CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (SEC)
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- Eva Coronel Domínguez
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1 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (SEC) PORATH Cromatografía Filtración Gel - GFC - Disolvente - agua - Muestras Solubles en agua-biopolímeros - Empaque - Suave, Gel Hidrofílica (Sephadex) MOORE Cromatografía Permeación en Gel - GPC - Disolventes - THF, Decalina, Tolueno - Muestras Polímeros Orgánicos - Empaque Poliestireno entrecruzado (Styragel) GFC, GPC IDÉNTICO MECANISMO HPLC 7 10/96 1
2 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (SEC) SEC caracterización de polímeros (PM 1000 a 1 millón) Resinas orgánicas (GPC) o bio-moléculas (GFC)---cadenas de moléculas pequeñas Las cadenas de distintos largos y formas Se puede calcular el peso molecular y su distribución HPLC 7 10/96 2
3 COMPARACIONES GPC vs LSC o Fase Reversa GPC separa moléculas basada en su tamaño en disolución Tamaño en disolución depende de PM y otros factores (disolvente, temperatura, etc.) La moléculas más grandes eluyen primero las más pequeñas al final HPLC 7 10/96 3
4 VENTAJAS DE SEC Trabaja con altos PM y tiene tiempos de corrida cortos Tiempos de separación y orden de elución fácilmente predecibles No existen pérdidas o reacciónes en la columna Desarrollo de métodos relativamente simple, sin gradientes HPLC 7 10/96 4
5 GPC DE GOMA DE MASCAR GPC CHICLE Ablandador Sabor Estabilizador COMPONENTES HPLC 7 10/96 5
6 PROBLEMAS EN SEC Limitada capacidad de pico (baja resolución) No puede resolver compuestos de tamaño similar (isómeros) Se requiere de una diferente estrategia de optimización Debe poder disolver al polímero HPLC 7 10/96 6
7 MECANISMO DE SEPARACIÓN Las moléculas más pequeñas penetran en los poros más pequeños y se retienen más Las moléculas mayores son EXCLUIDAS La separación en función del VOLUMEN HIDRODINÁMICO y no el PM HPLC 7 10/96 7
8 CROMATOGRAMA DE EXCLUSIÓN V 0 V R Respuesta del detector Volumen muerto grande. Inyección Volumen interno pequeño Volumen de elución [ml] HPLC 7 10/96 8
9 CURVA DE CALIBRACIÓN 6 EXCLUSIÓN TOTAL. PERMEACIÓN SELECTIVA log PM PERMEACIÓN V o V i TOTAL Volumen de elución [ml] HPLC 7 10/96 9
10 CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA VARIAS COLUMNAS PS-DVB 10 7 POLYSTYRENE MOLECULAR WEIGHT Å 10 5 Å 10 4 Å 1000 Å MIXED BED 500 Å 100 Å 50 Å ELUTION VOLUME [min per 30 cm] HPLC 7 10/96 10
11 DESARROLLO DE MÉTODOS Seleccione un buen disolvente (consulte la literatura) Escoja el tamaño de poro adecuado Corra estándares; desarrolle una curva de calibración Inyecte una disolución diluída (~1%) HPLC 7 10/96 11
12 DISOLVENTES PARA GPC Deben disolver al polímero Compatible con el empaque y detector Baja viscosidad Toxicidad, costo, punto de ebullición SOLVENT Viscosity UV cutoff [20 C, cp] [nm] BP [ C] Flash Pt. [ C] Toxicity THF Slight m-cresol Moderat Toluene Moderat Dichloromethane None Severe Synder and Kirkland, Introduction To Modern Liquid Chromatography, 2nd ed., (1979) HPLC 7 10/96 12
13 PAPEL DE LA FASE MÓVIL DISOLVENTE A: DISOLVENTE B: Polímero completamente solvatado Sin solvatar HPLC 7 10/96 13
14 SELECCIONANDO COLUMNAS GPC PORES SIZES MW RANGE (polystyrene) 50 Å < 1, Å < 4, Å x Å x Å 4 x x Å 4 x x Å 4 x x10 7 Mixed Bed HPLC 7 10/96 14
15 REQUERIMIENTOS DE HARDWARE BOMBA un control preciso de flujo, esencial INYECTOR mejor automuestreador (10-100µl) COLUMNA empaque estable (no cambie disolventes), control de temperatura DETECCIÓN No-destructivo (trabajo prep.), amplio intervalo lineal OBTENCIÓN DE DATOS - computarizado, cálculos automáticos de Mn, Mw, etc. HPLC 7 10/96 15
16 PREPARACIÓN DE MUESTRA Seleccione un buen disolvente, caliente si es necesario Prepare una disolución diluída (~1%) PM<10K ~1% PM>1Millón ~0.01% Siempre filtre ( No guarda-columnas!) HPLC 7 10/96 16
17 DETECTORES PARA SEC ÍNDICE DE REFRACCIÓN: UV/VISIBLE: Respuesta universal Sensibilidad moderada Mala temp. y estabilidad de flujo Buena estabilidad, muchos polímeros no tienen cromóforos LASER DE LUZ DISPERSA DE ÁNGULO BAJO: da valores para (LALLS) resultados de PM ABSOLUTO, ya que se mide el volumen hidrodinámico M n, M w VISCOMETRÍA DIFERENCIAL: Volumen hidrodinámico = Útil para calibración universal, da M n, M w viscosidad intrínseca Visc. M n DETECTORES EVAPORATIVOS DE MASA: Universal, da masa, igual respuesta HPLC 7 10/96 17
18 APLICACIONES DE GPC Separaciones de polímeros de alto peso molecular Caracterización de polímeros: M n,m w,m z, polidispersión Limpieza de muestra: Remueve materiales de alto PM HPLC 7 10/96 18
19 APLICACIONES DE GPC CONTROL DE CALIDAD RÁPIDO 6 Buen polímero 5 log PM. 4 Mal polímero Volumen de elución [ml] HPLC 7 10/96 19
20 SEPARACIÓN DE ADITIVOS DE POLÍMEROS Muestra: 1. Irganox DSTDP 3. Irganox Estearamide 5. Desconocido 6. Tinuvin BHT Columna: G2000 H8 7.5 mm ID x 60 cm x 2 Eluente: Tetrahidrofurano Flujo: 1.6 ml/min CaidaPresión:54kg/cm 2 Detector: RI Temp.: Ambiente Tiempo de elución [min] HPLC 7 10/96 20
21 GPC DE ALTA RESOLUCIÓN C36 C32 C28 MUESTRA: n-parafinas COLUMNA: SHODEX a-802 x 4, 2m ELUENTE: THF FLUJO: 1 ml/min PRESIÓN: 48 kg/cm 2 DETECTOR: IR C22 C20 C18 C24 C16 C13 C12 C14 C11 C9 C min HPLC 7 10/96 21
22 PROPIEDADES FÍSICAS Número PM promedio cristalinidad, flujo, compresión Peso PM promedio fuerza (tensil, impacto) resistencia z PM promedio elongación, flexibilidad Z+1 PM promedio die swell HPLC 7 10/96 22
23 VARIABLES DE SEPARACIÓN SEC : TEMPERATURA, CARGA DE MUESTRA A. Incremente la Temperatura para mejorar: - Solubilidad de la muestra - Eficiencia de la columna - Tiempo de corrida (menores debidos a flujos altos, menor viscosidad) - Carga de muestra (solubilidad incrementada) B. Tamaño de muestra: Limitada por la viscosidad - Cerca de 15 mg max para columnas de 25 x 0.8 cm; V R y HETP se degradan a valores mayores Intervalo PM Concentración Max [%wt./vol.] a 20K K a 200K K a 2,000K 0.05 Synder and Kirkland, Introduction To Modern Liquid Chromatography., (1979) p. 507 HPLC 7 10/96 23
24 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN RESUMEN DOS TIPOS: GFC - Biopolímeros Acuosos en Geles Hidrofílicos GPC - Polímeros Orgánicos en Poliestireno MECANISMO Separación por tamaño (PM) CURVA DE CALIBRACIÓN Correlaciona PM y Volumen de Elución DISOLVENTE Debe disolver al polímero HPLC 7 10/96 24
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