vinos mediante el uso de levaduras." Ivan Ciklic y Mariana Combina

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José Luis del Río Lara
hace 8 años
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1 "Reducción del nivel de alcohol en vinos mediante el uso de levaduras." Ivan Ciklic y Mariana Combina Instituto t Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) EEA Mendoza

2 Resumen de la presentación 1) Importancia de Saccharomyces cerevisiae Tradición Biotecnología Organismo Modelo 2) Problema abordado, objetivos e hipotesis de trabajo 3) Carecterísticas del factor de transcripción PDC2 y la enzima piruvato decarboxilasa 4) Desarrollo del proyecto Antecedentes Resultados y Metodologías 5) Proyección a futuro y otros proyectos relacionados

Carecterísticas del factor de transcripción PDC2 y la enzima piruvato decarboxilasa 4)

3 Importancia de Saccharomyces cerevisiae Biotecnología Tradicional Uso extensivo en la industria debido a su larga historia en la producción De bebidas alcoholicas y en panaderías Biotecnología Mejoramiento génetico de levaduras para uso industrial. Producción de enzimas y otros compuestos quimicos en Farmaceutica

bebidas alcoholicas y en panaderías Biotecnología Mejoramiento génetico de

4 Importancia de Saccharomyces cerevisiae Organismo modelo Eucariota unicelular con todas las características típicas (e.g. organelas, regulación del ciclo celular, envejecimiento, apoptosis) Microorganismo o con tiempos breves es de generaión e (1,5 h), alta densidad (10 8 cel/ml) y eleveda proporción superficie/volumen Génetica Mendeliana (ciclo de vida sexual, análisis de tetradas) Gran eficiencia de recombinación homologa Primer organismo eucariota en contar con la secuencia completa del genoma (1996) Colección de cepas delecionadas para cada uno de los 6000 genes

organelas, regulación del ciclo celular, envejecimiento, apoptosis) Microorganismo o con tiempos breves es de generaión e (1,5 h), alta

5 Problema abordado y objetivos del proyecto Problema Vinos con alta concentración de alcohol, indeseable para el Mercado de exportación Causas _ Uvas cosechadas con madurez azucarina muy avanzada _ Veranos cálidos con un aumento en la incidencia solar Objetivo general Obtener una cepa nativa modificada genéticamente que posea una Obtener una cepa nativa modificada genéticamente que posea una leve ineficiencia en la producción de etanol, conservando además todas las características deseables para la fermentación

Objetivo general Obtener una cepa nativa modificada genéticamente que posea una Obtener una cepa nativa modificada genéticamente

6 Hipotesis de trabajo PDC2 pdc2 Mutagénesis Selección Reducción de regulación positiva de PDC1 y PDC5 Reducción nivel de expresión de PDC1 y PDC5 PDC2 = factor de transcripción que regula positivamente la expresión de las piruvato decarboxilasas PDC1 y PDC5 PDC1 y PDC5 = Dos isoformas de la piruvato decarboxilasa que cataliza la conversión de piruvato en acetaldehído Redución en la producción de etanol

la expresión de las piruvato decarboxilasas PDC1 y PDC5 PDC1 y PDC5 = Dos isoformas de la piruvato

7 Metabolismo anaerobico de glucosa en S. cerevisiae y disponibilidad de NADH/NAD + 0 ado de D. Kutina et al., 2010 Adapta

8 Factor de transcripción PDC2 Proteína de 925 amino acidos con un peso molecular de 104 KDa Se localiza en el núcleo y posee un sitio de unión a ADN de la familia CENP-B Regulador positivo de las dos principales isoformas de piruvato decarboxilasas PDC1 y PDC5 También Regulador positivo de genes involucrados en la síntesis de Tiamina difosfato, cofactor de Pdcs y Pdhs La deleción pdc2 presenta severas reducciones en la producción de etanol (hasta un 30%) y también en los niveles de expresión de PDC1 y PDC5

PDC5 También Regulador positivo de genes involucrados en la síntesis de Tiamina difosfato, cofactor de Pdcs y Pdhs La deleción

9 Piruvato decarboxilasa Cataliza la reacción: Piruvato CO 2 Acetaldehído Activa en forma de tetramero, requiere Mg 2+ y Tiamina difosfatof como coenzimas Expresión génica activada por el factor de transcripción PDC2 Existen al menos tres isoformas en S. cerevisiae

Tiamina difosfatof como coenzimas Expresión génica activada por

10 Piruvato decarboxilasa 3 isoformas con elevada homología Pdc1p La forma principal Muy activa en presencia de glucosa Sin represión por tiamina Pdc5p Forma secundaria Indetectable en presencia de glucosa Represión por tiamina Activa en mutantes pdc1 Pdc6p Forma minoritaria Normalmente ausente en catabolismo de glucosa Participa en ahorro de azufre en respuesta a metales pesados

presencia de glucosa Represión por tiamina Activa en mutantes pdc1 Pdc6p Forma minoritaria

11 Mutagénesis de PDC2 y reducción de la producción de etanol Nevoigt y Stahl 1996 Deleción pdc2 Proyecto Actual Mutagenesis de PDC2 Reducción actividad de Pdc - 80% 1 Selección: mutantes pdc2 con actividad Pdc reducida Reducción etanol - 30% 2 Selección: mutantes pdc2 con etanol reducido Fermentación a escala piloto con mutantes seleccionados

Selección: mutantes pdc2 con actividad Pdc reducida Reducción etanol - 30% 2

12 Proyecto actual vs. estrategias anteriores para reducir niveles de etanol Proyecto actual Ventajas asociadas Mutagénesis de PDC2 y selección de variantes mutantes apropiadas -Variabilidad genética intraespecie. -Mutación integrada establemente en el genoma. -Efectos moderados sobre el metabolismo. Estrategia y autores Desventajas asociadas Deleción del gen PDC2 (Nevoigt y Stahl 1996) Sobreexpresión de genes GPD1/2 de la vía de glicerol (Remize et al., 1999; Lopes Barros et al., 2000; Eglinton et al.,2002) Sobreexpresión del gen de la La glucosa oxidasa de A. Niger (Malherbe et al., 2003) -Causa un severo efecto en el metabolismo del Etanol con reducciones de hasta un 30 %. -Los mutantes no pueden crecer en glucosa -Aumento en la producción de acidoacético, a consecuencia del desequilibrio redox. -Problemas asociados con plásmidos de multicopia: número variable de copias p/célula, es necesario mantener una presión selectiva -Problemas asociados al uso de plásmidos de multicopia. -Producto transgénico, poca aceptación por la industria y consumidores

-Mutación integrada establemente en el genoma. -Efectos moderados sobre el metabolismo.

13 Construcción de biblioteca de mutantes amp lacz&apos 8000 PDC bps 6000 Clonación de PDC2 en plásmido centromérico YCplac111 LEU2 ARS lacz&apos CEN4 amp PDC2 LEU2 ARS1 CEN4 Amplificación y mutagénesis aleatoria con RCA YCplac111-PDC2 S. cerevisiae BYpdc2 Transformación de la cepa receptora S. cerevisiae i BYpdc2 (S. Hohmann, Suecia)

PDC2 LEU2 ARS1 CEN4 Amplificación y mutagénesis aleatoria con RCA YCplac111-PDC2 S.

14 Amplificación mediante PCR de PDC ADN λ 3,530 kb 2,934 kb 2,027 kb 1-5 = Amplificados de PDC2 con primers

15 a ADN λ Clonación de PDC2 en el plasmido centromerico YCplac C ADN λ 9 kb 9 kb b C = Control YCplac111 digerido SalI-BamHI 6,1 Kb = Minipreps ligación PDC2-YCplac111 digeridos SalI-BamHI Kb kb 1-5 = clon = clon 15

digerido SalI-BamHI 6,1 Kb 1-1717 = Minipreps ligación PDC2-YCplac111

16 Transformación y complementación en la cepa pdc2 YEPD Sintético - Leu YEP 3% etanol Transformantes y cepas control pdc2-pifc01 pdc2 BY4741-pIFC01 BY4741

17 Curva de crecimiento complementación pdc2 vs tipo salvaje BY4741 a 10 b 10 Y pdc2 = e r R 2 = Log (O OD 600) Y By4741 = 0.177e r R 2 = Tiempo (h) = pdc2-pifc01 = By4741-pIFC01 r pdc2 = 0,3865 r By4741 = 0,3907

1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 10 Y By4741 = 0.177e 0.3907r R 2 = 0.998 1 0.

18 Mutagénesis aleatoria de PDC2 Método de mutagénesis aleatoria mediante Rolling Circle Amplification (RCA) Por que? Amplificación de ADN a partir de ADN circular, se generan copias lineales en tandem del ADN molde. Estas pueden usarse directamente para transformar S. cerevisiae o E. coli, sin necesidad de pasos previos de restricción o ligación. La reacción transcurre a temperatura constante por lo que no se requiere de equipos termocicladores. Tampoco se necesitan primers específicos. Manipulando la concentración de MnCl se obtienen librerías de mutantes con una Manipulando la concentración de MnCl 2 se obtienen librerías de mutantes con una frecuencia de mutación de 3-4 por kilo base de ADN plasmídico.

coli, sin necesidad de pasos previos de restricción o ligación. La reacción transcurre a temperatura constante por lo que no se requiere de equipos termocicladores.

19 Mutagénesis aleatoria mediante error prone RCA y construcción de la librería de mutantes pdc2 1 y 11 = λ HIndIII 2 = PUC = RCA 1/ = RCA 1/ = RCA 1/ = RCA 1/ pifc01 amp PDC2 Amplificación y mutagénesis aleatoria con RCA LEU2 ARS1 CEN4 pifc01 Transformación de la cepa receptora S. cerevisiae pdc2 (S. Hohmann, Suecia) S. cerevisiae pdc2 211 mutantes

9 10 11 pifc01 amp PDC2 Amplificación y mutagénesis aleatoria con RCA LEU2 ARS1 CEN4 pifc01

20 Secuenciación y calculo de la tasa de mutación N muestras secuenciadas N mutaciones N mutaciones por muestra Tasa de mutación Concetra ación MnC l ,125 0,043/Kb 1,5 mm 6 3 0,5 0,17/Kb 2 mm ,34/Kb

muestra Tasa de mutación Concetra ación MnC l 2 0 8

21 Planeamiento de tres etapas de selección fenotípica para el aislamiento de la variante pdc2 deseada Transformates elegidos al azar mutantes seleccionados 2 etapa Curvas de de crecimiento en en medio selectivo Leu con glucosa como como fuente de carbono Selección de mutantes con con actividad enzimática PDC entre entre % menor que el el control Fermentaciones de mosto sintetico a escala a de laboratorio y y cuantificación del etanol Selección de transformantes con tasas de crecimiento menores a las del control pdc2 -pifc01 Preparación de extractos crudos y determinación de la actividad enzimática de PDC Selección de mutantes con tasas de producción entre 5-20 % menor que el control mutantes seleccionados 1 etapa fenotipo deseado 3 etapa

22 Integración de subclones de PDC2 en el genoma de la cepa nativa INTA MZA Variantes mutantes de PDC2 preseleccionadas Variantes mutantes de PDC2 preseleccionadas amp PDC2 LEU2 CEN4 ARS1 amp PDC2 LEU2 CEN4 ARS1 Recombinación ió homologa amp PDC2 LEU2 CEN4 ARS1 Serie de cruzamientos Cepa de laboratorio BYpdc2 Cepa Nativa INTA MZA Ensayos de fermentación a escala Ensayos de fermentación a escala de laboratorio y eventualmente a escala piloto

23 Proyección a Futuro y otros proyectos relacionados Continuar desarrollando la aplicación de la igeniería génetica de levaduras en otros aspectos importantes para la industría del vino Identificar nuevos problemas y aspectos de la elaboración regional de vino susceptibles de mejora mediante el mejoramiento genético de levaduras Desarrollar nuevas estrategias específicas para construir una cepa con potencial para la aplicación en el contexto de la producción de bio-etanol a partir de desechos de la industria vitivinícola Actualmente se ha comenzado a trabajar en un nuevo proyecto con la levadura contaminante Brettanomyces con miras a desarrollar un método efectivo para el tratamiento de barricas contaminadas

24 Agradecimientos A Mariana Combina y a todo el grupo de Microbiología Enologica del INTA Mendoza y a todos los compañeros de la experimental que colaboran para un buen clima de trabajo

25 Material adicional: Glucolisis y vía del glicerol l

26 Material adicional: Glucólisis y el desvío de la piruvato dehidrogenasa

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