Bioquímica - Cromatografía 1 Bioquímica Separación de biomoléculas

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1 Bioquímica Cromatografía 1 Bioquímica Separación de biomoléculas Métodos cromatográficos Los métodos cromatográficos son aquellos en que los diferentes componentes de una mezcla de biomoléculas se separan al interaccionar diferencialmente con una matriz porosa inmóvil dentro de una columna. El medio móvil (solvente) puede ser líquido o gaseoso, dependiendo de la técnica, y puede ser de composición constante o variable. La nomenclatura básica no ha cambiado desde los primeros intentos hechos ya hace casi un siglo por Tswett: se denomina columna cromatográfica al tubo en que se realiza la corrida, eluente al líquido o gas usado como medio móvil y cromatograma al resultado del análisis cromatográfico. La cromatografía se emplea con fines analíticos, en microescala, o preparativos, ya sea en procesos industriales o de laboratorio, para purificar diversas sustancias: proteínas, ácidos nucleicos, medicamentos, etc. Las columnas son tubos de vidrio, metal o plástico, dependiendo de la técnica empleada, de diámetro constante y preferentemente de un material biocompatible, es decir que no cambie la función biológica del material en estudio ni interaccione con el eluente. Las interacciones que dan lugar a la separación se dan sobre la matriz o soporte y pueden ser de diversa naturaleza. sí se tiene la cromatografía de intercambio iónico, de interacción hidrofóbica, de filtración o exclusión molecular, de afinidad, etc. Dependiendo de las necesidades de Bomba resolución, diferentes técnicas pueden ser empleadas para la Figura 1 cromatografía, tales como HPLC (High Columna performance liquid chromatography, FPLC Solvente (fast protein liquid chromatography), en que varían la presión a la que se administra la cme Corp. fase móvil, la constitución de las Detector columnas, las características de los solventes y en general la precisión con que se miden los diferentes parámetros de una cromatografía. Figura 1. Configuración básica para una cromatografía Colector de fracciones Diferentes tipos de matrices Se utilizan matrices, o soportes, muy variados. Sobre la matriz se van a dar las interacciones que resultan en la separación. Estas matrices entonces llevan los grupos químicos encargados de tal interacción o bien su estructura ya posee alguna propiedad intrínseca que permite separar biomoléculas. El término resina se reserva para las que poseen cierto grado de hidrofobicidad, como poliestireno. 1

2 Bioquímica Cromatografía 2 Un soporte muy común es la celulosa, fácilmente hidratable pero que no permite elevados flujos debido a su compresibilidad. Está compuesto de fibras de celulosa purificadas. demás de su compresibilidad, este soporte no es compatible con algunos solventes orgánicos ni álcalis, que hidrolizan la celulosa. De gran uso son las matrices derivadas de dextranos, de polisacáridos diversos que pueden ser mezclados con otros sustancias para dar diferentes características a la matriz. Se presentas como microesferas porosas con diferentes tamaños de partícula y poro. Figura 2. Partículas de Sepharosa Ejemplos de éstas son la Sepharose y el Sephadex. La primera está compuesta por agarosa, un polímero lineal de residuos alternados de DGal y 3,6 anhidrolgal. La agarosa es un componente del agar, junto a la agaropectina. La agarosa forma geles debido a la multiplicidad de puentes H y es un excelente medio debido a su biocompatibilidad. La técnica de fabricación permite que se formen partículas esféricas, cuentas de collar, de tamaño más o menos uniforme y alta porosidad. El Sephadex, por su parte, es un dextrano entrecruzado. Todos los dextranos son susceptibles a valores extremos de ph, en especial en el lado alcalino de la escala. Esto se debe a la labilidad de los enlaces glucosídicos a la hidrólisis alcalina. El Sephacryl se prepara por entrecruzamiento covalente de alildextrano con N,N'metilenbisacrilamida, dando un gel rígido con resistencia a la compresión. El BioGel es un polímero de acrilamida que es especialmente resistente a valores extremos de ph. Cuando se requieren velocidades de flujo y presiones elevadas se utilizan matrices más rígidas, constituidas por polímeros sintéticos o sílica. Especialmente en soportes para intercambio iónico se usa poliestireno entrecruzado con divinilbenceno, que forma una estructura tridimensional grande de forma esférica. Separación en base al tamaño. Cromatografía de exclusión molecular (CEM) Las biomoléculas de diferente naturaleza y tamaño pueden separarse en base a su tamaño en columnas de filtración molecular o filtración en gel. Esta técnica se basa en las propiedades separativas de partículas esféricas, porosas, de diámetro pequeño y más o menos constante. Las biomoléculas que pasan a través de estos geles tienen a su disposición caminos de diferente longitud de acuerdo con su tamaño. sí, las moléculas pequeñas capaces de penetrar los poros de la matriz se verán retardadas en comparación con aquellas de mayor tamaño, que son excluidas del interior de Fase móvil Moléculas pequeñas: difusión libre en la fase estacionaria Figura 2 Moléculas medianas: difusión en una fracción limitada del soporte Moléculas grandes: exclusión de fase estacionaria Dirección de flujo Figura 3. Cromatografía de exclusión molecular 2

3 Bioquímica Cromatografía 3 la partícula y por lo tanto verán su tránsito a través de la columna acelerado. El tamaño mínimo que debe poseer una molécula para incluirse, entrar a los poros, se denomina límite de exclusión. P.ej. un límite de exclusión de 10 6 significa que moléculas con tamaño mayor a 10 6 kda no serán incluidas. Esta técnica separa no solamente moléculas muy grandes de moléculas muy pequeñas, como en el ejemplo anterior, sino que además permite la separación de moléculas con tamaños parecidos. Esta última característica hace que uno pueda calibrar una columna con patrones de tamaño (peso molecular) conocido, los cuales eluirán siempre en la misma forma, y luego utilizar esta información para construir una curva de calibración. La cromatografía se realiza sembrando la muestra y eluyendo con un buffer de composición constante. 1 No se utiliza el volumen de elución Figura 4 directamente sino el coeficiente de partición, que es la relación: Kav=(VeVo)/(VtVo) bs Donde: Vo es el volumen vacío o de exclusión, el espacio que queda por fuera de las partículas del gel, el único disponible para las 0 macromoléculas que no se Vo Ve1 Ve2 incluyen en el gel. Ve es el volumen de elución de la macromolécula, medido en la altura máxima del pico (ver Fig. 4) Vt es el volumen total de la columna Kav tendrá un valor entre 0 y 1 e, idealmente, dará una línea recta con pendiente negativa. Las columnas usadas en cromatografía de exclusión molecular tienden a ser largas y angostas, de modo de maximizar el número de platos teóricos, una medida de su capacidad de resolución. Una limitación de esta técnica es que el volumen sembrado debe ser lo más pequeño posible para evitar la obtención de picos anchos, con lo que se pierde resolución. Para separaciones de biomoléculas o determinación de peso molecular se emplea un volumen de muestra no mayor del 10% del volumen de la columna. La técnica puede utilizarse para desalar macromoléculas, en cuyo caso puede sembrarse hasta un 20% del volumen. Masa molecular (kda) K av Figura 5 Separación en base a la carga Cromatografía de intercambio iónico (CIO) En este tipo de cromatografía, la matriz contiene un grupo cargado que puede interaccionar con la macromolécula en estudio de forma de unirse a ella por interacciones electrostáticas. 3

4 Bioquímica Cromatografía 4 Los grupos iónicos se hallan unidos en forma covalente a la matriz. Por ejemplo, una proteína con punto isoeléctrico menor a 7 o un ácido nucleico estarán cargados negativamente a ph 7.0. De esa manera, si se tiene una matriz con sustituyentes cargados positivamente, por ejemplo una amina cuaternaria, las macromoléculas se unirán a los sustituyentes con una fuerza proporcional a la carga que detenten al ph al que se realiza la corrida y al número y naturaleza de los sustituyentes presentes en la matriz. Dado que las proteínas son iones multivalentes, las resinas pueden ser de intercambio aniónico o catiónico, de acuerdo a la carga neta que posean. Dependiendo de la macromolécula en estudio se usará una u otra. Los más comunes son: dietil aminoetil (DEE) OCH 2 CH 2 N (C 2 H 5 ) 2 H (débil) pk>11 trimetil aminoetil (TME) OCH 2 CH 2 N (CH 3 ) 3 (fuerte) pk>13 dimetilaminoetil (DME) OCH 2 CH 2 N (CH 3 ) 2 (débil) pk~10 sulfometil OCH 2 SO 3 pk<1 (fuerte) sulfopropil OCH 2 CH 2 CH 2 SO 3 pk<1 (fuerte) carboximetil OCH 2 COO pk~4.5 Una característica importante de los medios de intercambio iónico es su capacidad, es decir la cantidad de macromoléculas que pueden unir por unidad de volumen de fase estacionaria, La capacidad se expresa en mg proteína/ml gel o meq/ml. La capacidad es mayor cuanto más sustituida esté la matriz, más fuerte sea la interacción con la macromolécula y mayor sea el tamaño de poro de la matriz. La elución puede realizarse de dos formas diferentes. La más usual consiste en aumentar progresivamente la concentración de un contraión, de modo de desplazar el equilibrio de unión de la macromolécula hacia la forma libre. El contraión es normalmente una sal (NaCl, KCl, etc.) disuelta en el eluente. 0DEE() Prot() 0DEEProt 0DEEProt Cl() 0DEECl Prot() Cromatografía de intercambio iónico Cargado de la columna Elución Fuerza iónica Figura 6 Interacción con la matriz cargada Lavado Las macromoléculas de una mezcla se irán desplazando en forma secuencial de acuerdo con la fuerza de la unión: las que posean menor densidad de carga eluirán antes, mientras que para las de mayor carga neta el tiempo de retención será mayor. En la Figura 6 se esquematiza el proceso para el caso, muy ideal por cierto, de que sólo una de las macromoléculas presente en la muestra se una a la matriz. Esto generalmente no es así, sobre todo al trabajar con mezclas complejas. La otra manera es realizar un cambio en el ph del solvente. Esta técnica se emplea con intercambiadores débiles. La lógica es que al cambiar el ph, de modo de acercarnos al pi de cada proteína, la carga neta de esta irá disminuyendo y en algún punto dejará de interaccionar con la matriz. Sin 4

5 Bioquímica Cromatografía 5 embargo, esta técnica posee sus desventajas. Dado que en este caso las proteínas eluirán a un ph igual a su pi, su solubilidad estará disminuida y pueden precipitar. demás, la proteína puede perder su actividad biológica a los valores de ph usados para establecer el gradiente. Es de uso muy restringido. El volumen que se puede cargar la columna no está restringido en la CIO. Por el contrario, usualmente esta es una etapa de concentración, al sembrarse grandes volúmenes y recuperar la muestra en volúmenes reducidos. Las matrices usadas para la CIO son diversas: Sepharosa (dextranos), acrilamida, celulosa, Figura 7. Cromatograma obtenido en una CIO de una mezcla de proteínas. Luego de la siembra se observa un pico de bsorbancia (la técnica de detección puede ser otra) que corresponde a la fracción de proteínas que no se unen a la matriz. Luego de lavar con el mismo buffer de siembra hasta eliminar aquello que no se une a la matriz, se comienza a elevar la fuerza iónica en el buffer y se observa la aparición de picos que corresponden a macromoléculas unidas. El primero es un pico doble que contiene al menos dos proteínas que eluyen a fuerzas iónicas parecidas. Sephadex, etc. Más recientemente se han agregado las matrices con tentáculos, prolongaciones de 15 a 20 monómeros a los cuales se une el grupo iónico. Estas matrices evitan el impedimento estérico que puede ofrecer el soporte para la unión de proteínas grandes y evitan otros fenómenos como los cambios locales de ph que ocurren en el interior de las partículas en otras matrices. l respecto, las resinas macroporosas, que poseen poros 10 a 100 veces mayores que los microporos de 1030 Å presentes en intercambiadores basados en geles de dextrano, facilitan el movimiento de los iones y macromoléculas, poseen mayor capacidad de unión de ligandos y velocidades de flujo elevadas.. 5

6 Bioquímica Cromatografía 6 Interacción hidrofóbica (CIH) Es una poderosa técnica separativa para el aislamiento de proteínas tanto en escala preparativa como analítica. Está técnica se basa en la interacción de Cromatografía de interacción hidrofóbica biomoléculas con grupos hidrofóbicos, ligandos, unidos a una matriz inerte. Los Interacción Cargado de la columna grupos unidos pueden ser fenil (fuerte), butil, con la matriz (alta fuerza iónica) propil (débiles), etc., que interaccionan favorablemente con res. de Leu, Ile, Val, Phe y otros que pueden estar presentes en la superficie de una proteina. unque la norma es que los res. hidrofóbicos se encuentren en el interior de la proteina, recientemente estudios de cristalografía han localizado parches hidrofóbicos superficiales, a menudo Elución Lavado relacionados con la función biológica de la proteína. En general, esta técnica consiste en Baja fuerza iónica, unir la biomolécula de interés a la matriz en un solvente apolar entorno altamente hidrofílico y con fuerza iónica elevada, por ejemplo en presencia de concentraciones molares de NaCl, (NH 4 ) 2 SO 4, KCl, etc., realizando la elución con una solución que contiene concentraciones Figura 8 progresivamente menores de la sal pero crecientes de algún cosolvente con cierto grado de hidrofobicidad, tal como glicerol, etilenglicol, etanol, etc. La unión entre la biomolécula y la resina se da a través de regiones hidrofóbicas expuestas. Estas regiones, al estar en contacto con un medio altamente polar como lo es una solución salina, producen una separación de fases con el medio, aumentando su energía libre y disminuyendo la entropía en ese entorno. sí, una forma de disminuir el contenido de energía libre del sistema es unir esas regiones a los centros hidrofóbicos de la resina. Las matrices usadas son diversas, Superose, Sepharose, Sephadex. Permite separaciones rápidas con buenos rendimientos en general, pero los medios cromatográficos usados deben tener características especiales. sí, una densidad demasiado elevada de grupos hidrofóbicos producirá rendimientos pobres debido a desnaturalización y a las condiciones extremas bs 280 nm Figura 9 % buffer B Fuerza iónica 6 Siembra y lavado Elución

7 Bioquímica Cromatografía 7 requeridas para la elución. cá también se usa la cromatografía de tentáculo. La Fig. 9 muestra el perfil de elución de una columna de interacción hidrofóbica en la que se incrementa el porcentaje del buffer B, conteniendo 20% de glicerol, lo que da como resultado la aparición de picos de proteína. Los últimos en aparecer corresponden a aquellas proteínas más hidrofóbicas. Nótese que el gradiente se inicia luego de un cierto período de lavado con el buffer inicial, con lo que se desprenden moléculas que no se unen a la matriz, y que en este caso la fuerza iónica disminuye. Cromatografía de afinidad La cromatografía de afinidad es muy usada en el laboratorio como herramienta analítica y preparativa. Se basa en la interacción de proteínas con ligandos unidos a la matriz de forma muy específica. En general se trata de análogos (sustancias estructuralmente muy parecidas) a ligandos que naturalmente interaccionan con la proteína, p.ej. el sustrato, inhibidor o cofactor de una enzima; el mensajero (hormona, neurotransmisor, toxina) en el caso de un receptor, aminoácidos (proteasas; ligandos pseudoespecíficos como pigmentos (Cibacron blue, dextran blue, etc.) que se parecen a nucleótidos usados como cofactores, o secuencias complementarias de un ácido nucleico que se desee aislar de una mezcla compleja. Se utilizan matrices diversas: Cargado de la columna Elución Cromatografía de afinidad Figura 10 Interacción con el ligando Lavado agarosa, dextranos, acrilamidas, etc., prefiriéndose aquellas con poros grandes de modo que posean un límite de exclusión elevado. La selección del ligando depende de dos factores. En primer lugar, el ligando debe poseer una elevada afinidad por la sustancia a ser purificada, pero la interacción debe ser reversible. En segundo término, debe ser posible unir el ligando a la matriz por algún medio sin que esto modifique sustancialmente su interacción con la macromolécula. La afinidad del ligando debería situarse entre 10 4 y 10 8 M en solución. finidades pobres (Ki > 10 4 M) son usualmente demasiado débiles para proveer una especificidad adecuada. Si la afinidad es grande (Ki < 10 8 M), va a ser muy difícil remover la macromolécula una vez unida sin desnaturalizar la muestra. El ligando interacciona mejor si está situado en el extremo de un brazo espaciador que lo aleje de la matriz, lo que evita impedimentos estéricos o de otro tipo relacionados con el tamaño o las propiedades de unión inespecíficas de la matriz. Los métodos de unión del ligando a la matriz son variados, e incluyen: ctivación por CNBr: permite la unión de ligandos que contengan grupos amino primarios (Fig. 10). ctivación epoxi: une a través de grupos hidroxilo 7

8 Bioquímica Cromatografía 8 ctivación por tioles: tiene un espaciador de glutatión que permite unir a través de grupos tioles Figura 11 NH La elución se puede realizar incrementando la concentración de sal en el medio de lavado, por la adición del ligando en forma soluble (más frecuente) o por cambios en el ph de la solución. Cromatografia de quelado de metales. OH OH CNBr RNH 2 OH O C NHR Derivado de tiourea Esta técnica explota la propiedad de muchas proteínas de unirse a metales fuertemente. P. ej. en el caso de enzimas que requieren un cofactor metálico para su unión. Se usan matrices que contienen grupos que pueden unir en forma no covalente pero muy fuertemente iones metálicos, como Zn o Co, a través de grupos especializados como moléculas de ác. iminodiacético (CH 2 N(CH 2 COOH) 2 ). menudo la interacción se produce a través de residuos de His presentes en la superficie de la macromolécula. Estos residuos pueden estar presentes naturalmente en la proteína o haber sido artificialmente introducidos por técnicas biología molecular en el caso de proteínas que han sido clonadas y expresadas en un sistema heterólogo. ctivación de la columna Elución Me Cromatografía de quelado Me Me Me Me Me Quelante de Me en el solvente Carga de la columna Me Me Me Figura 12 Me Me Me Lavado La técnica consiste en cargar la columna con el ión metálico, p.ej. una solución 1 M de Cl 2 Zn, luego equilibrar con el buffer, cargar la muestra, y luego eluir con una solución (o establecer un gradiente) de EDT, un quelante que secuestra el Zn y despega por tanto a la proteína. 8

9 Bioquímica Cromatografía 9 Otros En general uno puede generar columnas de prácticamente lo que desee debido a que se dispone de matrices activadas, p.ej. con grupos epoxi, a los que puede unirse una gran gama de ligandos. Un caso especial de cromatografía de alta especificidad lo constituye la unión de anticuerpos a matrices. Los anticuerpos se pueden inmovilizar mediante una variedad de técnicas, pero una de las más usadas es la unión a través de proteína agarosa. La proteína es una proteína bacteriana que se une con elevada afinidad al dominio Fc de la molécula de IgG. De esa manera, al pasar una solución de anticuerpos específicos contra una determinada macromolécula a través de una columna de proteína agarosa, estos quedarán inmovilizados y formarán un soporte con una Purificación de proteínas mediante proteína garosa Fc Fc muy elevada especificidad por la macromolécula en cuestión. De esta manera se pueden purificar proteínas con elevados rendimientos. En la Figura 12 se observa un esquema de este tipo de cromatografía. En el paso 1, se carga la columna con la solución de anticuerpos. Se hace pasar luego la mezcla de proteínas a separar, quedando unidas sólo las que son reconocidas por el anticuerpo (Paso 2). La elución se realiza de diversas maneras, por ejemplo sustituyendo el buffer en que se trabajó hasta el momento (por lo común cercano a ph 7), por 100 mm glicina ph 3.0. Por supuesto, la técnica puede ser usada para la purificación de anticuerpos de otras proteínas, por ejemplo para la purificación de IgG total de suero. La cromatografía de adsorción es muy usada. En esta las macromoléculas se unen por interacciones no necesariamente de alta especificidad pero con distinta fuerza de acuerdo con las propiedades particulares de la macromolécula. Ejemplos de matrices de este tipo son la fosfocelulosa (fosfato de celulosa) o la hidroxiapatita. 1 IgG 3 Figura 13 Fc Fc 2 Fc Fc Detección Las macromoléculas eluidas pueden detectarse por varios métodos: absorción en el UV o a la longitud de onda de absorción máxima si fueran coloreadas, por variaciones en el índice de refracción, la conductividad, etc. La Fig. 4 muestra un perfil de elución de una cromatografía de exclusión molecular en el cual la detección se realiza a 280 nm. Obviamente, este recurso puede utilizarse para proteínas que contengan residuos aromáticos. Los ácidos nucleicos 9

10 Bioquímica Cromatografía 10 pueden detectarse por absorción a 260 nm y las proteínas también a 254 nm (enlace peptídico). Los hidratos de carbono pueden detectarse haciendo uso de cambios en el índice de refracción. También pueden tomarse alícuotas de los tubos recogidos y hacer allí la determinación de la concentración de la macromolécula en cuestión ya sea por sus propiedades ópticas, por su actividad biológica (actividad enzimática) o por alguna reacción específica (p.ej. por Coomassie en caso de proteínas). Flujo del solvente Con respecto a este parámetro, la administración del solvente se puede realizar por gravedad o con bombas. El primer caso es posible sólo cuando el soporte es suficientemente laxo como para permitir el flujo sin necesidad de presión adicional. En este caso entran la mayoría de medios cromatográficos basados en Sephadex. En el segundo caso, pueden usarse equipos totalmente automatizados que permiten variar el flujo en forma muy controlada y realizar automáticamente los gradientes. La velocidad de flujo está en estrecha relación con la resolución de la técnica, de modo que este punto se amplía en el siguiente apartado. Técnicas cromatográficas de alta resolución. HPLC y FPLC. En general, se pretende que las corridas duren el menor tiempo posible para minimizar la pérdida de actividad biológica, pero sin sacrificar la resolución del método. La distribución de las macromoléculas en una columna durante la elución hace que se detecten a su salida de la columna como picos, caracterizados por su altura y su anchura. Lo ideal es que cada pico sea tan angosto como sea posible, para separarlo de sustancias que eluyan en la vecindad. En la Fig. 14 se observa una separación completa de los picos 1 y 2. Sin embargo, existe un solapamiento de los picos 3 y 4, por lo que las fracciones intermedias entre ambos contendrán ambos componentes, y obviamente la purificación no es en este caso perfecta. Dos procesos causan el ensanchamiento del pico: la difusión y la turbulencia. La difusión es el proceso por el cual la macromolécula, que se concentra en una banda a medida que se separa de los otros componentes, tiende a difundir hacia atrás y adelante hacia zonas en que su concentración es menor. La difusión depende del tiempo, por lo tanto puede controlarse con corridas cortas, aumentando la velocidad de flujo. Sin embargo, esto causará que el flujo alrededor de las partículas no sea laminar, formándose turbulencias en el lado de la partícula cercano a la salida que ensancharán el pico. Por otra parte, muchos soportes no aceptan velocidades muy altas debido a que al aumentar el flujo aumenta la resistencia al avance y en consecuencia la presión. Con ello la fase inmóvil tiende a comprimirse, dificultando aún más el flujo y aumentando mas la presión. La turbulencia puede controlarse haciendo la partícula cada vez más chica. su vez, al achicar la partícula se aumenta la superficie, aumenta el rozamiento con el solvente y esto hace que se requiera más presión para poder lograr un flujo determinado. Para esto se usa un equipo especializado llamado HPLC (High performance liquid chromatography). En HPLC se utiliza un sistema de bombas de alta precisión, capaz de entregar flujos muy precisos y constantes a diferentes velocidades y a elevada presión. Este factor determina que se utilicen cañerías y columnas de acero u otros materiales capaces de soportar hasta 6000 psi (400 atm). Los 1 bs Volumen Figura 14 10

11 Bioquímica Cromatografía 11 soportes utilizados en HPLC también poseen características especiales para permitirles soportar presiones elevadas. Uno de los materiales más comunes es la sílica, aunque también se encuentran polímeros sintéticos de alta resistencia. El HPLC tiene usos como herramienta analítica pero también se puede trabajar en escala preparativa. La técnica de FPLC es un intermedio entre los sistemas de baja presión y el HPLC. En este caso también es posible controlar muy exactamente el flujo mediante un sistema de bombas de precisión, pero el sistema está limitado a presiones medias, hasta un máximo de 5 MPa. Se pueden acoplar columnas de diverso tamaño y con una variedad de soportes más amplia que en el caso del HPLC, aunque no se alcanza la misma resolución. Su uso se inclina más a la parte preparativa (purificación de proteínas, péptidos y ac. nucleicos) que a la analítica. 11