TÉCNICAS DE SEPARACIÓN. CROMATOGRAFÍA
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- Susana de la Cruz Ramírez
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1 TÉCNICAS DE SEPARACIÓN. CROMATOGRAFÍA 1. Introducción Cromatografía y métodos de separación clásicos. Separación de componentes de una muestra. No son técnicas de caracterización propiamente dicha Las propiedades de los materiales dependen de los componentes y de la proporción existente entre ellos No dan información de la naturaleza de los componentes, necesitan otros métodos de análisis Cromatografía y ciencia de materiales Separación de compuestos relacionados con la síntesis de materiales Evaluación de la actividad de materiales catalizadores y soportes sólidos en síntesis orgánica. Desarrollo de nuevos materiales empleados en cromatografía Seguimiento de una síntesis
2 2. Lugar que ocupa la cromatografía en la caracterización de materiales Muestra NO Hay que solubilizarla? SI Es volátil? NO Descompone térmicamente? GAS NO Forma plasma? SI SI SI NO Otros métodos SI Es soluble? NO Digestión SI SI DISOLUCIÓN Hay que separar componentes? SI Cromatografía SI Hay que separar componentes? NO NO Técnicas y Métodos de análisis
3 3. La cromatografía. Conceptos y definiciones Cromatografía: método físico de separación Proceso cromatográfico Fase estacionaria (sólido, gel o líquido). Lecho cromatográfico o sorbente Fase ligada Fase inmovilizada Fase móvil (gas portador, eluyente) Cromatografía líquida Cormatografía de gases Cromatografía con fluido supercrítico Eluir Efluente Muestra Componentes Zona o banda Cromatograma Cromatógrafo
4 3.1. Mecanismos de separación a) Separación por adsorción (cromatografía de adsorción) Diferente afinidad de los componentes de la muestra sobre la superficie de un sólido activo (componentes con polaridad baja o media) b) Separación por reparto (cromatografía de reparto) Diferente solublidad en fases estacionaria y móvil (Componentes con polaridad media o alta) Coeficiente de Reparto = K d = [ A] Fase móvil [ A] Fase Estacionaria
5 3.1. Mecanismos de separación c) Separación por tamaño molecular (Cromatografía de permeación de gel, de tamiz molecular o de exclusión por tamaños). Parámetros de columna Intervalo de trabajo: intervalo de M que pueden ser separados Límite de exclusión: M mínimo a partir del cual las macromoléculas no experimentan retención. Moléculas pequeñas Flujo del disolvente Moléculas grandes Partícula polimérica (gel) con poros Pared de columna cromatográfica Disolvente Las moléculas pequeñas penetran en los poros de las partículas de gel, por lo que necesitan más tiempo para salir al final de la columna. Las moléculas grandes, en cambio, al no penetrar en las partículas de gel se mueven con el disolvente a una velocidad mayor de elución y salen antes de la columna. Por tanto, a mayor masa molecular menor tiempo de elución. Este método permite separar por tamaños moleculares siendo posible obtener incluso distribuciones de masas moleculares a distintos tiempos de elución.
6 3.1. Mecanismos de separación Flujo del disolvente d) Separación por Intercambio iónico La separación se basa principalmente en la diferente afinidad para el intercambio de iones de los componentes de la muestra. Especies positivas Especies negativas Partículas sólidas (matriz) cargada positivamente Pared de columna cromatográfica Disolvente Las especies cargadas negativamente se unen a la matriz sólida cargada positivamente y son retenidas, mientras que las especies positivas son rechazadas. De esta manera en función de la carga las especies se eluyen a distintos tiempos dando lugar a la correspondiente separación. La elución de las especies retenidas se consigue cambiando el ph del disolvente hasta igualarlo a su punto isoeléctrico o hasta invertir su carga neta. Una separación puede estar basada en la conjunción de diversos mecanismos
7 3.2. Métodos de análisis cromatográfico a) Análisis por desarrollo (cromatografía en papel o capa fina) b) Análisis por elución (cromatografía de gases, cromatografía líquida) c) Análisis frontal d) Análisis por desplazamiento
8 ANÁLISIS POR DESARROLLO Cromatografía plana Cromatografía en columna Fase móvil Fase Móvil
9 Análisis por elución Muestra Fase Móvil Cromatograma Sorbente Volumen de fase móvil Placa Porosa Efluente
10 Fase Móvil Con la muestra ABC Análisis frontal Cromatograma ABC AB A A A B A B C Placa Porosa Volumen de fase móvil Efluente
11 3.3. Clasificación de acuerdo con la forma del lecho cromatográfico a) Cromatografía en columna Columna empaquetada Columna tubular abierta b) Cromatografía plana (o de lecho abierto) Cromatografía en papel Cromatografía en capa fina (TLC)
12 3.4. Clasificación de acuerdo con el estado físico de la fase móvil a) Técnicas cromatográficas GLC GSC LLC LSC b) Cromatografía de gases (siempre en columna) c) Cromatografía Líquida (en columna o sobre plano) Cromatografía Líquida de Alta Eficacia o de Alta Presión, HPLC d) Cromatografía con fluido supercrítico
13 3.5. Técnicas especiales a) Cromatografía con fase invertida b) Cromatografía con fase normal c) Análisis isocrático (composición F. móvil constante) d) Elución con gradiente (Composición F. móvil cambia de forma continua) e) Elución en etapas o escalonada (Composición F. móvil cambia de forma escalonada) f) Cromatografía bidimensional (etapas adicionales de separación)
14 3.6. Parámetros básicos en cromatografía a) Retención = capacidad real de la fase estacionaria para retardar la salida de un componente. si caudal constante v t t M = tiempo muerto t R = tiempo de retención t R = tiempo de retención corregido = t R t M Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993.
15 3.6. Parámetros básicos en cromatografía b) Factor de capacidad (retención de un compuesto con independencia del caudal) t K' = ' t R M = M M c) Dispersión de bandas t R t t Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., Parámetros característicos de un pico gaussiano
16 3.6. Parámetros básicos en cromatografía d) Eficacia Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., Número de platos teóricos n tr = σ 2 n t R = 16 Wb 2 t R n = Wh Altura equivalente de un plato teórico = L/n (Para comparar columnas de diferente longitud) 2 Debe evitarse el ensanchamiento de bandas. Dependen de características de columna, velocidad de fase móvil, etc.
17 3.6. Parámetros básicos en cromatografía e) Separación y resolución Retención relativa Resolución R s α = = W t' t' b1 R2 R1 2 t W b2 Sistema cromatográfico Eficacia de columna Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993.
18 4. Técnicas cromatográficas no instrumentales 4.1. Cromatografía en columna El gradiente de presión necesario para el desplazamiento de la fase móvil a través de la fase estacionaria se origina por gravedad. Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993.
19 4.2. Cromatografía en capa fina La elución se consigue por el movimiento capilar ascendente de la fase móvil a) aplicaciones analíticas R f = y x R x = y x Aplicación Aplicación y x y x x Sustancia patrón Frente del disolvente Frente del disolvente b) aplicaciones preparativas
20 5. Métodos instrumentales en cromatografía 5.1. Cromatografía de gases (GasLíquido) Distribución de un componente entre una fase móvil gaseosa y una líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte. Componentes básicos Gas portador según detector (He, Ar, N 2, CO 2, H 2 ) Sistema de inyección de muestra Columnas Control de caudal Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., Medidor de caudal
21 5. Técnicas instrumentales en cromatografía 5.1. Cromatografía de gases (GasLíquido) Mejora de un cromatograma por programación de temperatura en columna Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993.
22 5.1. Cromatografía de gases (GasLíquido) Detectores CARACTERÍSTICAS DEL DETECTOR IDEAL Adecuada sensibilidad Buena estabilidad y reproducibilidad Una respuesta lineal para los componentes que se extienda a varios órdenes de magnitud Intervalo térmico de trabajo (25 400)ºC Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal Alta fiabilidad y manejo sencillo Respuesta semejante para todos los componentes No destructivo
23 5.1. Cromatografía de gases (Gas Líquido) Detectores DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA Componente H 2 /aire encendido eléctrico iones e Diferencia de potencial entre extremo de quemador y electrodo colector (se mide la corriente que pasa a su través) Iones producidos nº átomos de carbono sensible a masa Efluente de la columna Aire COH; C=O; X; NH 2 generan pocos iones H 2 Insensible a: H 2 O; CO 2 ; SO 2 y NO x Detector de los más utilizados para el análisis de compuestos orgánicos
24 5.1. Cromatografía de gases (GasLíquido) Detectores DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD TÉRMICA Cambios de conductividad térmica del gas portador por la presencia de analito. Sensor = hilo de Pt, Au ó W calentado (a potencia eléctrica cte) cuya T depende del gas circundante (su R cambia) Características: * Simple * Amplio rango dinámico lineal (~ 10 5 ) * Respuesta universal (especies orgánicas e inorgánicas) * Carácter no destructivo * Sensibilidad relativamente baja (~ 10 8 g de soluto/ml de gas portador)
25 5.1. Cromatografía de gases (GasLíquido) Detectores DETECTOR TERMOIÓNICO Detector selectivo de compuestos orgánicos con P y N. Efluente H 2 llama gas caliente bola de silicato de rubidio caliente (a 180V respecto colector) Iones Plasma ( ºC)
26 5.1. Cromatografía de gases (GasLíquido) Detectores DETECTOR DE CAPTURA DE ELECTRONES Detector selectivo de halógenos, peróxidos, quinonas y grupos nitro. Efluente emisor β iones (gas portador) ráfaga de electrones Corriente constante que varía en presencia de moléculas capturadoras de e DETECTOR DE EMISIÓN ATÓMICA plasma de He que atomiza y excita el efluente espectros de emisión
27 5.1. Cromatografía de gases (GasLíquido) Métodos acoplados GC/Espectrometría de masas GC/espectroscopía IR 5.2. Cromatografía de gases (GasSólido) H 2 S; CS 2 ; NO x ; CO; CO 2 ; gases nobles (no se retienen en columnas Gas/Líquido)
28 5. Técnicas instrumentales en cromatografía 5.3. Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) Alta sensibilidad Adaptación a determinaciones cuantitativas Separación de especies no volátiles Separación de especies termolábiles
29 5.3. Cromatografía de líquidos de alta resolución Instrumentación para la cromatografía de líquidos Recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento de disolventes (eliminación de O 2 y N 2 ) Filtración de disolventes Sistemas de bombeo Sistemas de inyección de muestra Columnas Precolumnas Termostatos Detectores: i) responden a propiedad de fase móvil; ii) responden a propiedad del soluto.
30 5.3. Cromatografía de líquidos de alta resolución Instrumentación para la cromatografía de líquidos Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993.
31 6. Bibliografía D.A. Skoog, J.J. Leary, Análisis Instrumental, McGrawHill, Madrid (1996) H.H. Willard, L.L. Merritt Jr.,J.A. Dean, F.A. Settle Jr., Métodos Instrumentales de análisis, Grupo Editorial Iberoamericana S.A. de C.V., México (1991). TECHNIQUES in liquid chromatography Simpson, Colin F. John Wiley & Sons (1984). Liquid chromatography column theory Scott, Raymond P.W. John Wiley & Sons (1992). Chromatography of polymers : characterization by SEC and FFF American Chemical Society (1993). Handbook of size exclusion chromatography Marcel Dekker (1995). Cromatografía de exclusión por tamaños [Vídeo] Pérez Dorado, Angel, CEMAV, Universidad Nacional de Educación a Distancia (1997). Manual de cromatografía Loro Ferrer, Juan Francisco Gobierno de Canarias, Dirección General de Universidades e Investigación (2001). 7. Direcciones URL útiles main.htm
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