CARTOGRAFÍA CROMOSÓMICA

Transcripción

1 CARTOGRAFÍA CROMOSÓMICA Bateson, Saunders y Punnett: segregación anómala en guisante 9:3:3:1 (P= AABB + aabb clases AB y ab aumentadas) Drosophila: Morgan: algunas parejas de genes no cumplen la ley de la transmisión independiente de Mendel, producen distintas cantidades de fenotipos parentales. Hipótesis: están en el mismo cromosoma Sturtevant: La variación en la fuerza del ligamiento indicaba la forma en que los genes se ubicaban en el cromosoma (aditivas) 1 er mapa genético B C P R M y w v m r yellow white vermillon miniature rudimentary wings Nuevo enfoque para comprender el proceso de herencia de estos genes y predecir los tipos de descendencia que resultarán de ellos.

2 Recordatorio: Herencia de genes ligados (en el mismo cromosoma) y genes no ligados ( en distintas parejas de homólogos) Sin entrecruzamiento (X) A B C A B C A B C a b c a b c A B c Parentales ABC abc Con entrecruzamiento (Y) A B C A B C A B C a b c a b c A B c A B C a b c A B c a b C A b C a B c A b c a B C a b c a b C (½ AB: ½ ab) * (½ C: ½ c) ¼ ABC: ¼ ABc:1/4 abc:1/4 abc 0% ligados (X) FR 50% no ligados a b c a b C (¼ AB: ¼ ab: ¼ Ab: ¼ ab) * (½ C: ½ c) 1/8 ABC: 1/8 abc: 1/8 AbC: 1/8 abc 1/8 ABc: 1/8 abc: 1/8 Abc: 1/8 abc 50% ligados (Y) FR 50% no ligados FR ligados = X*0 + Y*0,5 50%; FR no ligados = (x+y)*0,5 = 50% Valor máximo de recombinación = 50%

3 RESUMEN - Cuando dos genes están en el mismo cromosoma, es decir, en un par de homólogos, decimos que están ligados y pertenecen a un grupo de ligamiento (tantos como cromosomas = n). - Los reconocemos porque su frecuencia de recombinación (FR%) es < 50% -El entrecruzamiento tiene lugar en el estado de 4 cromátidas, entre cromátidas no hermanas - Recuerden que los quiasmas son la imagen visible de los entrecruzamientos (sólo la mitad de los productos son recombinantes) FR = ½ Frecuencia de quiasmas -Un entrecruzamiento es la rotura de dos moléculas de ADN en una misma posición y su reunión posterior en dos combinaciones recombinantes recíprocas. - Las combinaciones originales las llamamos parentales - Siempre se escriben los genes en el mismo orden. Se separan por una / los genes que están en distintos homólogos de cada pareja. Ej: AB/ab C/c - Los parentales pueden estar en acoplamiento (cis), si ambos dominantes ó ambos salvajes se presentan en el mismo padre (DD ó RR ó ++ ó mm) o en repulsión (trans) si en el mismo padre coinciden un dominante y un recesivo ó un mutante y un silvestre.

4 CARTOGRAFÍA Sturtevant: Cuanto mas alejados estén los genes, mayor probabilidad de que ocurra un entrecruzamiento entre ellos mayor frecuencia de recombinación. Cálculo de la FRECUENCIA DE RECOMBINACIÓN Frecuencia de recombinación es la frecuencia de progenie recombinante que se produce a partir de un cruzamiento. Se suele expresar en porcentaje y se estima a partir de cruzamientos de prueba. Se realizó el cruce de prueba a un dihíbrido de hojas normales (M, dominante sobre moteadas (m)) y planta alta (D, dominante sobre bajas (d)). En la F 1 se obtuvieron los siguientes fenotipos 55 MD: 53 md: 8 Md y 7 md Los mas abundantes son los parentales. Nos indican el genotipo de las cepas P 1 y P 2 Parentales = = 108 Recombinantes = 8+7 = 15 Total = 123 Número de progenie recombinante FR= Número total de la progenie FR% = FR * FR% = x 100 = 12,2% = 12,2 centimorgan 123

5 CARTOGRAFÍA Mapa de ligamiento Frecuencia de recombinación Unidad de mapa genético (u.m.): como la distancia entre genes en la que se produce un recombinante de cada 100 productos meióticos. FR% = 1/100 x 100 = 1% Por ello, la FR de 10,7% de Morgan son 10,7 u.m. La unidad de mapa es conocida como centimorgan (cm). Sturtevant demostró la linealidad de los mapas: (A-B) + (B-C) = (A-C)

6 CARTOGRAFÍA Aditividad de las distancias Orden génico en el mapa Representación gráfica: A 3 C 2 B

7 CARTOGRAFÍA Predicción de los resultados de cruzamientos con genes ligados pr 11,0 vg Doble dirección: conocida la distancia genética podremos conocer la frecuencia de recombinantes esperada. Se realiza el cruce de prueba a una hembra diheterocigóticas, dominante, hija del cruce prvg/prvg ++/++. Si obtenemos 1000 descendientes, cuántos serán de cada fenotipo? Fenotipo de la hembra (en notación gamética) Nº de gametos recombinantes Nº de gametos parentales Fenotipos de la descendencia

8 Entrecruzamientos múltiples Entrecruzamientos múltiples pueden afectar a 2, 3 ó 4 cromátidas no hermanas. Los intercambios dobles de material genético dan lugar a dobles recombinantes (DR). Para detectarlos tenemos que estudiar simultáneamente tres genes (en heterocigosis). Por probabilidad, los DR serán más escasos que los recombinantes sencillos (DR = R 1 x R 2 )

9 2 genes 3 genes AB AB ab ab P P P P C C c c ACB AcB acb acb P DR DR P AB Ab ab ab P R P R C C c c ACB Acb acb acb P R1 DR R2 Ab AB ab ab R P R P C C c c ACb AcB acb acb R2 DR R1 P Ab Ab ab ab R R R R C C c c ACb Acb acb acb R2 R1 R1 R2 FR AB = 50% FR AC = 50%; FR CB = 50%; FR AB > 50%

10 MAPAS DE 3 PUNTOS Condiciones: a) El organismo en estudio tiene que ser heterocigótico para los 3 genes b) El cruce debe hacerse de manera que cada clase fenotípica refleje el genotipo de un tipo de gametos. Por ejemplo: CRUCE DE PRUEBA: estudiando el fenotipo de la F 2 conocemos los gametos del individuo de estudio. c) Deben contarse un gran número de descendientes Pasos: a) Para hacer el estudio teórico asumimos un orden al azar. b) Gametos frecuencias semejantes dos a dos en los complementarios (ej: ABC/abc ó Abc/aBC ) - 2 con frecuencias = y Altas - 2 con frecuencias = e intermedias - 2 con frecuencias = e intermedias de la anterior - 2 con frecuencias = muy bajas c) Los más abundantes = PARENTALES; los menos abundantes = DR Comparándolos y viendo que gen es diferente en los gametos, sabremos cuál es el GEN CENTRAL

11 Si ahora calculamos la distancia entre las 3 parejas, la distancia entre los mas alejados no es la suma de los otros dos por qué? Por los DR no sumados en la distancia larga, ya que para esos dos marcadores son parentales, cuando en realidad deberían ser sumados 2 veces, pues sufren 2 procesos de entrecruzamiento. d) Por ello, debemos identificar cuáles son P, R I, R II y DR (= R I y R II ) e) Calcular las FR entre los 3 genes (ACB), sabiendo que C es central, como: FR I %= FR AC %= recombinantes I *100 /total = (R I + DR)*100/total FR II %= FR CB %= recombinantes II *100 /total = (R II + DR)*100/total FR I,II %= FR AB %= recombinantes (I+II)*100/total = (R I + R II + 2*DR)*100/total

12 Cartografía en maíz de genes mutantes recesivos, ligados en el cromosoma 5: bm (nervadura marrón); v (brote virescente); pr (aleurona púrpura) a) Si la es triheterocigótica, de padres desconocidos, qué genotipo tiene que tener el para que la cartografía tenga éxito? bm v pr/bm v pr P R 1 R 2 DR c) Quiénes son P, R1, R2 y DR? d) Cuál es la distancia entre cada par de genes? Total = = 1109 R v-pr = R 1 + DR = = 247 R bm-pr = R 2 + DR = = 481 R v-bm = R 1 + R DR = *86 = 728 b) Quiénes son P y quienes DR? Cuál es el gen central? Cuál el genotipo de la? P= + v bm/pr + + DR= pr v bm/+ + + el central es pr ORDEN = v pr bm Genotipo : v + bm/ + pr +

13 P R 1 R 2 DR FR v-pr = 24700/1109 = 22,27% Dist v-pr = 22,3cM FR v-pr = 48100/1109 = 43,37% Dist v-pr = 43,4cM FR v-pr = 72800/1109 = 65,64% Dist v-pr = 65,6cM Por qué frec. de recombinación > 50% para v-pr? ( )*100/1109 = 50,1% 50% A partir de la información obtenida podríamos calcular (multiplicando las probabilidades) la probabilidad de dobles entrecruzamientos = 0,223 x 0,434 = 0,097 = 9,7%; sin embargo sólo detectamos 7,8% Por qué?

14 INTERFERENCIA Los entrecruzamientos en regiones adyacentes del cromosoma son sucesos independientes? Favorecen o dificultan? En general inhiben: un entrecruzamiento en una región del cromosoma inhibe un segundo entrecruzamiento en regiones cercanas. Se usan las clases DR para deducir la magnitud de esta interferencia Se denomina coeficiente de coincidencia (C) a la relación entre DR obs /DR esp = 7.8/9.7 = 0,804 DR esperados en independencia = FR I x FR II Lo podemos calcular también con los valores observados = nº DR obs / DR esp en este caso: DR esperados en independencia = FR I x FR II * nº total Interferencia (I) = 1-C varía entre 0 y 1 ( entre 0 y 100%) para C>0 I = 1-0,804 = 0,196

15 Si DR obs > DR esp interferencia positiva (es la más frecuente). Ej: Drosophila: para una dist = 10, la I = 1(completa) Si DR obs < DR esp interferencia negativa (Muy rara) Problema Cómo calcular los gametos obtenidos si hay interferencia? 1º calculamos DR, luego R1 y R2 y el resto = parentales Dado el mapa genético: A B C 0,2 0,45 de un organismo diploide con una interferencia de 0.2, determinar las frecuencias de los gametos producidos por un individuo ABC/abc DR = FR1*FR2*C = (0,2*0,45)*0,8= 0,072 R I = FR1-DR = 0,2-0,072 = 0,128 R II = FR2-DR = 0,45-0,072 = 0,378 P = 1- DR - R I R II = 1-0,072-0,128-0,378 =0,422 0,036 AbC : 0,036 abc 0,064 Abc : 0,064 abc 0,189 ABc : 0,189 abc 0,211 ABC : 0,211 abc

16 Cartografía del segmento diferencial del cromosoma X Los genes ligados al cromosoma X, se heredan juntos se comportan como un único bloque en relación al segmento pseudoautosómico. Esto nos permite calcular la distancia entre un gen, situado en la región apareante, y el segmento diferencial. En una especie en la que las hembras son XX y los machos son XY, el locus A,a se encuentra en el segmento diferencial del cromosoma X, siendo el alelo A (negro) > a (gris). El locus B,b, en el cuál el alelo B (ojos marrones) es dominante sobre b (ojos azules), está situado en el segmento no diferencial (=apareante) de los cromosomas sexuales. Se cruza una hembra homocigótica recesiva, con un macho negro de ojos marrones, obteniéndose 74 negras de ojos azules ( Ab ), 27 negras de ojos marrones ( AB ), 23 grises de ojos azules ( Yb ) y 76 grises de ojos marrones ( YB ). Parentales = X Ab (74) + Y B (76) = 150 Recombinantes = X AB (27) + Y b (23) = 50 FR = 50/200 = ¼ = 25%

17 MAPAS CROMOSÓMICOS EN HUMANOS PUNTUACIÓN LOD Se usa el método de la puntuación lod (Z = log of the odds) para saber si dos genes están ligados y cuál es su frecuencia de recombinación. Puntuación Z > 3 se consideran ligados. Z = log 10 (prob. de los genotipos dado R/probabilidad suponiendo segregación independiente) = (1-R) K R (N-K) R = frecuencia de recombinación Z = log K = nº de parentales p N N = nº total de individuos (K + recombinantes) p = probabilidad de cada uno de los tipos de gametos bajo la hipótesis de segregación independiente = 0,5 ó también la podríamos escribir: (P 1 ) K1 (P 2 ) K2 R 1 C1 R 2 C2 P 1 = P 2 = frecuencia de cada gameto parental = (1-R)/2 Z = log R 1 = R 2 = frecuencia de cada gameto recombinante= R/2 q N K 1 y K 2 = nº de parentales de ambos tipos ( K = K 1 +K 2 ) C 1 y C 2 = nº de recombinantes de ambos tipos N = nº total de individuos (K 1 + K 2 + C 1 + C 2 ) q = probabilidad de cada uno de los 4 tipos de gametos, bajo la hipótesis de segregación independiente = ¼

18 Un síndrome muy raro viene determinado por el alelo dominante A, mientras que el alelo recesivo a produce, en homocigosis, individuos normales. El cruce entre un hombre con el grupo sanguíneo NN y una mujer del grupo sanguíneo MN y heterocigótica para el síndrome produjo la siguiente descendencia: 8 hijos MN, 2 hijos MN con el síndrome, 3 hijos NN y 7 hijos NN con el síndrome. a. Calcular la frecuencia de recombinación suponiendo que ambos genes estén ligados b. Calcule, la puntuación LOD a) NN aa x MN Aa FR = 5/20 = ¼ b) (1-R) K R (N-K) Z = log = p N 1,136 < 3 No están ligados

19 MAPAS CROMOSÓMICOS EN HUMANOS HIBRIDACIÓN DE CÉLULAS SOMÁTICAS Dos células somáticas se fusionan formando un heterocarión (un citoplasma con dos núcleos), que mediante las técnicas adecuadas se transforma en un sincarión, por fusión de los núcleos. Si se cultiva durante muchas generaciones, se van perdiendo los cromosomas de una de las especies paternas. Si hombre-ratón, se pierden los del hombre si un producto humano se sintetiza en el sincarión, tiene que estar en uno de los cromosomas humanos presentes en ese sincarión. A B C D E F Eno Mdh Pep S Pgm Eno en B D E, Crom 1y 5(+C+F) Mdh en A B D F, Crom 2 Pep en A y C, Crom 4 Pgm en B D E, Crom 1y 5(+C+F) Eno y Pgm en crom 1 Mdh en crom 2 Pep en crom 4

20 Cartografía con marcadores moleculares: El análisis directo de las moléculas de ADN ha revelado una gran cantidad de variación, a veces relacionada con cambios fenotípicos y a veces no ( silenciosa ) Las variantes moleculares son tan comunes que muchos individuos son heterocigotos moleculares en muchos loci diferentes del genoma. Un locus constituido por un polimorfismo molecular puede cartografiarse igual que cualquier otro locus fenotípico A,a Estos loci de heterocigosidad molecular se conocen como MARCADORES MOLECULARES. Muy usados para localizar genes de interés (por su ligamiento a los mismos). Los más usados son: SNP y SSLP SNP = single nucleotide polimorphism SSLP = simple sequence lenght polimorphism

21 RFLP = Restriction fragments length polymorphism Enzimas de restricción de tipo II reconocen pequeñas secuencias (dianas) en las cadenas de ADN y cortan la molécula ATTG TAAC GATTC TAGnnnnnCGA CTAAG ATCnnnnnGCT 5 GTATCGAAATCT A3 ganancia pérdida Cambio de 1 base 5 GT AAATCT A3 5 GTATCGAAATCTACTGA3 Electroforesis (+ hibridación) nos permite detectar los fragmentos producidos Cada diana se comporta como un gen mendeliano

22 La asociación no es completa y observamos recombinantes: descendiente 8 que es Dd es 1,1; cuando esperábamos que fuese 1,2

23 SSLP (VNTR) = Polimorfismos de longitud de secuencia simple Muchos genomas tienen secuencias de DNA repetitivo, de diferentes tamaños: SSLP tiene muchos alelos (Ej: 15) podemos seguir la pista de un cromosoma en una genealogía. Mas usados: micro- y mini-satélites Minisatélites: Unidad general nuc ; en humanos 1-5 kb Usados en forense: huella digital (corta DNA total e hibrida con una sonda homóloga del minisatélite Microsatélites: Unidad = 2 a 6 nuc; muchos alelos Si usamos la técnica de la PCR, y la electroforesis, se comportan como genes mendelianos multialélicos

24 Microsatélites Alelo asociado a la enfermedad

25 SNP (snips) = Polimorfismo de un único nucleótido 5 -ATTCGGA-3 5 -ATTTGGA-3 3 -TAAGCCT-5 3 -TAAACCT-5 Ej: en la posición 5000 de un cromosoma aparece el par AT y en el homólogo aparece el par GC Muy abundantes y, muchos de ellos, muy polimórficos en las poblaciones. Hay varias cartografías de SNPs: 1.- SNP silenciosos dentro de genes (sin efecto fenotípico aparente : usados como marcadores de alelos recesivos. 2.- SNP en los que un alelo del SNP produce un fenotipo mutante que sigue una herencia monogénica, es decir, produce un fenotipo discreto. Ej: PKN ó Anemia falciforme (detectamos antes de que aparezca la enfermedad) 3.- SNP en poligenes (QTL). Se usan para descubrir poligenes que contribuyen al fenotipo continuo. 4.- SNP intergénicos. Sirven para cartografiar genes. Acercarnos a su posición.

26 Análisis de pedigrís lo asociaron al cromosoma 7 FIBROCIS CÍSTICA Autosómico recesivo; 5% de los caucásicos son portadores Otros marcadores moleculares, restringen la zona: 1,5 Mb a 0,5 Mb 4 genes: estudios de vinculación y expresión (hibridación) donde se expresa Clonación posicional 68% enfermos Otros: mutaciones en el gen CFTR Gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrocis cística

27 Cartografía mediante el uso de haplotipos de SNP Las combinaciones de SNP ó haplotipos se usan para cartografiar Haplotipo: conjunto de marcadores genéticos que se encuentran un segmento cromosómico. Haplotipo de SNP: segmento cromosómico definido por el conjunto específico de alelos de SNP que contiene. Ejemplo: a cada SNP se le dio un nº ; alelos se distinguen por Es un haplotipo; Es un haplotipo diferente HT de distintos tamaños: de unas pocas bases a varias Kb Generalmente se heredan como bloques, presentan desequilibrio en el ligamiento (asociación gamética) Con el tiempo, los entrecruzamientos hacen que se pierda la asociación En distintos grupos poblacionales podemos encontrar distintas asociaciones

28 HAPMAP: mapa de haplotipos humanos : islas separadas por puntos calientes de recombinación El paso del tiempo introduce nuevos alelos en los SNPs, los que todavía quedan asociados indican la posición del gen de la enfermedad SNP humanos suelen estar a 1 kb, con lo que localizan el gen con mucha precisión.

29 Recombinación en cromosomas mitóticos Son eventos muy raros, que se detectan como quimeras. Stern: Drosophila: observó manchas mutantes en individuos heterocigóticos Mapas mitóticos: - Contabilizamos el nº de quimeras en el que ha participado el gen. Cuanto más participe, más alejado del centrómero está. - las distancias se dan en referencia al locus más alejado del centrómero.

30 Recombinación entre cromátidas hermanas Se ha demostrado que en la mitosis se dan intercambios entre las cromátidas hermanas (ICH), pero al ser réplicas una de la otra, no dan lugar a nuevas combinaciones alélicas. Técnica: tinción en presencia de Bromo-desoxi-uridina

31 MAPAS FÍSICOS No existe una correlación exacta entre mapa físico y mapa genético Causa: no todas las regiones recombinan con la misma frecuencia Técnicas: -Mapeo por deleción -Hibridación in situ (FISH): sondas fluorescentes -Secuenciación (librerías-clonaje) Comparando con el mapa físico, el orden de los genes es el mismo, pero sus distancias relativas pueden ser diferentes

32 MAPAS en EUCARIOTAS HAPLOIDES Muchos eucariotas unicelulares, haploides durante los estadios vegetativos, forman células reproductivas que se fusionan en la fecundación y dan lugar a un zigoto diploide Chlamydomonas Zigoto meiosis células (+) y (-) colonias vegetativas condiciones adversas isogametos apareamiento: zigoto Técnica: Se aíslan 2 cepas de genotipos diferentes y se cruzan entre sí. Tras la meiosis los productos quedan juntos y se pueden analizar Ej: Chlamydomonas ó Neurospora (ascas ordenadas) Las ascas ordenadas permiten mapear el centrómero

33 Cartografía con tétradas desordenadas Ditipo parental = DP ½ de cada tipo parental Ditipo no parental = DNP ½ de cada tipo recombinante Tetratipo = TT ¼ de cada clase DP DNP TT TT Frecuencia de DNP muy diferente Comparando DP y DNP sabremos si están ligados (DNP + ½ TT)*100 FR = nº de tétradas

34 Cartografía con tétradas ordenadas Cartografía del centrómero Sin entrecruzamiento: segregación en la 1ª división meiótica aa++ (aaaa++++) ó ++aa (++++aaaa) Segregación en la 1ª división meiótica Segregación en la 2ª división meiótica Con entrecruzamiento: ascas 2 a 2 = segregación en la 2ª división meiótica a+a+ ó a++a ó +aa+ ó +a+a Distancia A-centrómero = ½ (ascas que segregan en la 2ª división)*100/total de ascas Permitieron comprobar la recombinación recíproca y el fenómeno de conversión génica