EJEMPLOS DE FASES LIGADAS

Transcripción

1 EJEMPLOS DE FASES LIGADAS

2 CARACTERÍSTICAS DE LA FASE MÓVIL Fuerza La influencia de la fuerza del disolvente es muy importante Capacidad de la FM para eluir al soluto En NPLC la fuerza aumenta al aumentar la polaridad En RPLC la fuerza de la FM aumenta al disminuir su polaridad

3 CARACTERÍSTICAS DE LA FM: FUERZA Y SELECTIVIDAD Existen varios índices para cuantificar la polaridad de los solventes: Capacidad de un solvente para disolver selectivamente un soluto frente a otro, cuando las polaridades de ambos no son excesivamente diferentes Parámetro de solubilidad de Hildebrand (δ) Índice de polaridad de Snyder (P )

4 CARACTERÍSTICAS DE LA FASE MÓVIL: POLARIDAD La interacción total entre una molécula de FM y una mólecula de soluto es el resultado de las siguientes interacciones:

5 CARACTERÍSTICAS DE LA FASE MÓVIL: POLARIDAD Cuanto mayor se la combinación de estas interacciones, mayor será la atracción entre moléculas de FM y soluto. La fuerza de un solvente se relaciona con su polaridad. La capacidad de una molécula de interactuar de acuerdo a estos mecanismos, es una medida de lo que llamamos polaridad. En NPLC y en cromatografía de adsorción, la fuerza del solvente aumenta con su polaridad. Así, los solventes "polares" disuelven preferencialmente moléculas "polares. En RPLC ocurre lo contrario: la fuerza del solvente disminuye a medida que aumenta su polaridad.

6 POLARIDAD DE SOLVENTES PUROS La polaridad de los solventes se ha definido de varias maneras. En HPLC el parámetro más usado es P', basado en datos experimentales de solubilidad reportados por Rohrschneider. El número de polaridad de Snyder (P ) se define como:

7 POLARIDAD DE SOLVENTES PUROS A través de cada una de las constantes de reparto se mide la tendencia a recibir protones (basicidad), a darlos (acidez) y a generar momentos dipolares.

8 FUERZA Y SELECTIVIDAD DE SOLVENTES

9 TRIÁNGULO DE SELECTIVIDADES DE SNYDER

10 CLASIFICACIÓN DE LA SELECTIVIDAD DE LOS SOLVENTES Los mayores cambios en la selectividad de la FM resultan cuando las propiedades de los solventes cambian fuertemente. Así, la sustitución de un solvente polar B (por ej., metanol) por su homólogo C (por ej., propanol) no genera un cambio perceptible en las interacciones soluto-fm y por lo tanto en la selectividad. En ambos casos se trata de solventes donores de puente de hidrógeno. Si, en cambio, pasamos a un solvente C que se comporte como un aceptor de puentes de hidrógeno (por ej., éter etílico) o que posea un momento dipolar elevado (por ej., cloruro de metileno), aparecerán cambios notables en la selectividad. Con un solvente aceptor, las moléculas de la muestra que se comporten como donores de H, permanecerán preferencialmente en la FM (menor retención). Con una FM de momento dipolar elevado, las moléculas más polares, interactuarán más fuertemente con la FM. En cada caso, las moléculas que desarrollen mayor interacción con la FM, disminuirán su valor de k (menor retención).

11 SELECTIVIDAD DE SOLVENTES Selectividad por tipos de solventes en RPLC (a) 50% MeOH-agua; (b) 25% THF-agua. Compuestos: (1), p-nitrofenol; (2), p-dinitrobenceno; (3), nitrobenceno; (4), benzoato de metilo

12 PARÁMETRO DE POLARIDAD P Un cambio de P' de dos unidades provoca (aproximadamente) una variación de 10 veces en el valor de k, lo cual permite calcular su variación en NPLC con la siguiente expresión: Para RPLC esta expresión se transforma en: k 1 y k 2 son los valores inicial y final de k' para un dado soluto, y P 1 y P 2 se refieren a los valores iniciales y finales de P

13 MEZCLAS DE SOLVENTES Tanto en RPLC como en NPLC, es usual ajustar la fuerza de la FM con mezclas de solventes. En general, un solvente A que resulta demasiado débil se mezcla con un solvente B que es demasiado fuerte, y su mezcla brinda la fuerza correcta para la separación. La polaridad P' de la mezcla de solventes se calcula como: Donde φ a y φ b son las fracciones en volumen de los solventes A y B en la mezcla, y P a y P b se refieren a los valores de P' de los solventes puros.

14 OTROS PARÁMETROS DE POLARIDAD

15 PROPIEDADES DE LAS FM MÁS COMUNES EN HPLC

16 Modo de separación más empleado en HPLC CROMATOGRAFÍA EN FASE INVERSA (RPLC)

17 CROMATOGRAFÍA EN FASE INVERSA (RPLC) Es la primera opción para la mayor parte de las muestras comúnmente analizadas por HPLC. Es más probable que se obtenga como resultado una separación final satisfactoria. Las columnas de RPLC son eficientes, estables y reproducibles. La detección es más fácil en RPLC (especialmente para los detectores UV) debido a los solventes utilizados. Aunque muchos compuestos orgánicos tienen una solubilidad limitada en la fase móvil (acuosa), esto no es una limitación práctica, ya que sólo se inyectan pequeñas cantidades (nanogramos o microgramos) de muestra.

18 RETENCIÓN EN CROMATOGRAFÍA EN FASE INVERSA Los compuestos hidrofílicos (polar) son menos retenidos y eluyen primero FM Polar FE No Polar Los compuestos más hidrofóbicos (no polares) son retenidos más fuertemente Hidrofóbico (No Polar) La separación es similar a la extracción desde agua a un disolvente orgánico: los compuestos más hidrofóbicos (no polares) son preferentemente extraídos hacia la fase no polar. La columna es típicamente un soporte de sílice modificada con C8 o C18 como fases ligadas.

19 EFECTOS DE LA FASE MÓVIL La retención (valor de k ) se ajusta preferentemente cambiando la composición de la fase móvil o la fuerza del solvente. En RPLC, la retención es menor para las FM más fuertes, que son las menos polares. La polaridad del solvente se puede medir por el índice de polaridad P. La fuerza del solvente depende tanto de la elección del solvente orgánico como de su concentración en la fase móvil (B%), siendo A el agua. Un primer (y principal) objetivo en el desarrollo del método es la obtención de la retención adecuada de todos los compuestos de la muestra. Un intervalo de retención de 0,5 < k <20 es aceptable para las muestras que se separan mediante condiciones isocráticas (aunque se prefiere 1 <k <10).

20 ELECCIÓN DEL % DE B. El desarrollo del método comienza usando una fase móvil muy fuerte (100% de ACN). El uso inicial de una fase móvil fuerte hace que el tiempo de análisis sea convenientemente corto, y los todos los compuestos eluyan. Para 100% de ACN toda la muestra eluye cerca de t M (k < 0,2) por lo que se requiere una FM más débil. Las sucesivas reducciones de ACN% hasta 80% y 60% ACN no dan resultados aceptables en términos de retención del primer pico (t R = 1 min, k < 0,5). Una retención adecuada se logra con 50% y 40% de ACN (0,5 < k < 20). Si la fase móvil es mucho más débil (<30% ACN), la retención para el compuesto D sería demasiado larga (k > 20).

21 ELECCIÓN DEL % DE B Las líneas punteadas horizontales en k = 0,5 y 20 definen los valores mínimo y máximo de %B para obtener una retención aceptable: 30 a 56% B (líneas de puntos verticales).

22 ELECCIÓN DEL % DE B A partir del modelo de partición antes visto aplicado a fases estacionarias ligadas, se obtiene: k w es el valor teórico de k para agua pura como FM, S es una constante para un compuesto dado φ es la fracción en volumen de solvente orgánico en la FM. k aumenta por un factor de 2 a 3 por una disminución del 10% B. Para compuestos de PM<500 Da, S = 4.

23 FUERZA DE LA FASE MÓVIL No sólo hay que tener en cuenta la fuerza del solvente con respecto a su influencia sobre %B sino que también tiene importancia el tipo de solvente utilizado. Los solventes más utilizados son el acetonitrilo, el metanol y el tetrahidrofurano (THF). Entre ellos la sucesión en función de su fuerza es la siguiente: agua (el más débil) <metanol <acetonitrilo <etanol <tetrahldrofurano <propanol <cloruro de metileno (el más fuerte) De todos ellos, el cloruro de metileno no es muy utilizado debido a que es inmiscible en agua. El más utilizado es el AcN porque tiene la suficiente fuerza y porque cuando se emplea como sistema detector el espectrofotometricoo UV- V es transparente a Iongitudes de onda cortas. Las mezclas de AcN son de baja viscosidad y eso, en cierta manera, aumenta la eficiencia de la columna (N) y la presión a utilizar es menor. Algo menos que el AcN se utiliza el metanol y algo menos todavía el THF.

24 DIAGRAMA DE COMPARACIÓN DE SOLVENTES EN RPLC Mezclas isoeluotrópicas: mezclas acuosas binarias de composición tal que mantienen la retención global de la mezcla de analitos El empleo de los nomógrafos permite cambiar la selectividad sin cambiar la retención global de la mezcla

25 EFECTO DE LA FE Aparte de la fase móvil, las retenciones presentan dependencia respecto a la fase estacionaria. Si se analiza el tipo de fase enlazada la retención de analitos no polares y no iónicos sigue el siguiente orden: La retención de los analitos depende de tres características de la columna: tipo de fase enlazada, concentración y superficie. Sílica desnuda (débil) < < ciano < C1 (TMS) < C3 < C4 < fenilo < C8 C18 (fuerte)

26 EFECTO DE LA LONGITUD DE LA CADENA EN LA EFICIENCIA DE UNA COLUMNA DE RPLC

27 CROMATOGRAFÍA DE FASE NORMAL (NPLC)

28 ASPECTOS GENERALES La FE es más polar que la FM. Por lo general, la FM es una mezcla de solventes orgánicos, sin adición de agua (por ejemplo, isopropanol + hexano) El relleno de la columna es un adsorbente inorgánico (sílice o alúmina) o una fase ligada polar (ciano, diol, aminoácidos). La retención de la muestra aumenta a medida que disminuye la polaridad de la FM. En NPLC, los compuestos menos polares (hidrofóbicos) eluyen primero, mientras que los más polares (hidrofílicos) son los más retenidos.

29 MECANISMO DE RETENCIÓN La retención en NPLC se describe bien por un proceso de desplazamiento Se basa en que la superficie de la sílice está inicialmente cubierta por una monocapa de moléculas de FM adsorbida. Para que una molécula de soluto pueda quedar retenida, deberá desplazar previamente e las moléculas de FM adsorbida. El equilibrio vendrá dado por: Y(m) + nm(s) Y(s) + nm(m)

30 MECANISMO DE RETENCIÓN La figura muestra el desplazamiento de un soluto relativamente no polar (clorobenceno) en una FM menos polar (cloruro de metileno). Una o más moléculas pre-adsorbidas de CH 2 Cl 2 son desplazadas de la FE y regresan a la FM.

31 MECANISMO DE RETENCIÓN Snyder obtuvo una expresión para la retención en NPLC en función de la "fuerza del solvente": ε es un parámetro que refleja la polaridad de la FM. A s es el área superficial del soluto. β es la relación de fases. Δ 2 es un parámetro de segundo orden que sirve para corregir por falta de linealidad del modelo asumido.

32 PAPEL DEL SOLVENTE En la ecuación de Snyder, las características del solvente están representadas por e, el parámetro del solvente. El solvente debe elegirse de modo que k caiga en el rango óptimo (entre 1 y 10). La fuerza del solvente está determinada por cuán fuertemente el solvente se adsorbe sobre el sólido. Para adsorbentes polares, la fuerza del solvente crecerá con su polaridad y un solvente fuerte dará valores de k bajos. Si un mismo soluto es cromatografiado sobre un mismo adsorbente empleando dos solventes diferentes, la relación de las K será: K log solv1 K solv2 = A s ε solv2 ε solv1

33 PAPEL DEL SOLVENTE Se define ε = 0 para el pentano (que es uno de los solventes más débiles ). Se construye una escala de valores crecientes de ε, conocida como serie eluotrópica Para adsorbentes polares, ε crece con la polaridad, y la serie eluotrópica es más o menos coincidente con la escala de P. Al aumentar ε, los K de todos los solutos se harán menores, pero el efecto es mayor cuando las moléculas tienen áreas moleculares (A s ) más grandes.

34 SELECTIVIDAD DE LA FM El parámetro eº para mezclas se puede calcular a partir de los valores de eº para los solventes puros. Para la obtención de FM de diferente selectividad y similares valores of k existen nomógrafos. A diferencia de RPLC, estos nomógrafos dependen de la FE. Nomógafos para NPLC y sílice desnuda como FE.

35 SELECTIVIDAD DE LA FE (1) 2-aminonaftaleno (2) 2,6-dimetilquinoleína (3) 2,4-dimetilquinoleína (4) 4-nitrofenol (5) quinoleína (6) isoquinoleína Condiciones: Columna de mm de sílica (FE) (d p = 5-μm) FM: acetato de etilo (B)-ciclohexano (A) Temperatura ambiente Caudal: 2.0 ml/min.

36 HPLC

37 FASE MÓVIL EN HPLC Los solventes más utilizados en HPLC son: agua, soluciones buffer acuosas y solventes orgánicos tales como metanol, acetonitrilo o diferentes mezclas. La fase móvil debe microfiltrarse para evitar obstrucciones en el sistema (conexiones muy estrechas, pistones de zafiro y columna muy empaquetada) Aire disuelto en la fase móvil (problemas) Bomba (flujo inestable) Detector (señales erráticas)

38 HPLC: BOMBAS Construidas con materiales inertes a los disolventes empleados Flujo entre 0.1 y 10 ml/min libre de pulsaciones Generar presiones superiores a los 6000 psi (14.7 psi = 1 atm) Las bombas pueden liberar el eluyente a una composición fija (régimen isocrático) o a una composición variable en el tiempo (régimen de gradiente) En el caso de una bomba, los solventes se mezclan previamente en una cámara a baja presión En el montaje de alta presión se emplean tantas bombas como solventes se usen y luego se produce la mezcla

39 HPLC: INYECTORES El inyector más empleado es una válvula de 6 vías, con lazos de volumen conocido y una palanca con dos posiciones: llenado e inyección En la posición de llenado, la FM pasa directamente a la columna y la muestra se introduce en el lazo mediante una microjeringa Al girar la palanca a la posición de inyección, la FM impulsa la muestra que estaba en el lazo hasta la columna De este modo la varianza en la inyección es constante y no hay que usar patrón interno como en GC Los lazos más habituales oscilan entre 2 y 1000 ml

40 HPLC: COLUMNAS Son generalmente de acero ó plástico, de una longitud de 5-30 cm y con diámetros interiores de 1-5 mm Las convencionales tienen un diámetro interno de 4.6 mm. (L=15 ó 25 cm y 5μm tamaño partícula) Son caras y se degradan con facilidad (polvo, partículas de la muestra o disolventes) La entrada de la columna se protege con una precolumna que se reemplaza periódicamente

41 PRE-COLUMNAS En cromatografía de reparto, la FM y la FE deben seleccionarse de forma que la solubilidad recíproca sea mínima. Por muy distintos que sean dos líquidos, siempre serán algo miscibles. Por ello, la FM deberá presaturarse con la FE antes de ponerse ambas en contacto dentro de la columna. Esta pre-saturación se hace en una pre-columna situada antes del sistema de introducción de las muestras. La pre-columna deberá contener un relleno de gran área superficial, tal como gel de sílice, recubierto con una cantidad relativamente grande (30-40%) de la sustancia usada como fase estacionaria. El problema de la solubilidad de la fase estacionaria impide utilizar la técnica de la elución con gradiente.

42 DETECTORES Los detectores basados en una PROPIEDAD DEL SOLUTO responden a una propiedad física o físico-química del soluto, y que generalmente no la presenta la fase móvil. Estos detectores suelen ser bastante selectivos y muy sensibles. Los detectores basados en una PROPIEDAD DE LA DISOLUCIÓN comparan el cambio global de alguna propiedad física de la fase móvil con y sin soluto eluido. Estos detectores responden a un conjunto amplio de solutos, pero suelen ser poco sensibles.

43 Sensibilidad elevada. No destructivo. Buena estabilidad y reproducibilid ad. Respuesta independiente de la composición de la fase móvil. Características de un detector para HPLC Amplio margen de respuesta lineal. Insensible a cambios en la presión y la temperatura. Pequeño volumen muerto. Pequeño tiempo de respuesta.

44 DETECTORES DE ABSORBANCIA ULTRAVIOLETA La modificación más importante es diseñar adecuadamente la celda de flujo. Esta deberá contener un volumen mínimo (entre 1 y 10 μl) y ser capaz de soportar presiones de varias atmósferas. Celda diseñada en forma de Z.

45 DETECTORES DE ABSORBANCIA ULTRAVIOLETA El detector UV más sencillo utiliza la emisión intensa a 254 nm de una lámpara de mercurio y la detección a una sola longitud de onda. En instrumentos más versátiles se utiliza una lámpara de deuterio y un monocromador para mediciones a longitud de onda variable. Se estima que casi las dos terceras partes de los solutos orgánicos analizados por HPLC presentan absorción a esa λ, especialmente los compuestos aromáticos, los cuales tienen absortividades molares del orden de 10 4.

46 APLICACIONES La cromatografía en FASE NORMAL se utiliza extensamente para el análisis de sustancias que son solubles en disolventes no polares. Vitaminas, pigmentos, aceites esenciales, aditivos no polares en distintos productos comerciales y formulaciones farmacéuticas. Asimismo, uno de los usos más importantes de esta modalidad de cromatografía es la separación de isómeros. La cromatografía en FASE INVERSA, y particularmente la de fase enlazada, es, sin duda, la más ampliamente utilizada. Se calcula que el 75 % de las separaciones por HPLC se llevan a cabo por dicha técnica. En la industria farmacéutica sus aplicaciones se centran, entre otras, en el análisis de vitaminas, β-bloqueantes, alcaloides, esteroides, tetraciclinas, prostaglandinas, etc. Asíiismo, es utilizada para el análisis de especies biológicamente activas, como aminoácidos, proteínas y ácidos nucleicos.

47 CROMATOGRAFIA PLANA Cromatografía líquida en la que la fase estacionaria es una superficie plana, en lugar de estar contenida en una columna. Existen dos técnicas de cromatografía plana: cromatografía en papel (CP) y cromatografía de capa fina (CCF o TLC). En cromatografía plana, la muestra se aplica en forma de gota sobre una lámina o superficie plana. Después de evaporado el disolvente, la lámina se coloca verticalmente en una cámara cerrada con su extremo sumergido en el eluyente elegido (fase móvil), pero no la muestra. La fase móvil percola a través de la fase estacionaria por capilaridad y desplaza los componentes de la muestra a distinta velocidad, teniendo lugar la separación. Una vez que el disolvente ha pasado a través de la mitad o de las dos terceras partes de la longitud de la lámina, se saca ésta de la cámara y se seca, poniéndose de manifiesto la presencia de las especies separadas por los procedimientos que se indicarán más adelante. El cromatograma está constituido por un conjunto de manchas que corresponden a los componentes separados

48 CROMATOGRAFIA PLANA

49 PRINCIPIOS BASICOS La caracterización de los componentes separados se lleva a cabo por el denominado factor de retardo, R F, definido por: distancia recorrida por el soluto R F = = distancia recorrida por el frente del solvente Los valores de R F pueden variar desde 1, para los analitos que no se retrasen, hasta valores próximos a cero. Ayudan a la identificación de una determinada especie, si bien, la coincidencia en los R F no deberá tomarse como prueba inequívoca de identificación d d R M

50 PRINCIPIOS BASICOS Con objeto de minimizar las diferencias entre los valores de los RF, se ha propuesto utilizar el parámetro R x, definido por: distancia recorrida por el soluto R X = = distancia recorrida por el patrón A pesar de la coincidencia en los valores de R x, la identificación plena de un compuesto deberá hacerse de forma específica, con técnicas auxiliares, como espectroscopia IR, espectrometría de masas, RMN, etc. d d R P

51 PRINCIPIOS BÁSICOS Factor de retención o factor de capacidad k t = t M Número de platos teóricos R 1 = R R F F N = 16 d R W 2

52 LOCALIZACIÓN DE LAS SUSTANCIAS SEPARADAS Métodos químicos. Implican una reacción química, específica o general. Vapor de yodo, se adsorbe sobre una gran cantidad de sustancias, originando puntos oscuros. Ácido sulfúrico concentrado, el cual, pulverizado permite visualizar las sustancias orgánicas Fluoresceína origina color amarillo-verdoso Ninhidrina se utiliza para detectar aminoácidos. Métodos físicos. Radiación ultravioleta, en combinación con un indicador fluorescente. La placa contiene un material fluorescente cuya emisión (a 254 nm) es inhibida por la mayoría de los solutos. Una vez evaporado el solvente, se ilumina la placa con radiación ultravioleta en un cuarto oscuro. Las manchas de soluto se ven más oscuras, mientras que el resto de la placa es brillante.