Estudio exploratorio para el establecimiento del cultivo in vitro de especies de helechos silvestres con potencial ornamental

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS Departamento de Biotecnología Estudio exploratorio para el establecimiento del cultivo in vitro de especies de helechos silvestres con potencial ornamental T E S I S Que para obtener el grado de Maestro en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos P R E S E N T A Biól. JOSÉ ALICVAJAN DÍAZ ESPINOZA DIRECTORA: Dra. SILVIA EVANGELISTA LOZANO Yautepec, Morelos. Noviembre del 2007

2 Imagen de Portada El "koru" es un símbolo Maaori (de Nueva Zelanda). El "koru" es simplemente la fronda nueva de un helecho, que se desarrolla para ser una hoja del helecho. Sin embargo, se considera que el Koru se extiende para alcanzar la luz, esforzándose para tener perfección, y fomentando nuevo crecimiento. El Koru representa el desarrollo de una nueva vida, con la esperanza del futuro, pero también la necesidad de esfuerzo para lograr crecimiento y perfección.

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6 Este trabajo de investigación constituye uno de los objetivos planteados en los proyectos CGPI , y apoyados por el Instituto Politécnico Nacional y por el proyecto Transferencia de tecnología en la propagación de Bouganvillea glabra Choise y otras ornamentales apoyado por la Fundación Produce Morelos y dirigidos por la Dra. Silvia Evangelista Lozano. Para la realización de los estudios de Maestría se contó con las becas CONACYT (BO40677), PIFI (Programa Institucional de Formación de Investigadores) y Beca- Tesis del IPN. El trabajo experimental de esta tesis se realizo en el Departamento de Biotecnología Vegetal del CEPROBI-IPN (en los Laboratorios de Cultivo de Células y Tejidos Vegetales y de Propagación ex vitro), bajo la dirección de la Dra., Silvia Evangelista Lozano. Así también parte de este trabajo se desarrollo en áreas de otras instituciones: en la Unidad de Laboratorio de Micropropagación del Centro de Desarrollo Tecnológico Tezoyuca del FIRA, con la asesoría del Biol. Ricardo Flores Olascoaga y en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos de la Unidad de Biotecnología y Prototipos de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala de la UNAM, bajo la asesoría del Dr. Ernesto Aguirre León.

7 EN SILENCIO Aquí estoy en la guerra de emociones aquí estoy sin dolor ni pasión, respirando soledad, leo en libro, libertad en dibujos animados describiendo todo y nada de mí. Reverberación, hay una razón, late en mi corazón una canción en un vuelo sin límites en un vuelo sin límites Quiero cantar sin límites quiero volar sin límites quiero vivir sin límites y en silencio... recordar... recordar DEDICADO A: Alfredo Díaz Ordaz JADE, JADEITO, JADEITA, JADEITOA, JADEIS, JADEISIMO, FERNSITO. LA MEJOR MA DEL MUNDO QUE ES LA MIA: TODO LO HAGO POR USTED, EL ÚNICO SER QUE NUNCA, NUNCA DEJARA DE AMARME, AQUÍ ESTA Y ESTARA POR SIMEPRE SU MIJO. MIS HERMANAS BÉLGICA (TE EXTRAÑO MUCHO) Y DALIA, POR SU APOYO EN TODO LO QUE HAGO. ROSENDO Y FERNADO, POR SU APOYO MORAL. MIS SOBRINOS: IVAN (FLAKITO), YAO, VANEZA Y XAVIERO. Y A EL ESPOSO DE MI HERMANA: GERARDO. RMVM FLPH (HAND ON YOUR HEART) Y RTH (TRULY MADLY DEEPLY). FALTA LA TERCERA R, POR QUE JJEH Y JAA NO EMPIEZAN CON R. THALIA, MADONNA Y KYLIE MINOGUE.

8 AGRADECIDO CON: DRA. SILVIA EVANGELISTA LOZANO, SOLO PUEDO DECIRLE: GRACIAS POR ENSEÑARME A SER UN TECNOLOGO, POR ADENTRARME AL MUNDO ORNAMENTAL, POR SU CONFIANZA, POR EL CARIÑO DEMOSTRADO, MIL GRACIAS!!! DRA. MA. DE LA LUZ ARREGUIN SANCHEZ POR LOGRAR SACAR MI GUSTO NATURAL POR LO HELECHOS, POR GUIARME EN LA LICENCIATURA Y TAMBIEN EN LA MAESTRIA, POR CONFIAR EN MI. MIS AMIGOS DE TODA LA VIDA (CASI): RUBEN, CARMEN Y EMANUEL, CON USTEDES HE CRECIDO DEMASIDO COMO PERSONA. MIS AMIGOS DE LA LICENCIATURA Y QUE LO SIGUEN SIENDO (QUE AGUANTE): AYAX Y LILIA, GRACIAS POR ESTAR CONMIGO, A PESAR DE MIS TROPIEZOS. MIS AMIGOS QUE GANE EN LA MAESTRÍA: MISS KAROLITA (MANITA), JORGE (PAPI), DENISSE (SOCIA: Deniptera mortis) Y SAN JOSÉ (SANTO, SANTO ES EL SEÑOR). A QUE NO HABIAN CONOCIDO ALGUIEN TAN CHOCOSITO COMO YO. ROGER (MANITO): GRACIAS POR SER MI AMIGO Y ENSEÑARME TODO MORELOS. MIS COMPAÑEROS DE MAESTRÍA, DOCTORADO Y PERSONAL DEL CEPROBI: SEÑORA GABY, MINE BONITA (JA), ALEJO (AMIGOO), J GO (EX AMIGA COMPARTIDA), ANGEL (ESCARABAJITO VERACRUZANO), NORMA (YA NO ME REGAÑES), PLÁCIDO (PhaseolusitoI), LINO (PhaseolusitoII), TOÑITA, SANDRA, MARIA LUISA, ARACELI. LOS MEJORES PROFESORES DE LA MAESTRIA (SEGÚN YO): DR. ARZUFFI (GRACIAS POR LA CONFIANZA, VALE MIL!!!) Y DRA. ISABEL (SUPER SUS CLASES). LOS PROFESORES QUE ME APOYARON EN LO ACADEMICO: DR. ANTONIO, DRA. MARTHA Y DR. ALFREDO. BIÓL. RICARDO FLORES OLASCOAGA, POR TODO EL APOYO EN LA ÚLTIMA FASE DE LA TESIS. EL COMITÉ REVISOR DE LA TESIS LA COMUNIDAD MAS DIVERSA DEL CEPROBI: ARNOLD (SEÑOR), PABLO (SEÑOR DR.), FERCHITO Y GUS (MAMI!!!).

9 ÍNDICES, RESUMEN-JADE Í N D I C E CAPÌTULO PÁGINA ÍNDICE DE CUADROS. iii ÍNDICE DE FIGURAS. iv LISTA DE ABREVIATURAS Y SIMBOLOS. vi RESUMEN. vii ABSTRACT. viii 1. ANTECEDENTES Recursos Fitogenéticos de México: el caso de las plantas ornamentales La Horticultura Ornamental Sustratos en horticultura ornamental Fuentes de propágulos en horticultura ornamental Comercialización de las plantas ornamentales en el país Los helechos como plantas ornamentales Comercialización de helechos ornamentales en la zona centro-sur 4 de México Los helechos ornamentales en el Estado de Morelos Los helechos silvestres de Morelos con potencial ornamental División Pteridophyta divis. J.Y. Bergen & B.M. Davis Los Helechos Distribución Morfología Ciclo Biológico Descripción de las especies en estudio Familia Aspleniaceae fam. Newman Género Asplenium L Asplenium muenchii A.R. Sm Asplenium sessilifolium Desv., Ges Familia PTteridaceae fam. E.D.M. Kirchn Género Adiantum L Adiantum poiretii Wikstr Germinación y viabilidad de esporas Propagación de helechos Propagación in vitro Cultivo de tejidos vegetales Propagación in vitro de helechos Germinación de esporas in vitro Uso de explantes vegetativos in vitro JUSTIFICACIÓN E HIPÓTÉSIS OBJETIVOS MATERIALES Y METÓDOS Selección del sitio de colecta para la elección de las especies en 22 estudio, con base a antecedentes de tipos de vegetación y de pteridoflora del Estado de Morelos Descripción del sitio de colecta y abundancia de las especies en 22 estudio Colecta de esporas y especimenes de las especies en estudio para 26 fuentes de propágulos, aclimatización y herborización. i

10 ÍNDICES, RESUMEN-JADE CAPÌTULO PÁGINA 4. MATERIALES Y METÓDOS 4.4. Desinfección de esporas Medio de cultivo y del sustrato adecuado para la germinación de esporas 30 in vitro Evaluación de la viabilidad de esporas Desinfección y medio de cultivo adecuado para prefoliaciones y yemas 35 apicales foliares in vitro. 5. RESULTADOS Abundancia de las especies en estudio Colecta de esporas y especimenes de las especies en estudio para 41 fuentes de propágulos, aclimatización y herborización Desinfección de esporas Medio de cultivo y del sustrato adecuado para la germinación de esporas 48 in vitro Evaluación de la viabilidad de esporas Desinfección y medio de cultivo adecuado para prefoliaciones y yemas 52 apicales foliares in vitro. 6. DISCUSIONES Abundancia de las especies en estudio Colecta de esporas y especimenes de las especies en estudio para 56 fuentes de propágulos, aclimatización y herborización Desinfección de esporas Medio de cultivo y del sustrato adecuado para la germinación de esporas 59 in vitro Evaluación de la viabilidad de esporas Desinfección y medio de cultivo adecuado para prefoliaciones y yemas 64 apicales foliares in vitro. 7. CONCLUSIONES Y SUGERENCIAS BIBLIOGRAFIA. 69 ANEXOS. I ANEXO 1. COMPOSICIÓN DE AGROQUÍMICOS: BACTERICIDAS I FERTILIZANTES Y FUNGICIDAS. ANEXO 2. SUSTRATOS HORTÍCOLAS. IV ANEXO 3. VARIOS. VI ii

11 ÍNDICES, RESUMEN-JADE ÍNDICE DE CUADROS NÚMERO Y NOMBRE PÁGINA Cuadro 1. Medición de las variables ambientales y el ph de los sitios de colecta. 24 Cuadro 2. Ubicación geográfica del sitio de colecta de las especies de helechos en estudio. 24 Cuadro 3. Protocolos de desinfestación de esporas de helechos. 29 Cuadro 4. Medio de cultivo MS. 31 Cuadro 5. Componentes del Medio MEI. 37 Cuadro 6. Modificaciones del MEI. 37 Cuadro 7. Abundancia-cobertura (Braun-Blanquet*), de las especies de helechos en estudio. Cuadro 8. Índice de densidad lineal (DLi) y cobertura lineal (CL), de las especies de helechos en estudio Cuadro 9. Respuesta de las plantas madre de campo a la aclimatización. 45 Cuadro 10. Evaluación del desarrollo de las prefoliaciones de las plantas madre provenientes de campo en el proceso de aclimatización. Cuadro 11. Evaluación de los protocolos de desinfestación de esporas de helechos. Cuadro 12. Índice de germinación (IG)* de las esporas de las especies de helechos en estudio en medios y sustratos. Cuadro 13. Viabilidad de las esporas de los helechos en estudio, utilizando el Reactivo de Mutzing. Cuadro 14. Evaluación de los protocolos de desinfestación de prefoliaciones y yemas foliares iii

12 ÍNDICES, RESUMEN-JADE ÍNDICE DE FIGURAS NÚMERO Y NOMBRE Figura 1. Principales géneros de helechos silvestres con potencial ornamental del Estado de Morelos (Díaz Barriga, 1995; Riba et al., 1996). Figura 2. Géneros representativos de las principales Clases de la División Pteridophyta: A. Psilotum, B. Lycopodium, C. Equisetum y D. Polypodium. Figura 3. Esquema de la especie Dryopteris filis-max (L.) Schott., en donde se aprecian las principales partes de un helecho: A. Fronda, B. Prefoliaciones, C. Rizoma, D. Raíces, E. Soros y F. Esporangios (Fuente: Figura 4. Ciclo homospórico, el más común en los helechos. (Fuente: Figura 5. Imágenes que muestran la fisonomía de uno de los sitios de colecta: Barranca Agua Bendita, Ocuituco, Morelos. A. Pendiente; B. Fondo. Figura 6. Imágenes de los equipos usados en campo para determinar temperatura, humedad relativa e intensidad luminosa. A. Higrotermómetro, B. Cuántometro y C. Sensores de los equipos. Figura 7. Mapa del Estado de Morelos en donde se muestra el sitio de las colectas realizadas (GoogelEarth, 2006). PÁGINA Figura 8. Transecto realizado en campo para Asplenium muenchii A. R. Sm. 40 Figura 9. Fronda de un individuo de Adiantum poiretii Wikstr. A. Fronda, B. Pinna y C. Raquis. Figura 10. Aspecto general de un individuo de Asplenium muenchii A.R. Sm. A. Fronda, B. Pinna y C. Raquis. Figura 11. Aspecto general de un individuo de Asplenium sessilifolium Desv., Ges. A. Fronda, B. Pinna y C. Raquis. Figura 12. Proceso de aclimatización en cámara de cultivo de individuos de Asplenium muenchii A. R. Sm. A. Planta colocada en maceta, B. Bolsa de polipapel cubriendo a la planta y C. Disposición final de las plantas en la cámara de cultivo. Figura 13.. Prefoliaciones en diferentes estados de crecimiento en plantas de Adiantum poiretii Wikstr: A. Estado de crecimiento 1; B. Estado de crecimiento 2; C. Estado de crecimiento 4 y D. Estado de crecimiento 6 (con base a la escala de Strandberg, 2003) iv

13 ÍNDICES, RESUMEN-JADE NÚMERO Y NOMBRE Figura 14. Formación de gametofitos, como resultado de la germinación de las esporas, en medios de cultivo semisólidos y en sustratos hortícolas: A. Gametofitos de Adiantum poiretii Wikstr en medio MS; B. Gametofitos de Asplenium sessilifolium Desv. creciendo en medio MS; C. Gametofitos de Asplenium muenchii A. R. Sm en agrolita y D. Gametofitos de Asplenium sessilifolium Desv. sobre vermiculita. Figura 15. Imágenes de la esporas sometidas al reactivo de Mutzing: A. Espora no viable de Asplenium muenchii A. R. Sm. (10X), B. Espora no viable de Asplenium sessilifolium Desv.(40X) y C. Espora viable de Asplenium sessilifolium Desv. (40X) 1. Perisporio, 2. Exosporio, 3. Endosporio y 4. Célula germinal. PÁGINA v

14 ÍNDICES, RESUMEN-JADE LISTA DE ABREVIATURAS Y SIMBOLOS. % porcentaje µmol.m -2 s -1 micromoles por metro cuadrado sobre segundo 2,4-D ácido 2,4-diclorofenoxiacético 2n diplóide;dos juegos de cromosomas AG ácido giberelico ANA ácido naftanelacético. BA bencil aminopurina. cm. centímetros FIRA Fideicomisos Instituidos en Relación con la Agricultura. g gramos. GPS Global Positioning System (Sistema de Posicionamiento Global). ha hectárea HCl acido clorhídrico HR humedad relativa. I Intensidad luminosa IAA ácido indol acético. IB acido indol butirico IG índice de germinación INEGI Instituto Nacional de Estadística, Geografia e Informática. kg kilogramo KIN cinetina L litro lb/kg libras sobre kilogramos m 2 metros cuadrados mg miligramos. min minutos ml mililitros mm milímetros MS medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962). n haploide; un solos juego de cromosomas N normalidad NaOCl hipoclorito de sodio. NaOH hidróxido de sodio o C grados centígrados ph potencial de hidrogeniones rpm revoluciones por minuto. T temperatura v/v Volumen sobre volumen µs micro siemens por metro vi

15 ÍNDICES, RESUMEN-JADE R E S U M E N. La industria de la Horticultura Ornamental, representa una buena fuente de empleos, ya sea de manera directa e indirecta, siendo los Estados de Puebla, México, Michoacán, Morelos y Sinaloa los que cuentan con mayor producción y superficie cultivada de plantas ornamentales (Mundo, 2006). En el caso de los helechos ornamentales en México se manejan alrededor de 20 géneros, que incluyen 33 especies y 35 variedades; siendo los géneros más comercializados Adiantum, Asplenium, Blechnum, Cyathea, Davallia, Nephrolepis, Pteris, Platycerium y Rumorha. Morelos es un Estado reconocido por la producción de plantas ornamentales, entre ellas los helechos, es el principal proveedor de helechos para la zona centro-sur del país (Cabrera y Orozco, 2003); estos se importan in vitro o en charolas, y el acondicionamiento final (aclimatización) se lo dan los productores (Flores, 2006). En Morelos se reportan especies de helechos silvestres, que cuentan con características arquitectónicas, con las que podrían ser considerados con potencial ornamental (Díaz, 1995; Riba et al., 1996; Red de Ornamentales, 2006), destacando los géneros Thelypteris, Asplenium, Adiantum, Cheilanthes, Pellaea y Pteris; en este trabajo se aporta información de tres especies silvestres colectadas in situ: Adiantum poiretii Wikstr, Asplenium muenchii A. R. Sm. y Asplenium sessilifolium Desv. relacionada con la abundancia; germinación de esporas tanto en medios de cultivos como en sustratos hortícolas in vitro, con la implementación del protocolo de desinfestación y pruebas de viabilidad; aclimatización de plantas colectadas en campo; así también, información sobre protocolos para desinfestación y medio de cultivo para prefoliaciones y yemas apicales foliares in vitro. vii

16 ÍNDICES, RESUMEN-JADE A B S T R A C T. The industry of the Ornamental Horticulture, is a good source of jobs, either directly or indirectly, with the states of Puebla, Mexico, Michoacan, Morelos and Sinaloa those with higher production and area under cultivation of ornamental plants (Mundo, 2006). In the case of ornamental ferns in Mexico are handled around 20 genera, including 33 species and 35 varieties; being marketed more genres: Adiantum, Asplenium, Blechnum, Cyathea, Davallia, Nephrolepis, Pteris, Platycerium y Rumorha. Morelos is a State recognized by the production of ornamental plants, including ferns, is the leading provider of ferns for the central area of the country (Cabrera y Orozco, 2003); these are imported in vitro or in trays, and the fitting end (acclimatization) will give producers (Flores, 2006). In Morelos reported species of wild ferns, which have architectural features, which might be considered ornamental potential (Díaz, 1995; Riba et al., 1996; Red de Ornamentales, 2006), stressing gender Thelypteris, Asplenium, Adiantum, Cheilanthes, Pellaea y Pteris; this paper provides information collected in situ three wild species Adiantum poiretii Wikstr, Asplenium muenchii A. R. Sm. y Asplenium sessilifolium Desv. related abundance; germination of spores both in culture media as horticultural substrates in vitro, with the implementation of the protocol and testing disinfection feasibility; acclimatization of plants collected in the field, and also, information about protocols for disinfection and a half crop prefoliaciones and apical leaf buds in vitro. viii

17 ANTECEDENTES-JADE 1. A N T E C E D E N T E S Recursos fitogenéticos de México: el caso de las plantas ornamentales. El potencial ornamental que tiene nuestro país no se ha aprovechado en toda su magnitud, especialmente por sectores de la sociedad que cuentan con los recursos fitogenéticos. Galicia (1995), Leszczyñska y Borys (2001), Ortega et al. (2000), Mejía y Espinosa (2003), exponen la importancia de las plantas ornamentales cultivadas, nativas cultivadas o con potencial de ser cultivadas. Rzedowski (1995) menciona que en el ámbito mundial México ha aportado alrededor de 40 especies ornamentales de gran importancia. Así en un muestreo de catálogos de horticultura de diferentes países, se detectaron 600 especies mexicanas que se ofrecen a la venta (Red de Ornamentales, 2006). Además, existe un importante grupo de plantas que no aparecen en los catálogos, pero son de uso consistente (que se siembran en los jardines, calles, huertos familiares del país y que son plantas nativas), muchas de ellas en etapas avanzadas de selección, por ejemplo: fresno (Fraxinus uhdei -Wenz.- Lingelsh.), colorín (Erytrina americana Mill), cedro blanco (Cupressus lusitanica Mill.), tigridia o cacomite (Tigridia pavonea (L. f.) DC.), entre otras (Red de Ornamentales, 2006) La Horticultura Ornamental. Una rama de la agricultura la constituye la horticultura ( hortus : jardín; cultura : cultivar), que su vez se divide en olericultura, fruticultura, especicultura y ornamenticultura, esta última llamada también Horticultura Ornamental, que se define como un sistema de producción y comercialización de especies vegetales que tienen un valor estético o decorativo (Mundo, 2006). 1

18 ANTECEDENTES-JADE Se considera que el valor del comercio internacional de las plantas ornamentales puede oscilar entre 5,000 y 10,000 millones de dólares por año, independientemente del valor del comercio interno de cada país (Mundo, 2006) Sustratos en horticultura ornamental. El término sustrato que se aplica en la producción viverística, se refiere a todo material sólido diferente del suelo que puede ser natural o sintético, mineral u orgánico y que colocado en un contenedor, de forma pura o mezclado, permite el anclaje de las plantas a través de su sistema radicular; el sustrato puede intervenir o no en el proceso de nutrición de la planta. Esto último clasifica a los sustratos en químicamente inertes como la agrolita y roca volcánica; y químicamente activos como la turba y la corteza de pino (Pastor, 1999). Las características de los sustratos son: A. Características físicas. Determinadas por la estructura interna de las partículas, su granulometría y el tipo de empaquetamiento: densidad real y aparente, distribución granulométrica, porosidad y aeración, retención de agua, permeabilidad, distribución de tamaños de poros y estabilidad estructural. B. Características químicas. Definidas por la composición elemental de los materiales, estas caracterizan las transferencias de materia entre el sustrato y la solución del mismo: capacidad de intercambio catiónico, ph, capacidad tampón, contenido de nutrimentos y relación C/N. D. Características biológicas. Se refiere a las propiedades dadas por los materiales orgánicos: contenido de materia orgánica y estado y velocidad de descomposición (Abad, 1997; Florián, 1997; Pastor, 1999). En general los requerimientos que un sustrato debe tener son: elevada capacidad de retención de agua fácilmente disponible, elevada aireación, baja densidad aparente, elevada porosidad, baja salinidad, elevada capacidad tampón, baja velocidad de descomposición, estabilidad estructural, reproductividad y disponibilidad, bajo costo y fácil manejo (mezclado, desinfección, entre otras) (Pastor, 1999). 2

19 ANTECEDENTES-JADE Fuentes de propágulos en horticultura ornamental. Dentro de los materiales necesarios para la propagación de plantas ornamentales esta precisamente la planta que servirá como fuente de propágulos, es decir, la planta madre. Esta se considera un individuo seleccionado por sus cualidades estéticas y de productividad, que puede ser un cultivar establecido o ejemplares silvestres; además, preferentemente debe estar libre de infecciones (Ávila y Pereyra, 2005). Para el cultivo in vitro una planta madre, además de cumplir con las características arriba señaladas, debe proveer explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado, por lo que deben de mantenerse semanas o meses, en condiciones de invernadero, cuidando la calidad sanitaria y nutricional, y de ser posible, el fotoperíodo y la irradiancia (Olivera, 2005; A pesar de que son importantes cuando se inicia un programa de propagación in vitro la información encontrada en la literatura es poca, en el caso concreto de los helechos se tienen reportes del manejo agronómico de plantas madre (Hvoslef-Eide, 1991a, 1991b y 1992; Nowak et al., 2002), de un cultivar ya establecido como ornamental: Bostonienis de la especie Nephrolepis exaltata (L.) Schott. El tener una cantidad adecuada de plantas madre, ya aclimatizadas, permitió que estos estudios exploraran los efectos de la temperatura, la irradiancia, el fotoperíodo y la fertilización nitrogenada, sobre la calidad de los explantes (puntas del rizoma) para la propagación in vitro Comercialización de las plantas ornamentales en el país. En México existe un gran número de especies nativas ornamentales; sin embargo, en la industria hortícola se produce y comercializa de manera dominante las especies introducidas, descuidando el potencial fitogenético que existe en el país. La preferencia de las empresas hortícolas a producir solo las especies de origen de otros países se debe a la falta de promoción y conocimiento de especies nativas, la 3

20 ANTECEDENTES-JADE posibilidad de obtenerlas ya mejoradas y el desconocimiento de técnicas para su propagación, cultivo y manejo (Red de Ornamentales, 2006). Hasta 1998, la industria de la horticultura ornamental se basaba en una superficie de 18,090 ha y el valor de la producción era de 1, millones de dólares. Siendo Puebla, México, Michoacán, Morelos, y Sinaloa los estados con mayor producción y superficie cultivada de plantas ornamentales (Mundo, 2006) Los helechos como plantas ornamentales. El uso más reconocido para los helechos, es precisamente el ornamental, debido a que sus hojas llamativas (frondas) son populares, tanto en arreglos florales (confección de ramos, centros y composiciones florales, ya que sus frondas ofrecen una adaptabilidad a la confección de estos, como elementos centrales o complementarios); así como en jardínes y plantas de interiores (Infoagro, 2006); así también se utilizan como plantas medicinales o alimenticias (Arreguín,1987; Pacheco y Bautista,2001) Comercialización de helechos ornamentales en la zona centro-sur de México. En la parte central de México las principales empresas que comercializan helechos ornamentales son: Stigma (Stigma, 2006) y Akiko (Akiko, 2006). Estas manejan alrededor de 20 géneros, que incluyen 33 especies y 35 variedades, siendo los géneros más comercializados Adiantum, Asplenium, Blechnum, Cyathea, Davallia, Nephrolepis, Pteris, Platycerium y Rumorha. La presentación de venta es en charolas que van de las 40 a las 273 cavidades (una plántula por cavidad) y los precios oscilan de los 0.22 a los 1.05 euros, dependiendo de la especie que se trate (Stigma, 2006). Es importante mencionar que estas plántulas son de importación, principalmente de Holanda y Estados Unidos de Norteamérica. 4

21 ANTECEDENTES-JADE Los helechos ornamentales en el Estado de Morelos. Los helechos en el caso de Morelos, se producen como plantas envasadas o de maceta, destacando los géneros Nephrolepis spp., Adiantum spp., Asplenium spp., Cyrtomium spp. y Platycerium spp. (Cabrera y Orozco, 2003). Los helechos con presentación en maceta de 8 pulgadas (principalmente del género Nephrolepis de las variedades Boston, Dallas y chino), se cultivan en el 12% de los viveros de Morelos; su producción tiene un valor de $177,800 pesos, el costo del cultivo por planta es de $4 a $14 pesos, su precio de venta es de $7 a $20 pesos y el total de plantas producidas al año es de 25,400 (Cabrera y Orozco, 2003) Los helechos silvestres de Morelos con potencial ornamental. De acuerdo a Riba et al. (1996), el Estado de Morelos cuenta con 170 especies de helechos, agrupadas en 45 géneros. Con base a la arquitectura foliar (arreglo, forma y tamaño de las frondas u hojas), de las especies citadas pueden ser consideradas como potenciales plantas ornamentales de interior (Díaz, 1995) el 60%, destacando por el número de especies los géneros Asplenium, Adiantum, Polypodium, Cheilanthes, Elaphoglossum, y Thelypteris (Figura 1) Cheilanthes Polypodium Adiantum Asplenium Thelypteris Elaphoglossum Figura 1. Principales géneros de helechos silvestres con potencial ornamental del Estado de Morelos (Díaz, 1995; Riba et al., 1996). 5

22 ANTECEDENTES-JADE 1.3. División Pteridophyta divis. J.Y. Bergen & B.M. Davis. Es una división del Reino Plantae que incluye a helechos y plantas afines. El nombre proviene del griego pteris que significa helecho y phytón que significa planta (Strasburguer et al., 1994). Son vegetales que se caracterizan por no presentar flor ni semilla, es decir, son plantas pertenecientes a la Clase Cryptogamia, pero poseen tejido vascular verdadero por lo que también se les denomina criptógamas superiores (Arreguín et al., 2004). El origen de este grupo de plantas es incierto, pero se cree que se derivaron en el Devónico de líneas antiguas de algas y musgos. Se reconocen cuatro clases de pteridofitas (Figura 2), con base a sus diferencias en origen y morfología (Moran, 2006): I. Psilotpsida: incluye a los géneros Psilotum y Tmesipteris. II. Lycopodiopsida: incluye a los géneros Lycopodium y Phylloglossum. III. Equisetopsida: incluye a los géneros Isöetes, Stylites y Equisetum. IV. Polypodiopsida: considera a los helechos. A B C D Figura 2. Géneros representativos de las principales Clases de la División Pteridophyta: A. Psilotum, B. Lycopodium, C. Equisetum y D. Polypodium. Fuente:A. clavatum.jpg, C. y D. biodiversita/flora/habitat/bosco/polypodium%20vulgare%20felce%20dolce002.jpg. Estas clases pueden dividirse en subclases, ordenes y familias con base a las particularidades de su sistema de reproducción, ornamentación de la pared de la espora, el arreglo de los esporangios, entre otras características. 6

23 ANTECEDENTES-JADE Los Helechos. Clase Polypodiopsida class. Cronquist, Takht. & W. Zimm. Las Polypodiopsida constituyen los "verdaderos helechos, la clase se encuentra representada en el registro fósil desde el período Misisipiano, casi 90% de los helechos actuales pertenecen a grupos que aparecieron primero en el período Cretácico. En consecuencia, son de origen más reciente, como las angiospermas. Se reconocen entre 31 y 51 familias (Moran, 2006) Distribución. En el caso de México los helechos representan cerca del 5% de las especies de plantas vasculares en el país. Su diversidad se estima entre 1,000 y 1,100 especies pertenecientes a 110 géneros, de las que aproximadamente 190 son endémicas; en el país se encuentra alrededor de 11% del total de especies de helechos del mundo y está representado el 75% de los géneros reconocidos para América (Riba,1993; Lira y Riba, 1993). En general se considera que los helechos forman parte de casi todos los tipos de vegetación, sobre todo en zonas templadas (Rzedowski, 2006), siendo el bosque mesófilo de montaña el tipo de vegetación más rico en este tipo de plantas, le siguen el bosque tropical perennifolio, el bosque de Quercus, el bosque tropical subcaducifolio, el bosque tropical caducifolio, los matorrales xerófilos y la vegetación acuática (Riba, 1993). En Morelos se tienen registradas 158 especies y 15 variedades de helechos agrupados en 50 géneros y 21 familias (Riba et al., 1996) Morfología. Los helechos son plantas cormofitas, es decir, presentan verdaderos órganos como raíz, tallo, generalmente subterráneo llamado rizoma y hojas que comúnmente se les llama fronde (Figura 3), constituidas por lámina, pecíolo y raquis. Es característico de 7

24 ANTECEDENTES-JADE los helechos el grado de división de la lámina; así, podemos tener enteras, pinnatífidas, pinnadas, bipinnadas, tripinnadas, entre otras (Arreguín et al., 2004). B A E C F D Figura 3. Esquema de la especie Dryopteris filis-max (L.) Schott., en donde se aprecian las principales partes de un helecho: A. Fronda, B. Prefoliaciones, C. Rizoma, D. Raíces, E. Soros y F. Esporangios (Fuente: Las células reproductoras son las esporas que se originan y almacenan en estructuras multicelulares denominadas esporangios, que al agregarse conforman a los soros (Figura 2), cuya forma, tamaño y disposición varían con la especie Ciclo Biológico. Presenta alternancia de generaciones: la fase gametofítica (formadora de gametos) (n) y la fase esporofítica (formadora de esporas) (2n), que es la dominante, mientras que la gametofítica tiende a reducir su tamaño y complejidad, en la mayoría de las especies muere al momento que el cigoto-embrión comienza su desarrollo. Ambas 8

25 ANTECEDENTES-JADE generaciones pueden generar su propio alimento, realizando fotosíntesis o por medio del saprofitismo micorrízico, es decir, son fisiológicamente independientes además de que cada generación puede tener su nicho ecológico (Izco et al., 1998). El ciclo de los helechos se inicia con la formación de la espora, que al germinar dará origen al gametofito en donde se producen los arquegonios y/o los anteridios que respectivamente formarán las ovocélulas y los anterozoides (gametos femenino y masculino), que al ocurrir la fecundación formarán el cigoto-embrión, que dará origen al esporofito que al madurar contendrá frondas fértiles, donde se formarán los esporangios en los cuales se lleva a cabo la meiosis, para producir esporas con las que se cierra y se inicia el ciclo (Izco et al., 1998). En los helechos se presentan dos tipos de ciclo de vida: A. Ciclo Heterospórico: presencia de dos tipos de esporas, las megasporas que darán origen a gametofitos que formarán ovocélulas y las microsporas que originarán gametofitos que formarán anterozoides. B. Ciclo Homospórico: se presenta en la mayoría de los helechos (Polypodiopsida), se distingue por que las esporas son morfológicamente similares y originan un gametofito que formará anteridios y arquegonios (Arreguín et al., 2004) (Figura 4). Figura 4. Ciclo homospórico, el más común en los helechos. (Fuente: 9

26 ANTECEDENTES-JADE En algunas familias de helechos se presenta el fenómeno conocido como apogamia, que es la producción de un esporofito a partir de las células del gametofito, sin la fusión previa de gametos (Lincoln et al., 1995). Por lo que se considera factible, bajo condiciones de laboratorio, inducir la apogamia en gametofitos in vitro, con lo que se pretendería aumentar la producción de esporofitos Descripción de las especies en estudio Familia Aspleniaceae fam. Newman Son plantas terrestres, rupícolas o epífitas; rizoma erecto o rastrero, escamoso; pecíolo con 2 haces vasculares; nervadudas libres o anastomosadas; esporas no clorofílicas, monoletes. Con 8 géneros y aproximadamente 700 spp. Se considera una familia Cosmopolita (Moran, 2006) Género Asplenium L. Agrupa a plantas terrestres, rupícolas o epífitas, con rizoma rastrero o erecto, las raíces fibrosas; escamas presentes por lo menos en el rizoma y en la base del pecíolo, con o sin tricomas; hojas pequeñas a medianas, monomorfas, dimorfas o polimorfas, agrupadas; pecíolo brillante u opaco; lámina simple a dividida, coriácea a membranacea; yemas prolíficas ausentes o presentes en la axila de las pinnas terminales, en la punta del raquis; esporas bilaterales o globosas con perisporio reticulado-crestado y a veces equinulado, o liso, espinuloso, verrugoso o papiloso. Aproximadamente 700 spp (Adams, 2006) Asplenium muenchii A.R. Sm. Planta herbácea terrestre; con rizoma erecto o rastrero; escamas extendiéndose al pecíolo pero escasamente al raquis o pinnas; frondas x 5-11 cm, laxamente fasciculadas, ligeramente dimorfas (los segmentos de frondas juveniles más anchos); pecíolo cm x mm; lámina x 5-11 cm, hasta 3-pinnado-pinnatífida, 10

27 ANTECEDENTES-JADE elíptica; raquis mm de ancho, glabro, pardo-castaño claro a oscuro, terminado en una yema escamosa al nivel de la última pinna apical; pinnas pares, x cm, ovadas a ovado-lanceoladas, pediculadas menos de 1 mm en toda su extensión; pínnulas de las pinnas hasta 15 x 10 mm, anchamente ovadas a ovadas, alternas, delgadamente herbáceas, glabras; esporas reniforme-elipsoides, el perisporio laxo, finamente reticulado, equinulado. Especie que se encuentra en bosques templados y bosques mesófilos de montaña (Adams, 2006) Asplenium sessilifolium Desv., Ges. Sinónimos: Asplenium potosinum Heron. var. incisum Hieron; A. sessilifolium Desv. var. guatemalense Hieron. Terrestre, rupícola o epífita; rizoma erecto o ascendente; escamas extendiéndose hacia el pecíolo, alargado-deltadas a lanceolado-ovadas; frondas x cm, compactamente fasciculadas, monomorfas; pecíolo cm x mm, generalmente recto, pardo-grisáceo a pardo-púrpura, ligeramente lustroso, quebradizo; lámina x cm, 1-pinnado-pinnatífida, estrechamente elíptica a linear-oblanceolada; raquis glabrescente, ocasionalmente con una yema o plántula subterminal; pinnas pares, x cm, las medias o supramedias, oblicuamente lanceoladas, herbáceas, glabras o con tricomas glandulosos, a menudo verde oscuro, pediculadas menos de 1.0 mm a subsésiles, el ápice generalmente obtuso y dentado; esporas reniforme-elipsoides, el perisporio laxo, abiertamente reticulado, oscuramente crestado. Esta especie se encuentra en bosque de Quercus, bosque de coníferas y bosque mesófilo de montaña, entre los 1200 y 3100 msnm (Adams, 2006) Familia Pteridaceae fam. E.D.M. Kirchn. Sinónimos: Adiantaceae fam. Newman; Parkeriaceae fam. Hook. Plantas terrestres, rupícolas o acuáticas; rizomas erectos, escamosos o pilosos; pecíolo no articulado al rizoma; fronda simple a 4-pinnada, en algunas especies 11

28 ANTECEDENTES-JADE ramificada; nervaduras generalmente libres; esporas triletes, no clorofílicas. Aproximadamente 40 géneros y con cerca de 1000 spp. Cosmopolita. Pteridaceae es una familia morfológicamente diversa, con más géneros que cualquier otra familia en Mesoamérica. Consecuentemente, es difícil citar características fácilmente observables que la definan (Moran y Yatskievych, 2006) Género Adiantum L. Se consideran plantas terrestres o rupícolas; rizoma corto a largamente rastrero, escamoso; ejes pardo-rojizos a negros, lustrosos; fronda 1-4-pinnada, raramente simple; últimos segmentos sésiles a pediculados; nervaduras libres y bifurcadas dicotómicamente o raramente anastomosadas; esporangios en la cara interna de un margen del segmento; esporas globoso-tetraédricas, triletes. Aproximadamente cuenta con 200 spp (Moran et al.,, 2006) Adiantum poiretii Wikstr. Sinónimos: Adiantum crenatum Poir; A. gratum Fee; A. pellucidum M. Martens et Galeotti; A. thalictroides Willd. ex Schltdl. Rizoma rastrero o cortamente rastrero, las escamas 2-4 x mm, lanceoladas a linear-lanceoladas, anaranjadas a castaño oscuro; pecíolo glabro; fronda x 7-15 cm, deltada a lanceolada, 2-3-pinnada, glabra en ambas superficies, verde o glauco en el envés; pinnas 4-10 pares, la más grande 5-12 x 4-8 cm, pediculada; raquis glabro; últimos segmentos 5-10 x 5-8 mm, semicirculares a flabelados, en su mayoría simétricos, lobados, pediculados, el pedículo 2-6 mm; soros 2-8 por segmento, reniformes o lunulares, generalmente con farina amarilla entre los esporangios. En bosque de Quercus, bosque de coníferas, bosque mesófilo de montaña, a lo largo de arroyos o entre rocas (Moran, 2006). 12

29 ANTECEDENTES-JADE 1.5. Germinación y viabilidad de esporas. Existen dos tipos de esporas en los helechos heterospóricos: las verdes o clorofílicas y las esporas no verdes o no clorofílicas, que son de color café en general. Las esporas verdes germinan en dos días o menos después de que son sembradas y tienen viabilidad corta, de 48 días en promedio. Aunque hay indicios de que las esporas verdes en el ambiente natural pueden permanecer viables por más tiempo. Las esporas no verdes generalmente tienen tasas de germinación más lentas, pero no se ha podido separar aquellas que son capaces de germinar en la oscuridad de las que no lo son (Sheffield, 1996). La primera mitosis de la espora da origen al rizoide primario y a la célula protonemal, estos son signos de germinación. Los factores que están involucrados en la germinación son: A. Agua: humedades relativas ambientales desde 15% hasta el 100%, son favorables. B. Temperatura: en general el intervalo ideal es de 15 a 30 o C. C. Nutrientes minerales: las esporas aparentemente contienen suficientes nutrientes para completar la germinación con el agua disponible. D. ph: la mejor germinación se lleva en un intervalo de 5.0 a 7.5, las diferencias podrían estar relacionadas con el hábitat del helecho. E. Fuente de carbono: las pentosas en general inhiben la germinación; las hexosas la estimulan pero en algunos casos la inhiben, en otros pueden propiciar apogamia en los gametofitos formados. F. Factores bióticos: en especies como Thelypteris patens Schott, la germinación se favoreció por los hongos contaminantes del medio de cultivo. En experimentos realizados con esporas de Pteridium lobatum la germinación se incremento al estar en contacto con hongos como Pythium debaryanum Hess o Penicillium notatum Westling. G. Densidad: es un efecto no muy claro sobre la germinación, generalmente una densidad moderada es mejor, aunque en casos de esporas como las de Pteridium aquilinum (L.) Kunth., la germinación se favoreció al cultivarlas agrupadas. 13

30 ANTECEDENTES-JADE H. Luz: la mayoría de las esporas de helechos no germinan en oscuridad, pero existen casos como las esporas de Polypodium crassifolium L. que sólo germinan en oscuridad (Sheffield, 1996; Aguilar, 2005). La viabilidad de las esporas (tiempo en que permanecen viables, esto es, que son capaces de llevar a cabo una germinación exitosa), es un factor básico para el establecimiento de los helechos en su hábitat natural (Pérez y Reyes, 1993). Esta viabilidad esta controlada por factores intrínsecos como el genotipo, edad y latencia y factores extrínsecos como el ph, humedad, temperatura, luz, competidores, entre otros. Contabilizando el número de gametofitos que aparecen en un cultivo de esporas, se puede tener una idea aproximada del número de esporas viables (Ramírez et al., 2000) Propagación de helechos. Los helechos son plantas que pueden reproducirse tanto de manera sexual como asexual (vegetativamente). El que lleven a cabo una de las dos formas de reproducirse depende de varios factores, entre los que se pueden citar: condiciones ambientales, época del año, estrategias adaptativas, entre otras. La reproducción sexual es por esporas, que son estructuras unicelulares de resistencia. Dentro de la reproducción vegetativa están las yemas prolíficas ubicadas en el rizoma, la raíz o la fronde, dependiendo de la especie. De estas el rizoma ramificado es el mas frecuentemente. En las frondes las yemas pueden ser apicales o estar en la base del pecíolo. Existen especies de helechos que a partir de estípulas (escamas en la base del pecíolo) pueden generar plántulas (Pérez y Reyes, 1993). 14

31 ANTECEDENTES-JADE Propagación in vitro Cultivo de tejidos vegetales. Las técnicas desarrolladas para el cultivo de tejidos vegetales in vitro se han utilizado con éxito en la producción rápida y uniforme de plantas libres de enfermedades y de alta calidad (IAEA, 2004). Se han aplicado para obtener plantas de ornato, plantas productoras de metabolitos industrializables, plantas haploides o de plantas híbridas (que por otras técnicas son difíciles de lograr), entre otras. Con la tecnología alcanzada, por lo menos teóricamente es posible cultivar cualquier tejido o célula vegetal; se cultivan anteras, granos de polen, hojas, ovarios, protoplastos, meristemos, principalmente. El cultivo de tejidos da respuesta a incógnitas sobre el mecanismo de acción de reguladores del crecimiento y del desarrollo vegetal (Franco y García, 1995). La variabilidad genética también se expresa aquí y mientras algunas plantas dan origen a nuevas plantas por estas técnicas, otras sólo producen tejido indiferenciado o callos; y otras más no se han podido multiplicar in vitro. Para el establecimiento de un cultivo de tejidos vegetales los principales aspectos que se deben determinar son: A. Tipo de explante: se llama explante a cualquier porción de tejido vegetal que sea utilizado para iniciar un cultivo. Se considera que cualquier tejido será capaz de responder, sin embargo es muy importante la edad y el grado de diferenciación, ya que mientras más joven y menos diferenciado tendrá mejor respuesta. B. Medio de cultivo: un medio de cultivo esta conformado básicamente por tres componentes principales: los nutrientes minerales, una fuente de carbono y otros compuestos inorgánicos. El más utilizado es el MS (Murashige y Skoog, 1962). C. Reguladores del crecimiento: también llamados fitohormonas o fitoreguladores, comprende a las auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abcísico, etileno, principalmente. Se relacionan con procesos de crecimiento celular y división celular. 15

32 ANTECEDENTES-JADE D. Condiciones ambientales: las más importantes son luz (fotoperíodo, tipo e intensidad), temperatura y humedad (Vanegas, 2003) Propagación in vitro de helechos Germinación de esporas in vitro. A partir de la germinación in vitro de esporas de helechos, se forman gametofitos que posteriormente formaran esporofitos, los cuales son factibles de propagarlos masivamente in vitro (Hutchinson y Knoxfield, 1995). Para lograr la desinfestación de las esporas se ha utilizado principalmente el hipoclorito de sodio a diferentes concentraciones, desde el 0.875% al 2% de cloro activo, con tiempos de exposición de 3 a 30 minutos; además se ha combinado con el uso de etanol, Tween 20, Twenn 80, Tritón X-100 y estreptomicina. El medio de cultivo mas empleado ha sido el MS (Murashige y Skoog, 1962), pero también se menciona el de Moore y el de Knudson; estudiándose también la influencia de factores como la gravedad, las condiciones de almacenamiento, la densidad de siembra, el protocolo de desinfestación, el ph, la temperatura, los niveles de humedad, la irradiancia y la calidad y cantidad de luz (Douglas y Sheffield, 1990; Camloh y Gogala, 1992; Fernández et al., 1993; Pangua et al., 1994; Fernández et al., 1997a; Fernández et al., 1997b; Edwards y Roux, 1998; Bertrand et al., 1999; De Paula et al., 1999; Pivetta et al., 2000; Cox et al., 2003; Nondorf et al., 2003; Namur, 2004; Renner y Randi, 2004; González et al., 2006). En México existen dos grupos de investigación que han realizado diversos estudios de la germinación in vitro de helechos; el primero se ha dedicado al estudio de la morfogénesis de la fase sexual de helechos silvestres de México, la cual incluye la germinación de las esporas, para ello ha usado con éxito el medio de Thompson (Reyes y Pérez, 1991; Pérez y Riba, 1993; Mendoza et al., 1999; Reyes et al., 2000; Pérez et al., 2001; Mendoza et al., 2002; Mendoza y Pérez, 2003; Granados et al., 2003; Reyes et al., 2003; Mendoza y Pérez, 2005). El segundo grupo ha enfocado sus estudios en el ciclo de vida de especies mexicanas de helechos silvestres, para 16

33 ANTECEDENTES-JADE tal fin ha inducido la germinación usado diversos soportes como el maquique y el musgo (Montoya et al., 2000; Monroy, 2001; Sánchez, 2001; Potter, 2001; Díaz, 2002; Leal, 2002; Hernández, 2004; Herrera, 2004; Nazario, 2004). En ambos casos no desinfestan las esporas y se han orientado a realizar estudios de la morfología de las mismas (tamaño, color, tipo de apertura, ornamentación de la pared, entre otras características), el tiempo en que se presenta la germinación (los días a partir de la siembra en los que se forma el rizoide y la primera célula protonemal), y el tipo de germinación (Nayar y Kaur, 1971) Uso de explantes vegetativos in vitro. La especie de helecho ornamental mas ampliamente estudiada es Nephrolepis exaltata (L.)Schott., mejor conocida como helecho Boston (por ser uno de sus cultivares mas reconocidos); de esta se han usado para su propagación in vitro explantes de estolones terminales (también llamados puntas del rizoma) y gametofitos, siendo desinfestados con hipoclorito de sodio con diferentes concentraciones, desde 0.5% a 1.5%, combinado con el uso de Tween 20 y etanol; siendo también sometidos al efecto de diversos reguladores del crecimiento vegetal como BA, AG, KIN, 2,4-D y ANA; así como a la influencia de diferentes concentraciones de sacarosa, sales minerales y nitrógeno; utilizando el medio MS (Murashige y Skoog, 1962), ya sea con el 100% de sales o menos (Loescher y Albrecht, 1979; Hvoslef, 1990; Pasqual et al., 1994; Guimarães et al., 1999; Ambrosio y De Melo, 2004; González et al., 2006). Se ha citado igualmente como afecta en el desarrollo in vitro de esta especie la irradiancia, la temperatura y el ph (Hvoslef, 1990; Ambrosio y De Melo, 2004). Otra especie de helecho ornamental bien estudiada es Platiceryum bifurcatum (Cav.) C. Chr., llamado helecho cuerno de alce, del que se obtienen explantes de frondas, escamas del rizoma y rizoma (todos provenientes de cultivo in vitro establecido); los cuales fueron tratados con diferentes reguladores del crecimiento vegetal como BAP, 17

34 ANTECEDENTES-JADE IAA, IB y ANA; y a diferentes concentraciones de sacarosa (Camloh y Gogala, 1991; Camloh et al., 1994; Dolinsek y Camloh, 1997; Dolinsek et al., 2002; Evangelista et al., 2003). Aunque de esta especie también se han hecho cultivos de células en suspensión, en donde se induce la aposporia variando la concentración de sacarosa, ANA y carbón activado (Teng, 1997; Teng y Teng, 1997, Dolinsek et al., 2002). Otro tipo de estudios en esta especie es el cultivo in vitro de gametofitos, donde se ha visto el efecto del ph, la concentración de sacarosa y agar o la inducción de apogamia por IAA (Camloh y Gogala, 1992; Kwa et al., 1995; Dolinsek y Camloh, 1997); también se indica la influencia de la estreptomicina y la penicilina en la regeneración de esporofitos en cultivos en suspensión (Teng y Teng, 2000). Se encontraron trabajos de propagación in vitro para otras especies de helechos ornamentales o con algún grado de domesticación, en las que se usaron explantes foliares, rizoma, gametofitos, callos, entre otros; probándose además el efecto de reguladores del crecimiento vegetal tales como 2,4-D, BAP, KIN, BA, IAA y ANA (Hirsch, 1975; Furelli y De García, 1987; Janssens y Sepelie, 1989; Hegde y D Souza, 1995; Thakur et al., 1998; Bertrand et al., 1999; Morini, 2000; Forbes, 2005; Martin et al., 2006). 18

35 JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS, OBJETIVOS-JADE 2. J U S T I F I C A C I Ò N E H I P Ó T E S I S. J U S T I F I C A C I Ò N. El mercado de helechos ornamentales en la zona centro-sur de México, está acaparado por los de importación y un gran número de las especies mexicanas que se comercializan son saqueadas de su hábitat natural, lo que puede ponerlas en peligro de extinción (Monterrubio et al., 2001). Se carece de técnicas estandarizadas para la propagación de helechos, ya sea por esporas o vegetativamente. Una de las causas, es quizá, que los estudios de germinación de esporas, propagación masiva in vitro y ex vitro, se han centrado en especies ya cultivadas y se han dejado a un lado las especies silvestres (Sheffield, 1996). Es por ello que resulta apremiante trabajar todas las estrategias que permitan la conservación de los recursos filogenéticos, incluyendo a las especies con potencial de ser cultivadas; por lo que algunas estrategias biotecnológicas como el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales y el uso de sustratos hortícolas, son alternativas viables que se pueden dirigir hacia el rescate, conservación y multiplicación de las mismas (Red de Ornamentales, 2006). En el Estado de Morelos (principal proveedor de helechos para la zona centro-sur del País) se reportan especies de helechos silvestres que cumplen con las características fenotípicas para ser consideradas con potencial ornamental (Díaz, 1995; Riba et al., 1996; Red de Ornamentales, 2006), destacando los géneros Thelypteris, Asplenium, Adiantum, Cheilanthes, Pellaea y Pteris. Las especies que se seleccionaron para este trabajo son: Adiantum poiretii Wikstr., Asplenium muenchii A. R. Sm y Asplenium sessilifolium Des, por presentar características fenotípicas para ser comercializadas como plantas ornamentales; además de que pertenecen a géneros que son de los más distribuidos en México y a nivel mundial; así también, son abundantes en su hábitat original y no están incluidas en la NOM-059-ECOL