NUEVO MÉTODO DE PCR ANIDADA EN TIEMPO REAL CON EVAGREEN PARA DETERMINAR LA CARGA DE PAPILOMAVIRUS

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1 NUEVO MÉTODO DE PCR ANIDADA EN TIEMPO REAL CON EVAGREEN PARA DETERMINAR LA CARGA DE PAPILOMAVIRUS Socorro Hernández-Arteaga, Mireya Sánchez-Garza, Rubén López-Revilla División de Biología Molecular, IPICYT, San Luis Potosí, SLP. Correo electrónico: RESUMEN El cáncer cervicouterino (CaCu) es la primera causa de muerte por cáncer en las mujeres mexicanas. Su desarrollo requiere infección por virus del papiloma humano (VPH). Los virus asociados al CaCu son de alto riesgo, como los tipos 16 y 18. La amplificación de DNA viral mediante la reacción de polimerización en cadena (PCR) permite diagnosticar la infección por VPH y tiene valor predictivo del riesgo de desarrollar CaCu. La PCR en tiempo real (PCR-TR) permite determinar la carga viral (i.e., cuantificar el número de copias de los genes blanco). La PCR-TR con SYBRGreen es la técnica más usada para la investigación y el diagnóstico rutinario. El propósito de este trabajo fue desarrollar un método de PCR-TR más sensible para determinar la carga viral de VPH16 empleando EvaGreen como fluorocromo. SiHa, línea celular derivada de un CaCu invasor, contiene una copia del genoma de VPH16 por célula, pone a prueba la sensibilidad de los métodos de detección. Para aumentar la sensibilidad desarrollamos un método de PCR anidada en el cual preamplificamos un producto de la región E6/E7 de VPH16 de 645 pb por PCR convencional y en la segunda reacción anidada (en tiempo real) amplificamos un producto de 249 pb empleando EvaGreen. Cuantificamos la carga viral de muestras problema por interpolación con los valores del ciclo umbral (Ct) de mezclas con copias de phv101 (plásmido con un inserto E6/E7-VPH16 de 645 pb). Detectamos las dos copias esperadas de VPH16 por célula SiHa y determinamos el número de copias en las muestras cervicales con grado conocido de displasia. Nuestro método, más sensible y barato que el de SYBRGreen, disminuiría los costos para determinar la carga viral y contribuiría al estudio de la epidemiología molecular de la infección del cérvix por VPH. Palabras clave: Cáncer cervicouterino, PCR en tiempo real, Virus del papiloma humano INTRODUCCIÓN El cáncer cervicouterino (CaCu) es la segunda causa de muerte por cáncer entre las mujeres de todo el mundo y la primera en los países en desarrollo incluyendo a México. La falta de acceso oportuno al diagnóstico y tratamiento es la razón de su alta prevalencia principalmente en mujeres pobres, de baja escolaridad, que habitan en las áreas rurales y en las zonas marginadas de las ciudades. En México hubo alrededor de 13,400 muertes por cáncer cervicouterino en el año 2002 por lo cual cada hora y media murió una mujer mexicana por este mal. El desarrollo de las lesiones precancerosas y cancerosas está asociado a la infección por virus del papiloma humano (VPH), trasmitidos a las mujeres por contacto sexual genital con hombres infectados. Algunos virus causan verrugas o condilomas (lesiones benignas que no progresan al cáncer, usualmente causadas por los tipos 6 y

2 11), mientras que otros provocan la transformación neoplásica de las células del epitelio del cuello uterino y por eso son llamados oncogénicos o de alto riesgo. Se ha demostrado la presencia de genes de VPH de alto riesgo en el 99.7% de los casos de CaCu invasor, por lo cual se acepta que los VPH de alto riesgo son el principal factor necesario para el desarrollo del CaCu. Los virus de alto riesgo más frecuentes son los tipos 16, 18 y 31. El diagnóstico citológico de la infección por papilomavirus se realiza con el método de Papanicolaou, que puede tener fallas por deficiencias en la calidad de las muestras, baja sensibilidad (44-88%), y una alta proporción de falsos negativos (10-54%). Actualmente hay diversos métodos moleculares más sensibles y específicos que complementan al Papanicolaou para diagnosticar la infección por papilomavirus. La PCR en tiempo real (PCR-TR) permite la cuantificación de secuencias nucleotídicas definidas. La intensidad creciente de la fluorescencia del producto de amplificación en función del número de ciclos de polimerización permite extrapolar el valor del ciclo umbral (Ct), el cual es inversamente proporcional al número de las secuencias blanco presentes en las muestras control (i.e., con un número conocido de copias de la secuencia blanco) y problema. La PCR-TR que emplea al SYBRGreen como flurorocromo es la técnica más empleada actualmente para la investigación y el diagnóstico rutinario. En este trabajo hemos desarrollado un método alternativo de PCR-TR más sensible y barato para la cuantificación de la carga viral de VPH16 en muestras de raspados cervicales con un nuevo fluorocromo llamado EvaGreen. MÉTODOS Oligonucleótidos. Utilizamos dos parejas de oligonucleótidos para la detección de VPH de alto riesgo (Fujinaga et al. 1991). La primera (LCR/E7AS) genera un producto E6/E7 de 645 pb que abarca del del nucleótido (nt) 26 al 671 en el genoma de HPV16. La segunda pareja (pu1m/pu2r) genera un producto de 249 pb incluido en la secuencia del primero que abarca del nt 419 al 668. Control con número de copias conocido. Amplificamos el producto E6/E7 de 645 pb a partir de un plásmido con la misma secuencia clonada en el vector phv101 derivado de pgem, para contar con un control con un número conocido de copias. Considerando el tamaño de la construcción calculamos que en 10 ng de phv101 hay copias del fragmento clonado. Fluorocromos. EvaGreen y SYBRGreen a concentración final 1. El volumen total de las mezclas de PCR fue de 50 µl con el kit de Invitrogen (No. Cat ). Las concentraciones finales de cada componente fueron MgCl 2 3 mm; oligonucleótidos 0.15 µm; dntps 0.05 mm; Taq DNA polimerasa 30 mu/ml. Como DNA molde utilizamos copias de phv101. El programa de amplificación en el Icycler (BioRad) fue de 50 ciclos, con desnaturalización a 95 C por 15 seg, annealing a 58 C por 1 min y extensión a 72 C por 1 min. Preamplificación. Usamos cinco tipos de mezclas: 1) con copias de phv101, 2) control negativo sin DNA (blanco), 3) control positivo con 50 ng de DNA de células SiHa, 4) control negativo con 50 ng de DNA de sangre humana normal y 5)

3 muestras problema de raspados cervicales con displasia por VPH16, las cuales fueron sometidas a 10 ciclos de PCR convencional utilizando la pareja de oligonucleótidos E6/E7 de 645 pb y el programa descrito. PCR anidada en tiempo real con EvaGreen usando como molde el producto preamplificado. Preparamos las mezclas de PCR agregando 1 µl de la mezcla preamplificada, EvaGreen y la pareja de oligonucleótidos interna de 249 pb. Para obtener la familia de curvas control con un número de copias conocido empleamos diluciones logarítmicas a partir de la mezcla de phv101 preamplificada para contar con estándares de a copias. Los controles y las muestras problema preamplificadas también sirvieron de molde para la PCR en tiempo real. Incluimos como control negativo una muestra del DNA de SiHa preamplificada que contenía sólo el oligonucleótido F de la pareja de 249 pb. RESULTADOS Sensibilidad. En mezclas para la amplificación de E6/E7 645 pb con copias iniciales de phv101 obtuvimos dos familias de curvas consistentes y proporcionales con EvaGreen y SYBRGreen. Para la curva con copias iniciales, el valor de Ct (ciclo umbral) con EvaGreen fue mientras que para SYBRGreen fue Para mezclas con copias la curva no permitió obtener el valor de Ct con SYBRGreen mientras que con EvaGreen el valor de Ct fue y fue conservada la proporcionalidad y la consistencia con el resto de los los valores de la familia de curvas (Tabla1). Copias de phv101 Valores de Ct SYBRGreen EvaGreen Amplificación nula Tabla 1. EvaGreen es 10 veces más sensible que SYBRGreen PCR anidada en tiempo real con EvaGreen. Los valores de Ct y Ct (diferencia entre los valores de Ct vecinos que para diluciones logarítmicas teóricamente debe ser 3.3) obtenidos en tiempo real fueron consistentes en cada una de las curvas obtenidas con diferente número de copias iniciales de phv101 y de muestras problema. El coeficiente de correlación lineal obtenido con los valores del logaritmo del número de copias vs el valor de Ct fue de y el valor de la pendiente de la recta construida con los valores de Ct de la familia de curvas de phv101 fue La interpolación de los valores de Ct obtenidos con el control positivo con DNA de células SiHa permitió detectar 1 copia de genoma viral por célula; en este experimento también calculamos por interpolación la carga viral de las muestras problema. Especificidad. Para analizar la especificidad de los productos de amplificación analizamos la extinción térmica de la fluorescencia en las mezclas con diferentes números de copias de phv101 y de cada muestra problema. Encontramos patrón con un pico con extinción máxima de la fluorescencia a 85.5 C en todas las muestras con phv101, en el control positivo con DNA de SiHa y en todas las muestras problema, pero no en la

4 muestra con un solo oligonucleótido (Fig. 1). Fig. 1. El patrón de extinción de fluorescencia coincide para el producto principal de phv101, SiHa y las muestras problema. Valor máximo de extinción = 85.5 C. Correlación de la carga viral con el grado de displasia. Hicimos un análisis preliminar de 10 muestras con infección única por VPH16 tipificadas previamente en nuestro laboratorio que mostró una correlación directa de la carga viral con el grado de displasia (Fig. 2). Figura 2. Correlación de la carga viral con el grado de displasia del cérvix. Clave de las muestras con lesiones displásicas: 1, NIC1; 2, NIC2; 3, NIC3; 4, CaCu invasor. CONCLUSIONES 1. El uso de EvaGreen hace a nuestro método de PCR en tiempo real más sensible y barato e igualmente específico y reproducible que el de SYBRGreen. 2. Hasta donde sabemos, nuestro método de PCR anidada en tiempo real con EvaGreen es el primero que se ha desarrollado. 3. Con este método logramos detectar una copia del genoma de VPH16 por célula y confirmamos que la carga viral correlaciona con el grado de displasia cervical. REFERENCIAS 1. Fujinaga Y, Shimada M, Okasawa K, Fukushima M, Kato I, Fujinaga K. Simultaneous detection and typing of genital human papillomavirus using the polymerase chain reaction. J Gen Virol 72: , Lewis, MJ. Análisis de la situación del cáncer cervicouterino en América Latina y el Caribe. Organización Panamericana de la Salud. Washington

5 3. Muñoz N, Bosch X, De Sanjosé S, Vergara A, del Moral A, Munoz MT, Tafur L, Gili M,Izarzugaza I, Viladiu P. Risk factor for cervical intraepithelial neoplasia grade III/ carcinoma in situ in Spain and Colombia. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2: , Walboomers J, Jacobs M, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 189:12-19, Zur Hausen H. Papillomavirus in human cancers. Mol Carcinog 1: , 1