Propiedades funcionales de proteínas de amaranto Capacidad de gelificación

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1 Propiedades funcionales de proteínas de amaranto Capacidad de gelificación Avanza María V. - Añón María C.* Laboratorio de Bromatología - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura - UNNE. Campus Universitario - Av. Libertad (3400) Corrientes - Argentina. Teléfono/Fax: +54 (3783) victoriaa@exa.unne.edu.ar * Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (CIDCA) - UNLP-CONICET. 47 y La Plata - Buenos Aires - Argentina. mca@nahuel.biol.unlp.edu.ar INTRODUCCION El conocimiento de las propiedades funcionales de las proteínas es esencial para poder emplear las mismas como ingredientes que impartan características deseadas a un alimento. En tal sentido, existe un número muy reducido de estudios relacionados con las propiedades funcionales de las proteínas de amaranto (Martinez 1997). Es sabido que el amaranto posee granos con un contenido importante de proteínas (14-19% p/p), las cuales exhiben un balance muy equilibrado de aminoácidos esenciales (Teuntónico y Knorr, 1985; Bressani, 1989) Este hecho convierte a las proteínas de amaranto en objetos muy atractivos desde el punto de vista nutricional y como una fuente potencial para la alimentación humana. Las principales fracciones proteicas presentes en el amaranto son álbuminas, globulinas y glutelinas. Las dos últimas constituyen las principales proteínas de reserva del grano las cuales se encuentran localizadas en el embrión y en el endosperma. Respecto a la fracción globulinas es sabido que participan de la misma, las globulinas de reserva clásicas de muchos granos, tipo 7S (minoritaria desde el punto de vista cuantitativo) y 11S y las globulinas-p, características del amaranto (Segura-Nieto et al. 1994, Romero-Zepeda y Paredes-Lopez, 1996; Chen y Paredes-Lopez 1997; Martinez et al 1991, Castellani et al. 1998, 1999, 2000). Las globulinas-p poseen una composición polipeptídica semejante a las globulinas 11S, en la que se destaca la presencia de un polipéptido particular de 56 kda, que aparentemente sería responsable de su alta capacidad de polimerización. En cuanto a las glutelinas, poseen como característica sobresaliente su baja solubilidad, aún en medio alcalinos y elevado grado de agregación (Martinez y col. 1997). Dadas las características de las proteínas de reserva del amaranto y el hecho que se desconocen sus propiedades funcionales se decidió estudiar en aislados proteicos, una de las principales propiedades relacionadas con la interacción proteína-proteína, como es la capacidad de gelificación. OBJETIVO Estudiar las propiedades funcionales de aislados proteicos de Amaranto relacionadas con las interacciones proteína - proteína, específicamente con su capacidad de gelificación. Para alcanzar este objetivo se procedió inicialmente a: Analizar el efecto del tratamiento térmico sobre las características estructurales de las proteínas presentes en aislados proteicos de Amaranto. MATERIALES Y METODOS 1- Preparación de aislados proteicos: Las semillas de Amaranto fueron molidas en un molino Udy de 1 mm de mesh; y tratadas posteriormente con hexano 10 % p/v, con el objeto de eliminar la fracción lipídica. La harina resultante fue suspendida en agua 10 % p/v llevándose al ph requerido con Na(OH) 2N. Los phs seleccionados fueron 9 y 11. La suspensión se mantuvo con agitación durante 30 min. al ph seleccionado. Posteriormente se centrifugó a 9000 g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los sobrenadantes resultantes se llevaron a ph 5 con HCL 2N, luego de lo cual se centrifugó a 9000 g durante 20 minutos a 4 C. Los precipitados obtenidos se resuspenden en un volumen pequeño de agua y se neutralizan con Na(OH) 0,1N. Posteriormente son liofilizados. Los aislados así obtenidos se denominaron A9 y A11, de acuerdo al ph de extracción. 2- La caracterización química de los aislados proteicos y de la harina original de Amaranto, se realizó mediante los métodos clásicos descriptos por la AOAC (1996).

2 3- La caracterización polipeptídica se hizo por electroforesis nativa en geles de poliacrilamida continuos al 7 %; y electroforesis desnaturalizante con dodecil sulfato de sodio, en geles de poliacrilamida formados por un gel apilador (acrilamida 4 %), y un gel separador (acrilamida 12 %), en condiciones reductoras y no reductoras. Se utilizó un equipo miniplaca BIO RAD modelo Miniprotean II, con sistema de buffers de Laemmli (1970). Las corridas se llevaron a cabo durante 1 h a voltaje constante (200v). 4- El análisis térmico diferencial se realizó en un calorímetro Polymer Laboratories (Reometric Scientific0, calibrado con indio como standard; a una velocidad de calentamiento de 10 C/min. Los termogramas se analizaron con sofware Plus V Se prepararon dispersiones de los aislados A9 y A11 en agua, a una concentración de 1 mg/ml. En un primer ensayo se los trató térmicamente durante 15 y 30 min a las siguientes temperaturas: 70 C, 80 C, 90 C y 95 C; y en un segundo ensayo se fijaron dos temperaturas 70 C y 90 C, y se los trató térmicamente a distintos tiempos, 3, 5, 10, 15 y 30 minutos. En ambos tipos de ensayo, luego de dicho tratamiento, se midió la DO a 260 nm y 280 nm, en celdas de cuarzo de 1 cm de paso óptico. Para poder realizar estas determinaciones se utilizó un espectrofotómetro Metrolab 1700 UV- visible con portacubetas termostatizables. 6- Se realizaron ensayos de calentamiento de suspensiones proteicas de concentración conocida, y luego de un determinado tiempo de tratamiento, se observó el aspecto, color, consistencia y textura del producto. A tal efecto se utilizaron tubos de vidrio de 5 cm de largo y 8 mm de diámetro, los cuales se sellaron en ambos extremos con tapones de goma, se introdujo un volumen de suspensión de 0,5 ml aproximadamente. Se utilizaron suspensiones de ambos aislados al 10 %, 7,5 % y 5 % p/v. RESULTADOS 1- Composición centesimal de los aislados proteicos y de la harina original Los resultados obtenidos indicaron que la harina original posee un 25 % de proteínas y 64 % de hidratos de carbono, respondiendo a la composición habitual de una harina de Amaranto, la cual posee mayor contenido proteico que la proveniente de cereales (National Academy of Science, 1984). Dadas las características de solubilidad de estas proteínas y sobre la base de resultados previos (Martinez y Añón, 1996), se seleccionaron como phs de extracción 9 y 11, con posterior precipitación en el punto isoeléctrico. El análisis químico efectuado mostró que los aislados contenían entre % de proteínas en base seca. 2- Composición polipeptídica de los aislados obtenidos A efectos de analizar la composición polipeptídica de los aislados preparados se llevaron a cabo electroforesis nativas y desnaturalizantes. En las corridas electroforéticas efectuadas en condiciones nativas en ausencia de ME (Figura 1), se observó que el aislado A9 presenta tres bandas proteicas de diferente movilidad y material retenido al comienzo del gel separador. La banda de menor movilidad es ancha, no pudiéndose descartar la posibilidad de que exista más de una especie polipeptídica que contribuya a la misma. En el aislado A11 se observó con mayor claridad al menos una banda de menor movilidad, probablemente debida a especies de mayor masa molecular. En presencia de ME puedo observarse en ambos casos, una banda principal definida y otra menos intensa de mayor movilidad, A9 A11 A9 A11 además de material que no entra al gel. S/ME C/ME Estos resultados indican que a ph 11 se extraen especies proteicas con mayor masa molecular, muy Figura 1: electroforesis nativa al 7% probablemente agregados estabilizados por puentes disulfuro. En la electroforesis desnaturalizante, realizada en condiciones no reductoras, puede observarse para ambos aislados la presencia de agregados de alta masa molecular, además de especies proteicas de: 77; 56; 52, 34 y 21 kda. En condiciones reductoras el aislado A9 presenta cuatro especies polipeptídica de masa molecular: 71; 56; 32 y 22 kda. En el aislado A11 se pueden observar los mismos péptidos más una quinta especie polipeptídica de 85 kda. La ausencia de especies polipeptídicas de alta masa molecular, indica la existencia de agregados proteicos estabilizados por puentes disulfuro. Tanto la electroforesis nativa como la desnaturalizante, indican que ambos aislados están constituidos principalmente por las fracciones globulinas, globulina P y glutelinas. (Martinez y Añón, 1996).

3 3 - Análisis del comportamiento térmico de los aislados mediante calorimetría diferencial de barrido En la figura 2 se presenta un termograma típico de los aislados, el cual está caracterizado por la presencia de dos endotermas cuyas temperaturas de máxima deflexión son 70 C y 90 C, respectivamente. Ambos tipos de aislados, A9 y A11, se diferencian por la contribución de cada endoterma al termograma; mientras que en A9 predomina la segunda endoterma, en A11 ambas endotermas contribuyen de manera casi igualitaria. El área total de los termogramas, que representa a la suma de las entalpías de desnaturalización de las dos endotermas, disminuye al aumentar el ph, lo que sugiere un mayor grado de desplegamiento de las proteínas a ph alcalino, coincidentemente con lo observado por Martinez y Añón (1996). Figura 2: Termograma correspondiente al aislados A9 Resultados obtenidos con anterioridad (Martinez y Añón, 1996) han mostrado que la fracción purificada de globulina - P muestra una única endoterma a 94 C; la fracción de globulina 11S dos endotermas a 69 C y a 94 C siendo la segunda mayor; en tanto que la fracción de glutelinas muestra dos endotermas a 70 C y a 96 C con prevalencia de la primera endoterma. La comparación de los termogramas obtenidos para los aislados con estos datos, corrobora la presencia de globulinas, globulinas - P y glutelinas en estas muestras, e indicarían la presencia de una mayor proporción de globulinas a ph 9 y de glutelinas a ph Tratamiento térmico de suspensiones. Cambios operados en el espectro UV - visible En la figura 3 A y B se representa la DO a 260 nm, en función del tiempo de tratamiento a 70 C y 90 C para los aislados A9 y A11 respectivamente. En el caso del aislado A11 se observó un incremento de la absorbancia con el tiempo de calentamiento a la menor temperatura, lo que sugiere una desnaturalización ligera y progresiva de las proteínas. A 90ºC se detectó un incremento inicial seguido por una ligera disminución de la DO a partir de los 20 minutos de calentamiento lo que sugiere la existencia de reacciones de agregación a continuación de la desnaturalización proteica. Por su parte el aislado A9 mostró, a las dos temperaturas ensayadas, un desplegamiento inicial, hasta 15 minutos de calentamiento aproximadamente, y una posterior agregación. A9 y A11, de acuerdo a los valores de absorbancia detectados, diferirían en el contenido de aminoácidos aromáticos. El comportamiento de ambos aislados es congruente con la estabilidad térmica de las especies proteicas presentes, tal como fuera mostrado por calorimetría diferencial de barrido. (A) (B) Figura. 3. (A) Absorbancia en función del tiempo a 70 C y (B) a 90 C de los aislados A9 y A11.

4 5- Tratamiento térmico de suspensiones. Cambios observados por electroforesis. Las suspensiones de ambos aislados tratados térmicamente a 70 C y 90 C, a diferentes tiempos (3, 5, 10, 15 y 30 minutos), fueron liofilizadas y luego analizadas mediante electroforesis desnaturalizante en condiciones reductoras y no reductoras. El análisis de los perfiles obtenidos muestra que: Aislado A11 - Geles sin ME: A las dos temperaturas ensayadas a medida que aumenta el tiempo de tratamiento, aumenta la cantidad de agregados de alta masa molecular que no penetran al gel, que penetran ligeramente y aquellos que quedan retenidos en el gel de stacking. - Geles con ME: Se observan exactamente las mismas especies polipeptídicas a todos los tiempos y a ambas temperaturas de calentamiento. Dichas especies son equivalentes a las presentes en el aislado A11sin tratar. Estos resultados indicarían que el tratamiento térmico induce la formación de agregados estabilizados principalmente por uniones S-S, los que estarían constituidos, en principio, por todas las especies polipéptidas presentes en el aislado. Aislado A9 - Geles sin ME: A 90 C, se detecta la formación de agregados de alta masa molecular que penetran o no al gel separador y quedan retenidos en el gel de stacking. La formación de dichos agregados se incrementa con el tiempo de calentamiento. Este efecto tiene mucha menor incidencia a 70ºC. - Geles con ME: En este caso se detectan algunas diferencias entre el calentamiento a 70 C y 90 C. Si bien en ambos casos están presentes las mismas especies proteicas que en aislado sin calentar; a mayor temperatura permanecen algunos agregados que no pentran al gel. Estos resultados indicarían que el tratamiento térmico induce la formación de agregados de alta masa molecular, en este caso estabilizados por uniones S-S y quizás interacciones hidrofóbicas. 6-Ensayos de gelificación En los primeros ensayos de gelificación se observó que el aislado A9 tiene mayor capacidad de gelificación que el aislado A11, a ph 7; lo cual está relacionado a la concentración. El aislado A9 comienza a gelificar a partir de 5% p/v de proteína, luego que esta dispersión es calentada durante 30 min a 90 C; mientras que el aislado A11 requiere 7,5% p/v de proteínas y un calentamiento a 95 C durante 30 min para formar una red estable. Estos resultados concuerdan con las variaciones de DO y perfiles electroforéticos obtenidos en función del tiempo y temperatura de calentamiento. Los geles formados en todos los casos fueron opacos y frágiles, constituidos por una matriz de gránulos finos CONCLUSIONES Los resultados obtenidos hasta el presente muestran que: - la modificación del ph en la etapa de extracción de las proteínas de amaranto permite la obtención de aislados enriquecidos en diferentes fracciones proteicas; globulina-p en el caso de ph 9 y glutelinas a ph la diferencia en la composición proteica de los aislados se manifiesta en propiedades como la estabilidad de las proteínas frente al tratamiento térmico y el grado de conformación nativa que presentan. - el tratamiento térmico de los aislados condujo a una desnaturalización y agregación de las proteínas presentes en los mismos; efectos dependientes de las condiciones tiempo-temperatura empleadas y del tipo de proteínas. Los agregados detectados se encontrarían estabilizados por uniones covalentes (puentes disulfuro) y no covalentes (puesntes hidrógeno e interacciones hidrofóbicas). - a una concentración proteica adecuada la desnaturalización y agregación proteica condujo a la formación de geles cuyas características son dependientes del tipo de aislado analizado. Se requiere otros estudios que permitan analizar en profundidad las características y propiedades de los geles obtenidos, así como el mecanismo de formación. BIBLIOGRAFIA Barba de la Rosa A., Gueguen J., Paredes López O., Viroben G., Fractionation procedures, electrophoretic characterization, and amino acid composition of amaranth seed proteins. J. Agric. Food Chem., a. Pág Bressani R., Composition and nutritional properties of Amaranth. En Amaranth Biology, Chemistry and Technology. Editado por Paredes-López O., CRC Press, Boca Raton., Capítulo Pág Castellani O. F., Martínez E. N., Añóm M. C., Structural modifications of an Amaranth globulin induced by PH and Na Cl. J. Agric Food Chem Castellani O. F., Martínez E. N., Añóm M. C., Role of disulfide bonds upon structural stability of an amaranth globulin. J. Agric Food Chem Pág

5 Chen S., Paredes-López O., Isolation and characterization of de 11S globulin fron amaranth seeds. J. Food Biochem., Pág Martínez E. N., Añón M.C., Composition and structural characterization of amaranth protein isolates. An electrophoretic and calorimetric study. J. Agric. Food Chem Pág Martínez E. N., Castellani O. F., Añón M.C., Common molecular features among amaranth storage proteins. J. Agric. Food Chem Pág Martínez E. N. Caracterización de proteínas de Amarnto. Tesis doctoral. Facultad de Ciencia Exactas, Univ. Nac. La Plata. Paredes-López O., Mora-Escobedo R., Odorica-Falomir C. Isolation of amaranrh protein. Lebensm. Wiss. U. Technol Pág Pilosof Ana M., Gualterio b. Bartholomai, Caracterización funcional y estructural de proteínas. Eudeba Pág Pupo M. C., Lupano C. E., Añón M. C. Gelation of soybean protein isolater in acidic conditions. Effect of ph and protein concentration. J. Agrioc. Food Chem Pág Romero-Zepeda H., Paredes-López O., Isolation and characterization of amarantin, the 11 amaranth seed globulin. J. Food Biochem Pág Scope R. K. Protein purification, principles and practice. Edit. Springer-Verleg Cap. 10. Pág Segura-NietoM., Barba de la Rosa A. P., Paredes-López O., Biochemistry of amaranth protein. En Amaranth Biology Chemistry and Technology. Editado por Paredes-López O., CRC Press, Boca Raton, Capítulo Pág