PRACTICA N 12. DETERMINACIÓN CUALITATIVAS Y CUANTITATIVAS DE PROTEINAS

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1 Objetivos: PRACTICA N 12. DETERMINACIÓN CUALITATIVAS Y CUANTITATIVAS DE PROTEINAS Demostrar la presencia de proteínas en los alimentos. Observar diferencias entre péptidos de diferentes longitudes. Determinar cuantitativamente las proteínas Materiales y Reactivos: Materiales: Balanza analítica, plancha de calentamiento, beakers, balones aforados, pipetas, fiolas, bureta, piseta. Reactivos: ácido nítrico concentrado, hidróxido de sodio, solución de sulfato de cobre al 0,5%, formaldehído, permanganato de potasio, fenolftaleína al 1% Introducción. Las proteínas son biomoléculas formadas básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. Pueden además contener azufre y en algunos tipos de proteínas, fósforo, hierro, magnesio y cobre entre otros elementos. Pueden considerarse polímeros de unas pequeñas moléculas que reciben el nombre de aminoácidos y serían por tanto los monómeros unidad. Los aminoácidos se caracterizan por poseer un grupo carboxilo (-COOH) y un grupo amino (-NH2) y están unidos mediante enlaces peptídicos. La unión de un bajo número de aminoácidos da lugar a un péptido; si el n: de aa. que forma la molécula no es mayor de 10, se denomina oligopéptido, si es superior a 10 se llama polipéptido y si el n: es superior a 50 aa. se habla ya de proteína. Figura 1. Estructura general de los aminoácidos.

2 COMPORTAMIENTO QUÍMICO En disolución acuosa, los aminoácidos muestran un comportamiento anfótero, es decir pueden ionizarse, dependiendo del ph, como un ácido liberando protones y quedando (-COO'), o como base, los grupos -NH2 captan protones, quedando como (-NH3+ ), o pueden aparecer como ácido y base a la vez. En este caso los aminoácidos se ionizan doblemente, apareciendo una forma dipolar iónica llamada zwitterion. EL ENLACE PEPTÍDICO Los péptidos están formados por la unión de aminoácidos mediante un enlace peptídico. Es un enlace covalente que se establece entre el grupo carboxilo de un aa. y el grupo amino del siguiente, dando lugar al desprendimiento de una molécula de agua. Figura 2. Formación del enlace peptídico. El enlace peptídico tiene un comportamiento similar al de un enlace doble, es decir, presenta una cierta rigidez que inmoviliza en un plano los átomos que lo forman.. ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales denominados: estructura primaria, estructura secundaria, estructura terciaria y estructura cuaternaria. Cada una de estas estructuras informa de la disposición de la anterior en el espacio.

3 ESTRUCTURA PRIMARIA La estructura primaria es la secuencia de aa. de la proteína. Nos indica qué aa. componen la cadena polipeptídica y el orden en que dichos aa. se encuentran. La función de una proteína depende de su secuencia y de la forma que ésta adopte. ESTRUCTURA SECUNDARIA La estructura secundaria es la disposición de la secuencia de aminoácidos en el espacio. Los aas., a medida que van siendo enlazados durante la síntesis de proteínas y gracias a la capacidad de giro de sus enlaces, adquieren una disposición espacial estable, la estructura secundaria. Existen dos tipos de estructura secundaria: la α (alfa)-hélice: Esta estructura se forma al enrollarse helicoidalmente sobre sí misma la estructura primaria. Se debe a la formación de enlaces de hidrógeno entre el -C=O de un aminoácido y el -NH- del cuarto aminoácido que le sigue. la conformación β (beta): En esta disposición los aas. no forman una hélice sino una cadena en forma de zigzag, denominada disposición en lámina plegada. Presentan esta estructura secundaria la queratina de la seda o fibroína. ESTRUCTURA TERCIARIA La estructura terciaria informa sobre la disposición de la estructura secundaria de un polipéptido al plegarse sobre sí misma originando una conformación globular. En definitiva, es la estructura primaria la que

4 determina cuál será la secundaria y por tanto la terciaria. ESTRUCTURA CUATERNARIA Esta conformación globular facilita la solubilidad en agua y así realizar funciones de transporte, enzimáticas, hormonales, etc. Esta conformación globular se mantiene estable gracias a la existencia de enlaces entre los radicales R de los aminoácidos. Aparecen varios tipos de enlaces: 1. el puente disulfuro entre los radicales de aminoácidos que tiene azufre. 2. los puentes de hidrógeno 3. los puentes eléctricos 4. las interacciones hidrófobas. Esta estructura informa de la unión, mediante enlaces débiles ( no covalentes) de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria, para formar un complejo proteico. Cada una de estas cadenas polipeptídicas recibe el nombre de protómero. El número de protómeros varía desde dos como en la hexoquinasa, cuatro como en la hemoglobina, o muchos como la cápsida del virus de la poliomielitis, que consta de 60 unidades proteicas Determinación de la presencia de proteínas En tres tubos de ensayo marcados A, B y C coloque las siguientes sustancias: A: 1 ml de albúmina de huevo (clara de huevo) y 5 gotas de ácido nítrico concentrado B: 1 ml de almidón al 2 % y 5 gotas de ácido nítrico concentrado C: 1 ml de agua destilada y 5 gotas de ácido nítrico concentrado PRECAUCIÓN: EL ÁCIDO NÍTRICO ES CORROSIVO. USE UN CILINDRO GRADUADO PARA VERTERLO. Sumerja los tubos en un beaker con agua a 60 ºC por 5 minutos. Luego enfríe bajo el chorro y añada 5 gotas de solución de hidróxido de sodio para hacer la solución básica. Anote sus observaciones.

5 Diferenciación entre péptidos de diferentes longitudes de cadena Rotule tres tubos de ensayo como A, B y C y coloque en ellos lo siguiente: A: 3 ml de solución de yema de huevo al 1% B: 3 ml de solución de albúmina de huevo al 1% C: 3 ml de agua destilada Luego añada a cada tubo CON UN CILINDRO GRADUADO 2 ml de NaOH concentrado (30%), teniendo cuidado de no quemarse la piel con la solución. Agite suavemente. A continuación deje caer en cada tubo 6 gotas de sulfato de cobre al 0,5%. Agite y observe si hay algún cambio Determinación cuantitativa de las proteínas por medio del índice de formol El formaldehído concentrado sustituye a uno o a los dos H del grupo NH para formar derivados mono o dimetilados. ó El bloqueo de la función amina permite una permite una titulación con álcali de las funciones ácidas así creadas. Introduzca en una fiola 25 ml de leche homogeneizada y 1 ml de oxalato de potasio al 20% (para precipitar el calcio que se encuentre acomplejado con proteínas). Añada 6 ml de formaldehído al 40% p/p previamente neutralizado con NaOH en presencia de fenolftaleína al 1%. Agite la mezcla y espere un minuto. Titule con NaOH N/7 (0,14 N) hasta observar un cambio de color permanente. n será el numero de ml de NaOH N/7 gastado en la titulación. n es igual al contenido de proteínas en g/100 ml de leche Reporte de datos

6 Incluya en el reporte de datos sus resultados y los valores teóricos para la muestra empleada (% de proteínas, tipo de polipéptidos presentes, etc...). Discuta los resultados en función del método utilizado y de los valores teóricos hallados en la bibliografía. Bibliografía a consultar Badui, S Química de los Alimentos. Edit. Alhambra. México, D.F. Belitz, H.; Grosch, W Química de los Alimentos. Acribia. Zaragoza, España. Czyhrinciw, N.; Baragaño, M.; Garcés, M Análisis Industrial en la Fabricación de Alimentos. UCV, Caracas. De Rodríguez, B.; Martín, E Análisis de Alimentos. Tomo I. UCV, Caracas. Hart y Fisher Análisis Moderno de los Alimentos. Acribia, Zaragoza, España. Tscheuschner, H Fundamentos de Tecnología de los Alimento