LOS SENSORES QUÍMICOS

Transcripción

1 Biotecnología María Isabel Pividori*, Emanuela Zacco, Anabel Lermo y Salvador Alegret. Grup de Sensors i Biosensors (GSB), Departament de Química, Universitat Autònoma de Barcelona María Pilar Marco, Francisco Sánchez Baeza. Grupo de Receptores Moleculares Aplicados (AMRg), Departamento de Química Orgánica Biológica, IIQAB-CSIC Barcelona El Grupo de Sensores y Biosensores de la Universitat Autònoma de Barcelona (GSB) y el Grupo de Receptores Moleculares Aplicados del CSIC (AMRg) vienen dirigiendo alguna de sus líneas de investigación hacia el desarrollo de biosensores electroquímicos robustos, económicos, de uso simple, y dirigidos a su aplicación principalmente en la industria alimentaria y el control medioambiental y la salud humana. Las agencias reguladoras y los laboratorios de control de calidad podrán, en un futuro, disponer de biosensores portátiles capaces de realizar análisis de manera más rápida y económica. Los biosensores en la industria alimentaria, el control medioambiental y la salud humana LOS SENSORES QUÍMICOS EXISTEN DESDE HACE MUCHO TIEMPO. SE HAN ESTUDIADO EN PROFUNDIDAD Y HAN ENCONTRADO DURANTE TODO ESTE TIEMPO UN GRAN CAMPO DE APLICACIÓN La necesidad de análisis de diferentes componentes a tiempo real en áreas cada vez más diversas ha promovido en estos últimos años que los esfuerzos realizados en el desarrollo de instrumentación analítica se dirijan hacia la construcción de dispositivos cuya utilización no requiera la supervisión profesional, cuyo manejo sea sencillo y cuyo coste sea menor. Como resultado de esta demanda de información relacionada con el análisis de forma rápida, fiable y descentralizada se ha favorecido el desarrollo de sensores químicos y biosensores como alternativa de análisis a la instrumentación analítica convencional Los sensores químicos existen desde hace mucho tiempo. Se han estudiado en profundidad y han encontrado durante todo este tiempo un gran campo de aplicación. Se conocen muy bien por su uso cotidiano en el laboratorio los electrodos redox, los electrodos selectivos a iones, especialmente el de ph, entre otros muchos. Simultáneamente al avance de los sensores, y debido al gran impulso de la informática, se viene desarrollando del mismo modo instrumentación capaz de realizar el seguimiento continuo de procesos complejos mediante ordenador de los parámetros físicos y/o químicos basados en sensores químicos. Mediante este tipo de instrumentación es posible intervenir en el control de procesos de forma rápida y segura. Los biosensores, de aparición más reciente, constituyen un campo multidisciplinario de I+D y un mercado muy atractivo. Originariamente la investigación en este campo pro- 68 NOVIEMBRE/DICIEMBRE06 FARMESPAÑA INDUSTRIAL

2 FIGURA 2. Diagrama esquemático del funcionamiento de un sensor. El elemento de reconocimiento o receptor sólo reconoce un componente de la muestra. La señal proveniente del proceso de reconocimiento se convierte en una señal eléctrica mediante el transductor. Esta señal es amplificada y posteriormente procesada y presentada en forma digital. El receptor puede interactuar con el analito mediante mecanismos físicos, químicos o biológicos. venía principalmente del sector clínico y biomédico. Las inversiones realizadas en el desarrollo de biosensores para la aplicación en el campo clínico fueron compensadas en un corto plazo con la aparición de los biosensores para la determinación y control de glucosa en pacientes diabéticos. Los biosensores demostraron así su capacidad de realizar análisis fuera del ámbito del laboratorio y por personas no entrenadas, por ejemplo, en la consulta médica por el mismo paciente. Actualmente los biosensores no son patrimonio exclusivo de la investigación biomédica. La industria alimentaría demanda métodos rápidos para estimar la identidad, la caducidad, el deterioro o la contaminación de los alimentos. A la industria en general, y a la alimentaria en particular, le es necesario controlar de manera confiable los productos en matrices muy complejas. Con la consolidación de la Unión Europea, las medidas dirigidas hacia el control de alimentos cada vez son más estrictas y generan necesidades analíticas muy variadas. La problemática de los contaminantes en la salud humana. La seguridad alimentaria y medioambiental El concepto de seguridad alimentaria implica garantizar la producción y comercialización de alimentos que no supongan un riesgo potencial para la salud del consumidor. La innovación y el desarrollo de la industria agroalimentaria pasan de forma general por dos ejes fundamentales: la seguridad y la calidad de los alimentos. La cada vez mayor complejidad de la cadena alimentaria exige, por otra parte, el desarrollo de eficaces sistemas de trazabilidad que aseguren la solidez de todos los eslabones. Tanto el VI Programa Marco de la Unión ACTUALMENTE LOS BIOSENSORES NO SON PATRIMONIO EXCLUSIVO DE LA INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA. LA INDUSTRIA ALIMENTARÍA DEMANDA MÉTODOS RÁPIDOS PARA ESTIMAR LA IDENTIDAD, LA CADUCIDAD, EL DETERIORO O LA CONTAMINACIÓN DE LOS ALIMENTOS Europea a través de su Prioridad temática de Calidad y Seguridad de los alimentos, como el Plan Nacional de Ciencia y Tecnología a través de sus programas nacionales de Biotecnología y Recursos y Tecnologías Agroalimentarias, recogen la necesidad de desarrollar e implantar sistemas de control encaminados a aumentar la seguridad y la calidad de los alimentos y a mejorar los sistemas de trazabilidad, que se define como la capacidad de rastrear un alimento, desde sus orígenes hasta al consumidor, dando lugar a una identificación fiable de sus componentes, un control sanitario y un seguimiento del alimento en toda la cadena de producción. Para poder cumplir con estos programas preventivos, se establece como prioridad el desarrollo de métodos de detección, de análisis y diagnóstico que sean rápidos, de alta sensibilidad y que permitan el análisis automatizado de un amplio espectro de agentes que amenazan la salud humana. Los contaminantes alimentarios y medioambientales pueden agruparse de acuerdo a su origen y naturaleza. Esencialmente, se pueden clasificar en contaminantes microbiológicos (bacterias, virus y parásitos), material exógeno, toxinas naturales, y otros compuestos químicos tales como pesticidas, metales tóxicos, dogas y residuos veterinarios, entre otros muchos. Algunos contaminantes alimentarios provienen de fuentes naturales del medioambiente, mientras que otros son aditivos agregados deliberadamente. De la misma forma que la detección y el control de aditivos tuvieron su importancia con anterioridad, en la actualidad la mayor problemática en salud alimentaria lo constituyen las contaminaciones microbiológicas, seguidos de los pesticidas y los residuos de medicamentos en productos animales, así como resistencia a antimicrobianos. No son pocos los consumidores preocupados por el impacto a largo plazo del consumo crónico de aditivos químicos (tales como pesticidas, metales tóxicos, residuos de drogas veterinarias, saborizantes, colorantes y conservantes), así como los efectos agudos en grupos vulnerables. Las metodologías de análisis de contaminantes en alimentos deben ser capaces de llegar a detectar concentraciones en el orden de µg/kg o inferiores. Los métodos analíticos instrumentales convencionales consisten en HPLC, cromatografía de gases y electroforesis capilar y se basan en las siguientes etapas: I) toma de muestra; II) tratamiento; III) extracción; IV) purificación; V) análisis cromatográfico y, VI) obtención de resultados. Además de métodos instrumentales de análisis, en el caso de antibióticos en leche o carne se pueden llevar a cabo ensayo microbiológicos que se basan en la de inhibición del crecimiento bacteriano debida a la presencia del antibiótico. FARMESPAÑA INDUSTRIAL NOVIEMBRE/DICIEMBRE06 69

3 Biotecnología Los ensayos inmunológicos representan una alternativa de screening rápida y fiable. En las últimas décadas, la detección inmunológica de bacterias, células y esporas, virus y toxinas, y pequeñas moléculas orgánicas ha comenzado a ser cada vez más sensible, específica, y reproducible. Así, cada vez se encuentran en el mercado más kits basados en la detección inmunológica. La detección de ácido nucleicos de microorganismos patógenos es cada vez más específica y sensible que los métodos inmunológicos. El desarrollo de técnicas de amplificación in vitro del DNA -tal como es la PCR- ha contribuido de manera decisiva a aumentar la sensibilidad y selectividad de los ensayos basados en ácidos nucleicos. Estos métodos tienen ventajas distintivas sobre los métodos de cultivo e inmunológicos tales como una mayor especificidad, la sensibilidad, la rapidez y la capacidad de detectar pequeñas cantidades de ácido nucleico en una muestra. Además son capaces de detectar varios patógenos simultáneamente en un único ensayo. Un problemas asociado es que el DNA puede permanecer intacto en alimentos procesados, en forma libre o presente en bacterias muertas pudiendo dar su amplificación y posterior detección resultando falsos positivos. Este método requiere, por tanto, un período de enriquecimiento que retrasa los resultados pero que asegura la sensibilidad al orden de 3 UFC por 25 g de alimento. Para certificar la seguridad alimentaria, los laboratorios de control oficiales deberían ser capaces de procesar un gran número de muestras en un período corto de tiempo. De acuerdo con estos requerimientos, es de importancia el desarrollo de nuevas técnicas rápidas, económicas, sensibles y capaces de realizar medidas de campo, cuyo resultado pueda ser usado como alarma para la detección rápida del riesgo de contaminación. Debido a sus características, los biosensores se constituyen en los principales candidatos y herramientas de análisis con numerosas aplicaciones en la industria agroalimentaria, control medioambiental y salud humana. Las características más destacables de estos dispositivos que los convierten en opciones altamente atractivas son: I) su especificidad, II) alta sensibilidad, III) corto tiempo de análisis, IV) capacidad de inclusión en sistemas integrados, V) facilidad de automatización, vi) capacidad de trabajar en tiempo real, VI) versatilidad, que permite el diseño de dispositivos a la carta, y su bajo coste: VII) no destructivos, lo que permite el control de procesos in situ, VIII) no contaminantes, amigables con el medioambiente. Sensores químicos y biosensores Si queremos imaginar como funciona un sensor, debemos tener en cuenta que está formado por dos partes. Una de dichas partes es el denominado elemento de reconocimiento molecular o receptor que interacciona con un determinado componente de la muestra, el que se quiere determinar, de manera específica, es decir, sin que el resto de la muestra interfiera en la medida. El otro componente, se conoce como transductor (Figura 2). Cuando el componente que se busca determinar en la muestra compleja interacciona con el receptor LA INVESTIGACIÓN Y EL DESARROLLO DE LOS SENSORES QUÍMICOS ESTÁN DIRIGIDOS PRINCIPALMENTE A LA OBTENCIÓN DE RECEPTORES CADA VEZ MÁS SELECTIVOS DE MOLÉCULAS del sensor, se produce un cambio que es detectado por el transductor y transformado en una señal eléctrica que es medida por un instrumento. Esta configuración tan simple de reconocimiento y transducción es la que ha permitido el diseño de una instrumentación con características prácticas e innovadoras en el campo del análisis. Mediante este esquema analítico tan sencillo fue posible eliminar numerosas etapas necesarias en un proceso analítico convencional tales como el tratamiento de la muestra o la separación del componente que se quiere determinar del resto de la muestra, que complican un procedimiento clásico de análisis basado en equipamiento analítico tradicional. Un aspecto fundamental de este diseño es la generación de una señal suficientemente intensa entre el componente que se desea analizar (el analito) y el receptor selectivo de éste o elemento de reconocimiento. Mientras más simple y confiable sea el proceso de reconocimiento, más lo será el dispositivo resultante. Los demás aspectos asociados al proceso y al sensor, como la conversión (transducción) de las señales, su procesamiento y transmisión son igualmente importantes pero ya poseen un tratamiento mucho más desarrollado y efectivo gracias a los adelantos constantes y continuos de la micro y optoelectrónica. La investigación y el desarrollo de los sensores químicos están dirigidos principalmente a la obtención de receptores cada vez más selectivos de moléculas. También es necesario inmovilizar los receptores sobre los transductores más adecuados, sin que unos ni otros pierdan sus características funcionales. Hay todo un espectro de posibilidades de inmovilización de receptores sobre los transductores, desde inmovilizaciones simples por adsorción, retención del receptor en geles o membranas poliméricas, o por entrecruzamiento de los receptores entre sí mediante agentes bifuncionales, hasta inmovilizaciones más complejas por unión química entre el receptor y el transductor. Por otro lado, existe un abanico de posibilidades en el desarrollo de nuevos transductores mediante nuevos materiales de complejidad creciente. De todas formas, los esfuerzos se dirigen hacia el diseño de nuevos materiales de reconocimiento suficientemente selectivos. Los elementos de reconocimiento o receptores de naturaleza sintética presentan un grado de reconocimiento limitado. A pesar de esto se consiguen cada vez más materiales adecuados para el desarrollo de sensores en aplicaciones muy concretas. Esta limitación hizo que se consideraran como elementos de reconocimiento los receptores de naturaleza biológica o biorreceptores, para la construcción de transductores con materiales biológicos de reconocimiento molecular, mucho más selectivos que los de naturaleza sintética. Estos sensores químicos que incorporan materiales biológicos en su construcción se conocen como biosensores. Un biosensor es un sensor químico cuya parte receptora está constituída por material biológico para el reconocimiento molecular de la muestra. Receptores y transductores El componente receptor de un sensor químico transforma selectivamente determinada información química contenida en una muestra en una forma de energía susceptible de ser medida por el transductor. El componente transductor es un elemento capaz de 70 NOVIEMBRE/DICIEMBRE06 FARMESPAÑA INDUSTRIAL

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5 Biotecnología FIGURA 3. La interacción de dos hebras de ADN (constituyente principal del genoma de organismos vivos), o de un anticuerpo con su antígeno específico (constituyente principal del sistema inmune), o de una enzima con su correspondiente sustrato (efectoras biológicas más importantes mediante la catálisis de reacciones bioquímicas a nivel celular) son algunos modelos de interacciones biológicas en las que se inspiran los biosensores. EN LA ACTUALIDAD SE ESTÁN UTILIZANDO ELEGANTES PROCEDIMIENTOS SINTÉTICOS DE ARQUITECTURA MOLECULAR PARA LA OBTENCIÓN DE REACTIVOS MUY INNOVADORES FIGURA 4: Estrategia seguida por el grupo de de Receptores Moleculares Aplicados para la producción de anticuerpos anti sulfonamida usados como biorreceptor en los biosensores electroquímico. FIGURA 7. Representación esquemática de la estrategia de detección electroquímica de sulfonamidas basada en un magneto sensor. (A) Luego de la reacción inmunológica, las partículas magnéticas modificadas con el anticuerpo específico son captadas por el sensor magnético (I). El sensor se polariza a _0.150 V (II) y se detecta electroquímicamente la señal luego de la adición de los reactivos necesarios (III).Aspecto macroscópico del sensor con las partículas magnéticas en la superficie (IV). (B) Aspecto microscópico de la superficie del sensor con las esferas magnéticas, obtenidas mediante microscopía electrónica de barrido tomada a una resolución de 0.5 (mm) (I) y 100 _m (II a IV). (C) Imagen del prototipo desarrollado para medidas en el laboratorio. transformar la energía que codifica la información química procedente de la muestra en una señal analítica útil. El componente receptor puede interaccionar con el analito mediante un mecanismo físico sin que haya una reacción. Es el caso en el que se detecta la interacción mediante un cambio de absorbancia, en el índice de refracción, en la conductividad, en la temperatura o en la masa. Más común es que el receptor reconozca al analito mediante una reacción química o bioquímica. Se conoce la selectividad limitada de la mayoría de las reacciones utilizadas en el análisis químico, que obliga a tratar previamente la muestra a fin de eliminar las interferencias. Este hecho ha ocasionado que sólo un número reducido de reacciones químicas sean aprovechadas como sistemas receptores en los sensores químicos, ya que éstos se diseñan para funcionar en determinaciones directas sin tratamiento de la muestra. En la actualidad se están utilizando elegantes procedimientos sintéticos de arquitectura molecular para la obtención de reactivos muy innovadores, formadores selectivos de complejos receptor-analito (host-guest), cuando las especies implicadas se complementan en forma y dimensiones (geometría) y en grupos enlazantes (energía). Por otro lado, se sabe que el reconocimiento molecular es la base de la vida celular, de su organización y mantenimiento. La comunicación química entre células mediante sistemas moleculares complementarios es un proceso de vital importancia, responsable de la organización y la protección de organismos y de la regulación de su metabolismo. Este tipo de reconocimiento, optimizado por la evolución biológica, es el que se ha estado utilizando para el desarrollo de los biosensores. 72 NOVIEMBRE/DICIEMBRE06 FARMESPAÑA INDUSTRIAL

6 Efectivamente, las interacciones entre enzimas y sustratos o inhibidores, entre anticuerpos y antígenos o haptenos, entre diversos receptores y hormonas, fármacos y neurotransmisores y entre fragmentos de ADN han servido de modelo a variados sistemas biosensores, algunos ya comercializados (Figura 3). El Grupo de Receptores Moleculares Aplicados ha producido anticuerpos policlonales anti sulfonamidas de clase, así como anti atrazina, luego del diseño y síntesis de los haptenos inmunógenos, preservando la geometría, la conformación, y la distribución electrónica del analito (Figura 4). Estas moléculas son receptores específicos ideales para biosensores. Metodologías y tecnologías La determinación de componentes en medios complejos mediante sensores y biosensores se ha promovido extensamente debido a su simplicidad. En algunos casos son los mismos laboratorios quienes construyen sus propios sensores para aplicaciones muy particulares. Los sensores y biosensores son ideales para ser utilizados en mediciones directas, es decir, sin un tratamiento preliminar de la muestra. Son particularmente adecuados en los procesos industriales, sin necesidad de tomar muestras, in situ. Por ser portátiles y robustos, los sensores químicos también son apropiados en mediciones de procesos, junto a reactores industriales o en circunstancias especiales. Los sensores pueden conectarse de algún modo con el proceso a seguir o controlar muestras en forma continua. Es LOS SENSORES Y BIOSENSORES PRETENDEN SER DISPOSITIVOS CUYA FABRICACIÓN SE REALICE DE FORMA MASIVA A MUY BAJO COSTE decir, el sensor está acompañado de un sistema de toma de muestra automatizado. Los sensores y biosensores pretenden ser dispositivos cuya fabricación se realice de forma masiva a muy bajo coste. Así, con una fabricación económica, estos dispositivos podrían ser de uso personal y desechables, es decir, de usar y tirar. Por lo tanto, la investigación y desarrollo de los sensores químicos y biosensores va también dirigida hacia diseños compatibles con tecnologías que posibiliten una gran producción de dispositivos a bajo coste. En este sentido tiene una gran importancia el hecho de que los sensores se puedan desarrollan con tecnologías planas, de capas delgadas microlitográficas, como las que se utilizan en la fabricación de dispositivos microelectrónicas y en circuitos impresos. Eventualmente pueden construirse sensores de capas gruesas que no requieren inversiones muy elevadas, como los producidos con técnicas serigráficas Biosensores electroquímicos para el análisis rápido de residuos de antibióticos, pesticidas y bacterias patógenas en muestras agroalimentarias y medioambientales El Grupo de Sensores y Biosensores, en colaboración con el Grupo de de Receptores Moleculares Aplicados, ha diseñado un sistema electroquímico para la detección de sulfonamidas en leche, basados en una reacción inmunológica competitiva. Para tal fin, los anticuerpos específicos de clase anti-sulfonamidas se inmovilizaron covalentemente en partículas magnéticas modificadas con grupos tosil. El ensayo inmunológico competitivo se basó en la competencia entre el antibiótico en la muestra y un conjugado enzimático, diseñado y sintetizado por el Grupo de Receptores Moleculares Aplicados. Finalmente, la cantidad de antibiótico se detecta mediante una estrategia electroquímica de manera muy sensible, en un esquema que se muestra en la Figura 7. El uso de las partículas, sumado a las propiedades electroquímicas mejoradas del biosensor y al diseño apropiado del receptor molecular, hacen posible la detección del antibiótico en concentraciones 100 veces por debajo de los límites requeridos por UE (100 ppbs), en leche entera. Por otro lado, el hecho de utilizar partículas magnéticas permite eliminar el efecto matriz mediante la simple dilución de la leche 4 veces en una solución amortiguada de fosfato, tratamiento muy fácil de realizar. Los primeros prototipos han demostrado tener una excelente sensibilidad (1 ppbs), y unas excelentes características para la determinación de antibióticos fuera del ámbito del laboratorio, por ser de uso simple, capaces de ser operados por personal no entrenado, y de bajo coste. LAS PERSPECTIVAS FUTURAS SE DIRIGEN AL DISEÑO DE ESTRATEGIAS BASADOS EN BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS ENFOCADOS AL DIAGNÓSTICO DE PATOLOGÍAS EN HUMANOS Y DIAGNÓSTICO GENÉTICO Un ensayo similar se realizó para la detección de atrazina en zumo de naranja y aguas superficiales y embotelladas, que demostraron excelentes límites de detección, 6 ng L- 1, en zumo de naranja, muy por debajo del límite establecido por la Uniòn Esuropea (0.1 µg L-1) con un sistema electroquímico basados en una reacción inmunológica competitiva. Para tal fin, los anticuerpos específicos de clase anti-atrazina se inmovilizaron covalentemente en partículas magnéticas modificadas con grupos tosil. El ensayo inmunológico competitivo se basó en la competencia entre el pesticida en la muestra y el conjugado enzimático, diseñado y sintetizado por el Grupo de Receptores Moleculares Aplicados. Finalmente, la cantidad de pesticida se detecta mediante una estrategia similar a la que se muestra en la Figura 7. En el caso del zumo de naranja el tratamiento también es muy sencillo y consiste en la filtración y en la dilución. Asimismo, se han diseñado estrategias de detección rápida de bacterias patógenas, tales como Salmonella y E coli, basado en su material genético y con detección electroquímica. Se han diseñado unos metodologías de amplificación del material genético usando primers magnéticos, que podrían ser integrados a termocicladores para la detección electroquímica de la amplificación a tiempo real. Las perspectivas futuras se dirigen al diseño de estrategias basados en biosensores electroquímicos enfocados al diagnóstico de patologías en humanos y diagnóstico genético, investigación que se realizará en el GSB con el apoyo de la empresa ADF Tecnogen/Circagen. FARMESPAÑA INDUSTRIAL NOVIEMBRE/DICIEMBRE06 73