Nota corta: Método rápido de evaluación del efecto del herbicida dalapon en cereales

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1 Nota corta: Método rápido de evaluación del efecto del herbicida dalapon en cereales I. Loureiro, N. Avendaño, M.C. Escorial, J.M. García-Baudin, M.C. Chueca * Dpto. de Protección Vegetal. Instituto Nacional Investigaciones Agrarias Carretera La Coruña Km. 7,5 Madrid chueca@inia.es RESUMEN Se describe un método rápido que permite evaluar en cuatro días la respuesta de cereales al herbicida dalapon (ácido 2,2-dicloropropiónico). Este método de germinación en solución herbicida se ha puesto a punto utilizando cuatro cultivares de trigo y cuatro de cebada. Se ha comprobado que existe una buena correlación entre la respuesta de los cultivares en germinación in vitro y la respuesta por pulverización en plántula. PALABRAS CLAVE: Trigo Cebada Germinación INTRODUCCIÓN Los ensayos de respuesta a herbicidas tanto en cultivos como en malas hierbas pueden ser realizados tanto en laboratorio como en invernadero o en campo. El método más utilizado para la detección de una respuesta a herbicida en laboratorio implica crecer las plantas en condiciones controladas y tratarlas, cuantificando el efecto del herbicida varias semanas después de su aplicación (Moss, 1995). Esto hace que sean necesarias entre cuatro y seis semanas para la realización de un ensayo, que además de ser laborioso, necesita espacio e infraestructura. Diferentes autores han puesto a punto bioensayos más cortos, rápidos y baratos para evaluar el efecto herbicida, basados en determinar la respuesta midiendo diferentes parámetros, como la longitud del coleoptilo (Heap y Knigh, 1986; Sixto et al., 1997), de la raíz (Beckie et al., 1990), de las hojas (Letouzé y Gasquez., 1999; De * Autor para correspondencia Recibido: Aceptado para su publicación:

2 464 M.C. CHUECA et al. la Carrera et al., 1999) o la actividad enzimática (Reade et al., 1999) después de la aplicación herbicida. Estos ensayos han permitido detectar respuestas diferenciales entre biotipos sensibles y resistentes para algunos herbicidas como diclofop-metil (Gill, 1990; Letouzé y Gasquez., 1999), trifluralina (Beckie et al., 1990) inhibidores de acetil-coenzima A carboxilasa (Murray et al., 1996) o glifosato (Sixto et al., 1997). El dalapon (ácido 2,2-dicloropropiónico) es un herbicida total de postemergencia con actividad por contacto, penetración y translocación, usado para el control de malas hierbas gramíneas. Afecta al metabolismo de carbohidratos, de lípidos y del nitrógeno, así como a otros procesos, probablemente respuestas secundarias debidas a uno o varios sitios de acción primarios desconocidos (Ashton y Crafts, 1981).Estas características hacen que este herbicida se haya propuesto como un buen candidato para el control de gramíneas en cereales, aunque es necesaria la creación previa de cultivares resistentes (Gressel, 2000). Para ello se ha transferido a trigo un gen que codifica para un enzima dehalogenasa que confiere resistencia a dalapon (Buchanan-Wollaston et al., 1992). El posterior estudio e identificación de individuos resistentes a dalapon hace que sea de gran utilidad disponer de una forma sencilla y rápida de detectar la resistencia. Este trabajo muestra un método rápido y sencillo que nos permite detectar respuestas diferenciales a dalapon en cereales, trigo y cebada, mediante un ensayo de germinación en placa que se correlaciona con la respuesta tradicional de pulverización en plántula. MATERIAL Y MÉTODOS El material vegetal utilizado para el estudio fueron cuatro cultivares de trigo: dos de trigo blando (Triticum aestivum L.), cultivares «Pavon» y «Chinese Spring» (CS) y dos de trigo duro (Triticum turgidum var. durum L.), cultivares «Anton» y «Nita» y cuatro cultivares cebada: (Hordeum vulgare L.): «Beka», «Amaji Nijo» (AN), «Barbarrosa» y «Manitou». Ensayos de germinación en placa Petri Se estudió la respuesta de las plantas mediante la germinación de las semillas en placas Petri con diferentes concentraciones del herbicida dalapon (85 % sal sódica). En cada placa se colocaron diez semillas sobre dos discos de papel de filtro sobre los que se añadieron previamente 9 ml de diferentes concentraciones de la solución herbicida: 0, 25, 50, 100, 300, 500 y µg m.a. (materia activa) ml 1. En cada ensayo se utilizaron tres placas por cada una de las concentraciones empleadas. Las placas se mantuvieron cerradas 24 horas transcurridas las cuales se abrieron y se pasaron a una bandeja con papel de filtro humedecido, que se cubrió con plástico transparente para que se mantuviera la humedad y para que el coleoptilo tuviera espacio para su crecimiento. Al cuarto día desde el inicio del ensayo se midió la longitud del coleoptilo. Se realizaron tres repeticiones en el tiempo para cada cultivar. El ensayo se llevó a cabo en una cámara en condiciones controladas, con un fotoperíodo de 16 horas de luz (100 Em 2 s 1 PAR) a 22 1 C y 8 horas de oscuridad a 14 1 C.

3 EVALUACIÓN RÁPIDA DEL EFECTO DE DALAPON 465 Ensayos de pulverización en plántula Semillas de cada cultivar se pregerminaron en placas sobre discos de papel de filtro empapados en agua, siendo trasplantadas a los cuatro días a vasos de plástico con una mezcla de mantillo-tierra-arena (1:1:1) con cinco semillas por vaso y tres vasos por tratamiento. Cuando las plantas se encontraban en estado fenológico de dos hojas correspondiente al estadío 12 (Zadoks et al., 1974), se trataron con un pulverizador automático de boquilla plana Teejet 8003 en una cinta sin fin, con dosis de dalapon (85 % sal sódica) de 0; 0,31; 0,62; 1,25; 2,5; 5y10kgm.a. ha 1. A la solución herbicida se añadió un surfactante no aniónico 1 (1,25 g L 1 ). La parte aérea de la planta se cortó 15 y 30 días después de la pulverización y se pesó (peso fresco). Las plantas cortadas se secaron en la estufa a80 2 C durante 48 horas (peso seco). El ensayo se realizó en una cámara de condiciones controladas con un fotoperíodo de 16 horas de luz ( Em 2 s 1 PAR) a 22 1 C y 8 horas de oscuridad a 16 1 C. Análisis de datos Los datos, después de llevar a cabo la transformación arco seno raíz cuadrada de x, se analizaron mediante un análisis de varianza factorial tomando como factor la especie. Las medias se separaron mediante una prueba de Newman Keuls con nivel de significación P = 0,05. La respuesta de la planta a las diferentes dosis de herbicida se calculó mediante el ajuste a un modelo log-logístico que sigue la formula y=f(x)=c+(d-c)/(1 + (x/i 50 ) b ), donde C es el límite inferior que corresponde a la dosis mayor de herbicida, D es el límite superior que corresponde al testigo, b es la pendiente de la curva en la zona de ID 50, siendo esta la dosis que produce una inhibición del 50 % del testigo. Los parámetros se estimaron por un ajuste por iteración usando el modelo PROC NLIN del programa SAS (Seefeldt et al., 1995). RESULTADOS Y DISCUSIÓN En los ensayos de germinación, el herbicida penetra en la semilla por imbibición. Esta imbibición de las semillas no afectó a su germinación que fue en todos los casos similar a la de los testigos no tratados. El efecto herbicida se puso de manifiesto fundamentalmente en la inhibición del crecimiento del coleoptilo, que se vio severamente reducido, siendo este efecto menos apreciable sobre el crecimiento de la raíz (datos no presentados). La respuesta al herbicida dalapon de la semilla germinada en medio adicionado de herbicida se evaluó mediante la longitud del coleoptilo que se expresa en porcentaje del testigo, calculando la curva de respuesta mediante un ajuste de regresión no lineal. 1 Tween-20 (polyoxyethylensorbitanmonolaurat); de MERCK, Schuchard, 8011 Hohenbrunn bei München.

4 466 M.C. CHUECA et al. A las concentraciones más elevadas de herbicida, no existieron diferencias entre los cultivares de cebada y los cultivares de trigo (Fig. 1a). A concentraciones inferiores a 100 mg L 1, los cuatro cultivares de trigo mostraron una mayor sensibilidad al herbicida que los cuatro cultivares de cebada. Un análisis de varianza llevado a cabo tomando como factor la especie nos mostró que la cebada fue significativamente diferente del trigo para la respuesta al herbicida dalapon. Estos datos pusieron de manifiesto que este tipo de ensayo de germinación en placa permite detectar respuestas diferenciales al herbicida dalapon, que aunque es un herbicida cuya principal vía de penetración es foliar, es capaz de penetrar por otras vías y de translocar rápidamente del floema al xilema (Wilkinson, 1956; Maroder, 1973). Longitud coleoptilo (% testigo) a CS Pavon Anton Nita Beka Manitou AN Barbarrosa Peso seco (% testigo) Dosis dalapon (mg/l) 120 b CS Pavon Anton Nita Beka Manitou AN Barbarrosa Dosis dalapon (kg/ha) Fig. 1. Curva de respuesta de dosis al herbicida dalapon de cuatro cultivares de trigo y cuatro cultivares de cebada a.- respuesta en germinación en placa (longitud del coleoptilo 4 días de tratamiento). b.- respuesta a pulverización en plántula (peso seco 30 días después del tratamiento).

5 EVALUACIÓN RÁPIDA DEL EFECTO DE DALAPON 467 Ensayos de pulverización en plántula llevados a cabo con los mismos cultivares de trigo y cebada presentaron una respuesta similar en peso tanto seco como fresco, 15 y 30 días después del tratamiento, a la que presentaron los ensayos de germinación en placa. La Figura 1b muestra la respuesta en peso seco de las plantas 30 días después de efectuado el tratamiento herbicida. En todos los casos la respuesta de los cultivares de cebada fue más tolerante que la respuesta de los cultivares de trigo, lo que como en el caso anterior, se confirmó por un análisis de varianza. Las curvas de respuesta calculadas nos permitieron comparar la respuesta de los diferentes cultivares mediante las dosis que inhibieron el crecimiento en un 50 % (ID 50,Tabla 1) y en un 30 % (ID 30, Tabla 2) en relación al testigo. Tomamos para llevar a cabo la Tabla 1 ID 50 calculado para cada uno de los cultivares en los tres parámetros evaluados: Longitud de coleoptilo (mg L 1 ), peso seco de la parte aérea de la planta 15 y 30 días después del tratamiento (g L 1 ) Especie Cultivar ID50 Coleoptilo Peso 15 días Peso 30 días Trigo Nita 38 1,16 0,93 Anton 67 1,55 0,97 Pavon 102 1,21 0,75 CS 185 1,23 0,83 Cebada AN 145 3,23 2,58 Beka 167 3,14 2,09 Barbarrosa 175 6,11 4,62 Manitou 194 4,18 2,96 Tabla 2 ID 30 calculado para cada uno de los cultivares en los tres parámetros evaluados: Longitud de coleoptilo (mg L 1 ), peso seco de la parte aérea de la planta 15 y 30 días después del tratamiento (g L 1 ). Especie Cultivar ID30 Coleoptilo Peso 15 días Peso 30 días Trigo Nita 27 0,69 0,52 Anton 38 0,87 0,58 Pavon 26 0,55 0,49 CS 45 0,62 0,49 Cebada AN 67 1,46 1,29 Beka 77 1,55 1,29 Barbarrosa 78 2,81 2,20 Manitou 83 1,92 1,65

6 468 M.C. CHUECA et al. comparación entre las diferentes formas de tratamiento estos dos valores por dos motivos. En primer lugar, ID 50 es el dato considerado como el más adecuado para evaluar el efecto de un tratamiento. En segundo lugar y en el caso especial del tratamiento con dalapon, observamos que incluso a las dosis elevadas empleadas en el ensayo de germinación, se produjo en el coleoptilo un crecimiento inicial anterior al efecto herbicida que hizo que, después de un principio de elongación, el crecimiento se viera detenido por el dalapon y la inhibición en porcentaje del testigo no fuera en ningún caso inferior a 40 % en ensayos de germinación en placa en el corto tiempo en que son válidos este tipo de ensayos. Por ello tomamos como valor de comparación más adecuado el ID 30. La relación entre la respuesta de las plantas en un ensayo rápido como es el que presentamos y su respuesta por pulverización en plántula fue buena. La correlación entre los ID 30 en ensayo in vitro y en pulverización en plántula fue de 0,86 para la respuesta en peso 15 días después del tratamiento y de 0,91 para la respuesta en peso 30 días después del tratamiento. Esta correlación fue menor en nuestros ensayos para ID 50, pero ello es sin duda debido a la elongación inicial del coleoptilo y a que no existe una tolerancia a este herbicida lo suficientemente efectiva dentro de los cultivares de cereal, dado que este herbicida es antigramíneo. Sin olvidar que en algunos casos entre los que se encuentra el dalapon y los arilfenoxipropionatos (Gill, 1990) los ensayos en placa pueden subestimar el efecto herbicida. Estos resultados pusieron de manifiesto que este tipo de ensayo permite evaluar en cuatro días respuestas diferenciales al herbicida dalapon. Dado que este tipo de ensayo, de gran interés práctico, necesita ser validado para cada caso, se está estudiando su adecuación para otras especies gramíneas y para trigos transgénicos resistentes a dalapon, con el fin de utilizarlo de forma sistemática en el seguimiento de un transgen y en el estudio de la variabilidad poblacional de malas hierbas gramíneas. AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue financiado por el proyecto IC18-CT dentro del programa INCO de la Unión Europea. SUMMARY A rapid method to evaluate the effect of dalapon herbicide on cereals A method to evaluate the response of cereals to the herbicide Dalapon (2,2-dichloropropionic acid) in four days is described. The method is based on the germination of seeds in a herbicide solution. It was developed using four wheat and four barley cultivars. For these cultivars, a good correlation was found between the germination response in herbicide solution and the response observed in sprayed seedlings. KEY WORDS: Wheat Barley Germination

7 EVALUACIÓN RÁPIDA DEL EFECTO DE DALAPON 469 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ASHTON F.M., CRAFTS A.S., Aliphatics. En: Mode of action of herbicides. John Wiley and Sons Ed. New York, pp BECKIE H.J., FRIESEN L.F., NAWOLSKY K.M., MORRISON I.N., A rapid bioassay to detect trifluralin-resistant green foxtail (Setaria viridis). Weed Technology 4, BUCHANAN-WOLLASTON V., SNAPE A., CANNON F., A plant selectable marker gene based on the detoxification of the herbicide dalapon. Plant Cell Reports 11, DE LA CARRERA N., VILLARROYA M., CHUECA M.C., GARCÍA-BAUDIN J.M., Evaluation of Lolium rigidum biotypes resistance to chlorsulfuron: useful parameters. Brighton Crop Protection Conf. Weeds 1, GILL G.S., Evaluation of a Petri-dish assay for screening diclofop-methyl resistance in partially resistant populations of annual ryegrass, Lolium rigidum. Proceedings 9 th Australian Weeds Conf. Adelaide, Australia, pp GRESSEL J., Molecular biology of weed control. Transgenic Research 9, HEAP I., KNIGHT R., The occurrence of herbicide cross-resistance in a population of annual ryegrass, Lolium rigidum, resistant to diclofop-methyl. Australian Journal of Agricultural Research 37, LETOUZÉ A., GASQUEZ J., A rapid test for screening aryloxyphenoxy-propionic acid resistance within Alopecurus myosuroides and Lolium spp. populations. Weed Research 39, MARODER H.L Physiological effects of dalapon in Cynodon dactylon (L.) Pers. Weed Research 13, MOSS S.R., Techniques for determining herbicide resistance. Brighton Crop Protection Conference- Weeds 2, MURRAY B.G., FRIESEN L.F., BEAULIEU K.J A seeds bioassay to identify acetyl-coa carboxilase inhibitor resistant wild oat (Avena fatua) populations. Weed Technology 10, READE J.P.H., BELFIELD J.L., COBB A.H., Rapid tests for herbicide resistance in black-grass based on elevated glutathione S-transferase activity and abundance. Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference- Weeds 1, pp SEEFELDT S.S., JENSEN J.E., FUERST E.P Log-logistic analysis of herbicide dose-response relationships. Weed Technology 9, SIXTO H., ESCORIAL C., GARCÍA-BAUDÍN J.M., CHUECA M.C., Efecto del herbicida glifosato sobre la germinación de semillas de cereales. Método rápido de selección. Actas Congreso SEMh Valencia, pp WILKINSON R.E The physiological activity of 2,2-dichloropropionic acid. PhD. Dissertation. University of California Davis. 148pp. ZADOKS J.C., CHANG T.T., KONZAK C.F., A decimal code for the growth stages of cereals. Weed Research 14,