E R D E! En general el micrométrico no debe moverse más de 2 vueltas para obtener una imagen nítida. NUNCA DEBE GIRAR EL MACROMÉTRICO USANDO UN OBJETIVO DE ALTO PODER.

9 1. Escoja un espécimen. Puede ser una hoja, una flor o un insecto. 2. Ponga el espécimen en el campo de observación (platina). Si está húmedo colóquelo sobre una placa Petri o una laminilla. 3. Encienda y ajuste la fuente de luz. Algunos estereoscopios tienen la fuente de luz integrada mientras que otros la tienen aparte. Asegúrese de que la fuente de luz esté iluminando su espécimen. 4. Enfoque el objeto que desea ver y muévalo hacia arriba, hacia abajo y hacia los lados. Hacia dónde se mueve la imagen? Puede explicar estas observaciones? Ejercicio 2 Medidas microscópicas 1. Haga un dibujo en el reporte de la preparación (lámina con letra) utilizando un lente objetivo de bajo y alto aumento. 2. Haga un dibujo en el reporte de la preparación utilizando el lente de bajo aumento (4x) y el de alto aumento (40x). Para cada ilustración, reporte el aumento total (aumento del ocular x aumento del objetivo) Cuando observamos un objeto al microscopio su tamaño aparece tantas veces mayor cuantas veces sea el aumento del microscopio. Por ello para calcular el aumento real de lo que observamos al microscopio bastará dividir el tamaño aparente con que lo vemos por el aumento. La unidad de medición del microscopio es la micra o micrón (una milésima de un milímetro, mm) y se designa con la letra griega µ. En los laboratorios de investigación se utiliza el micrómetro para realizar las mediciones microscópicas. Supongamos que vemos un organismo al microscopio con un tamaño aparente de 0.4 mm, y que el aparato está equipado con un objetivo 20x y un ocular 10x (aumento=200), entonces, el tamaño real del organismo será: Tamaño real = tamaño aparente = 0,4 = 0,002 mm = 2,0µm. Aumento 200 En nuestro caso, por no poseer micrómetros, se puede conocer el tamaño real de la preparación considerando el tamaño del campo óptico, el cuál mide el área iluminada de observación a través de los oculares. El tamaño del campo óptico es inversamente proporcional al aumento total: Magnificación 40X 100X 400X Tamaño del campo visual

10 Para averiguar el tamaño aproximado del campo óptico, realice los siguientes pasos: 1. Colocar en la platina una lámina preparada con cuadriculado. 2. Utilizando el objetivo de bajo poder (BP), mida el tamaño del campo visual haciendo coincidir una de las líneas del papel milimetrado con el borde del campo visual. campo óptico papel milimetrado Esto da la medida del diámetro del campo visual (D BP ) para éste aumento (AMP BP ) 3. Para calcular el diámetro del campo visual en aumentos mayores (D AP ), hay que recordar que cuanto mayor sea el aumento, el campo visual será proporcionalmente menor, es decir D AP = D BP * AMP BP / AMP AP 4. Una vez calculado el campo visual, se puede obtener el tamaño aproximado del objeto observado dividiendo el valor del diámetro del campo visual entre el número de veces que el objeto cabe en ese campo. Por ejemplo, si se observa el siguiente espécimen con una magnificación total de 500X y el diámetro del campo óptico es de 360 µm, es posible estimar que: 1.- Aproximadamente 4 especímenes de igual longitud cubrirían el campo óptico en sentido horizontal, y 2.- Aproximadamente ~10 especímenes del mismo grosor, cubrirían el campo óptico en sentido vertical En éste caso, se estima que el tamaño de éste espécimen es de 90 µm de longitud y 36: µm de ancho 5. Determine el tamaño del campo óptico para cada uno de los aumentos restante. 6. Examine una lámina preparada que le entregará el instructor y estime la longitud y grosor de la preparación. Poder de resolución y distancia de trabajo Ejercicio 3 La distancia de trabajo es la distancia precisa entre el objetivo y la muestra donde se obtiene un enfoque correcto Debido a que cada objetivo varía en longitud, la distancia de trabajo será diferente al cambiar de un objetivo al siguiente.

11 La distancia de trabajo de un objetivo esta grabada en el barril del objetivo junto con otras especificaciones. La distancia de trabajo se hace más pequeña con el poder de aumento del objetivo.en general, la distancia de trabajo se hace más pequeña conforme la apertura numérica. incrementa. El límite de resolución de un instrumento óptico define la mínima distancia que debe existir entre dos objetos muy cercanos a partir del cual pueden ser discriminados como puntos diferentes. El poder de resolución de un microscopio depende de la longitud de onda de la luz y de una propiedad de las lentes conocidas como la apertura numérica (AN). AN a su vez depende del índice de refracción del medio que llena el espacio entre el objeto y la parte frontal del objetivo, y del ángulo que forman los rayos de luz más oblicuos que puedan entrar al objetivo. Al igual que la distancia de trabajo, AN está indicada siempre en la parte frontal de la lente. El límite del poder de resolución de un microscopio es aproximadamente igual a 0.61/AN que para un microscopio óptico es de alrededor de 200 nm (nanómetros). Siguiendo los pasos anteriores, utilice la lámina que tiene un trocito de papel con puntos, cuente el número de puntos presentes en los tres poderes del microscopio; note las diferencias. Haga dibujos esquemáticos. Este ejercicio es un ejemplo del poder de resolución del microscopio. Ejercicio 4 Preparación del material de estudio.- Tinción simple En este ejercicio utilizaremos la técnica de tinción selectiva para observar las células de la raíz de cebolla (Allium cepa). PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 1. Examine una lámina preparada de un corte longitudinal de la raíz de cebolla usando un objetivo de bajo poder, o un esquema rotulado donde se muestren las partes de la raíz. Complete el diagrama incluido en el reporte. 2. Localice e identifique cada una de las regiones de crecimiento Encuentre la región con la punta más redondeada e identifique la cápsula (caliptra). Inmediatamente superior a esta región se encuentra el meristemo radical. 3. Una vez que se haya familiarizado con la organización estructural de la raíz, proceda a hacer una preparación de meristemo radical de cebolla 4. Su instructor le va a entregar un par de raíces ya tratada con el fijador Carnoy (mezcla etanol: ácido acético glacial en magnificación AN distancia de trabajo lente de inmersión

12 proporciones de 3:1). 5. Lave la preparación 1-3 veces con etanol al 70% (frío) para eliminar residuos de ácido acético (la presencia de ácido acético reduce la habilidad del colorante de marcar cromosomas). 6. Lave 3 veces el meristemo (agregue 3 gotas de dh 2 O, séquelas con papel de filtro). 7. Sobre un portaobjetos, coloque las raíces y haga un corte hasta que tenga sólo 2 mm de la punta (meristemo radicular) y descarte el resto. 8. Coloque las raíces en un beaker pequeño y añada 2 ml de HCl 18%. Coloque el beaker con el ácido y las raíces en baño María por 6-7 minutos. 9. Transfiera las raíces a un portaobjetos. Enjuague la preparación utilizando agua destilada y un gotero. Seque las raíces utilizando papel absorbente sin tocarlas. Enjuague 3 veces más la muestra. 10. Macere la preparación utilizando alfileres, la muestra debe estar suave y romperse con facilidad. 11. Coloree el tejido con azul de toluidina al 0,5% por 2 minutos. Coloque un cubreobjetos y remueva el exceso de colorante utilizando papel absorbente. Nota: invierta la preparación sobre un papel de filtro y apriete el cubreobjetos contra el portaobjetos para eliminar el exceso de tinción sobre el meristemo (no permita que el cubreobjetos se mueva). 12. Observe las células al microscopio. Utilice la siguiente figura para identificar las distintas fases de la división celular (mitosis)

13 Mitosis en células de la punta de la raiz de Lilium regale. a)interfase, b) Profase temprana, c) Profase tardía, d) Metafase, e)anafase,f) Telofase. (De J. McLeish y B. Noad, Looking at chromosomes. Copyright Macmillan.) 13. Haga un esquema en su reporte de las células de las fases observadas. PARA FINALIZAR EL EXPERIMENTO 1. Limpie el área de trabajo. 2. Recoja todos los materiales utilizados y regréselos a su sitio original 3. Verifique que los oculares y objetivos estén limpios. Ejercicio 5 Preparación del material de estudio.- Tinción diferencial En este ejercicio utilizaremos la técnica de Tinción de Gram como un ejemplo de tinción diferencial. Este ejercicio lo realizarán simultáneamente con el instructor. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL FIJACIÓN 1. En un portaobjetos colocar una gota de agua destilada 2. Con un asa previamente esterilizada con la llama del mechero, coloque sobre la gota de agua una pequeña cantidad de cultivo de bacterias disponible. 3. Dispersar el material con el asa sobre la gota de agua. 4. Pasar rápida y varias veces el portaobjetos sobre la llama. No deje el portaobjetos sobre la llama porque se puede quebrar. 5. Dejar enfriar. COLORACIÓN. Este paso debe ser realizado con mucho cuidado y sobre una bandeja para evitar manchar el mesón de trabajo con colorante 6. Después de enfriar, colocar una o dos gotas de Cristal de Violeta (violeta genciana) sobre la preparación en el portaobjetos y déjelo 2-3 minutos. 7. Después de este tiempo decantar el colorante cuidadosamente sobre papel absorbente. 8. Lavar rápidamente el portaobjetos con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. En este punto, todas las células se observarán de color púrpura MORDIENTE 9. Poner una-o dos gotas de solución Lugol sobre la preparación y dejar por un minuto. 10. Decantar el exceso de Lugol y lavar con agua destilada DECOLORACIÓN. Este paso es muy importante ya que si se aplica demasiado alcohol, seguido de un lavado extenso del tinte, producirá una coloración final muy débil. 11. Lavar con alcohol-acetona hasta eliminar el color violeta. 12. Las bacterias Gram + permanecerán púrpura y las Gram no retendrán ninguna coloración. 13. Lavar rápidamente con agua destilada. TINCIÓN DIFERENCIAL 14. Coloque una gota de safranina y déjelo por 30 segundos.

14 15. Decante el exceso de tintura y lávelo rápidamente con agua destilada. 16. Deje secar la preparación al aire o cuidadosamente con un papel. La tinción diferencial colorea tanto las Gram como Gram +. Sin embargo, la presencia de la coloración púrpura en las gram + no se altera por la presencia de safranina Aplicación de Aplicación de Decoloración Coloración con Violeta de Genciana Ioduro (alcohol-acetona) Safranina 17. Cuando la preparación esté completamente seca, observe al microscopio siguiendo el procedimiento correcto 18. Haga un dibujo de sus observaciones, e identifique las bacteris Gram+ y Gram-. Utilice lápices de colores, para representar su observaciones. NO USE CUBREOBJETOS. 19. En caso de ser necesario, añada una gota de aceite de inmersión y observarla al microscopio con el objetivo de inmersión (100 x). PARA FINALIZAR EL EXPERIMENTO 1. Limpie el área de trabajo. 2. Recoja todos los materiales utilizados y regréselos a su sitio original 3. Verifique que los oculares y objetivos estén limpios.