Medicina [Buenos Aires] ISSN versión impresa

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1 Medicina [Buenos Aires] ISSN versión impresa Medicina (B. Aires) v.66 n.4 Buenos Aires jul./ago download el artículo en el formato PDF Como citar este artículo Sobre la historia de la penicilina La segunda línea Los Premios Nobel son el máximo reconocimiento que un científico, un literato, un pacifista, o un economista puede pretender. Premian logros alcanzados en la física, la química, la medicina o la fisiología, la literatura, la paz y las ciencias económicas. Se otorgan cada año desde 1901, excepto el de Economía creado en El de la Paz comenzó dividido, el de Física se dividió en 1902, el de Literatura en 1904 y el de Química en El de Medicina o Fisiología se otorgó sólo a una persona hasta En 1906 se otorgó a dos, Camilo Golgi y Santiago Ramón y Cajal 1. Se reparten los honores y el dinero del premio Nobel, pero nunca son más de tres personas (o instituciones en el premio de la Paz) los premiados. Es que con sólo tres personas se representa el máximo reconocimiento a los méritos en la ciencia o la literatura? La analogía con los tres actores de las tragedias griegas, pero con tres protagonistas, o con las tres medallas de las olimpíadas modernas, éstas sí con protagonista, deuteragonista y tritagonista, tal vez brote de la cultura clásica de los miembros del Comité Nobel, se deba a creencias en los números mágicos, o a una razón prosaica: si se menudean y distribuyen las coronas suecas a más de tres personas la suma no cambiaría para nada la vida del premiado y perderían valor el premio y los honores. Lo cierto es que siempre quedan sin el premio un cuarto, un quinto o más pretendientes, tal vez tan meritorios. Sus colaboradores, amigos y más a menudo sus compatriotas -el patriotismo es esencial- proceden a considerarlos héroes relegados, ganadores morales. Si se piensa un poco, ambos bandos tienen razón. Por un lado, todo tiene un límite. Por el otro, es improbable que sólo una persona, o tres, hayan sido determinantes totales del éxito de los trabajos premiados. Más de una vez fue decisiva la participación de algún colaborador, sea este profesional, técnico, o aun algún familiar. Patricia Fara, en su libro Pandora's Breeches socava el concepto heroico en la ciencia y resalta que los logros de grandes científicos y pensadores no dependen sólo de ellos, son una obra de conjunto, de muchas habilidades, de muchas personas, de muchas mujeres, de un medio adecuado 2. Los protagonistas no son héroes, pero tienen singulares cualidades. Detrás de los famosos y premiados, detrás de los actores

2 conocidos de cualquier drama histórico, quedan actores olvidados, personas de la segunda línea, para nada menores, porque sin ellas los protagonistas tal vez no hubieran alcanzado ni la fama ni la gloria ni las coronas suecas. En otras palabras, de Tony Rothman esta vez: "Pero si la historia de la ciencia tiene alguna relevancia, seguramente es recordarnos que la ciencia es una empresa colectiva y engendrar en nosotros la humilde conciencia que el panorama de la ciencia sería muy diferente si la mayoría no reconocida nunca hubiera existido" 3. Esta nota se limitará a un ejemplo: tres personas premiadas con el Nobel y una olvidada. Esta última recordada por Eric Lax en The mold in Dr. Florey's coat. The story of the penicillin miracle 4. Lax enfoca su relato en cuatro personajes. Uno muy conocido: Alexander Fleming, escocés, ( ); dos pocos conocidos: Ernst Boris Chain, alemán refugiado en Inglaterra ( ) y Howard Walter Florey, australiano afincado en Inglaterra ( ), los tres galardonados con el Premio Nobel de Medicina o Fisiología del año El premio, en partes iguales, lo obtuvieron "for the discovery of penicillin and its curative effect in various infectious diseases" 5. La penicilina comenzó el mayor cambio de la medicina en el siglo XX. El cuarto personaje es un desconocido, Norman George Heatley ( ), y, lo que ahora nos interesa, Lax destaca su participación en el logro. El libro de Lax, publicado en el 2004, refiere de nuevo y con ecuanimidad la historia, agrega noticias íntimas, impublicables en vida de los actores, y el testimonio de Heatley, resultado de sus conversaciones y el acceso a sus diarios. Lax caracteriza a Fleming como "el escocés callado"(o taciturno), a Florey como el "áspero genio colonial" y a Chain como el "temperamental continental" (europeo), y al tercer miembro del equipo inicial de Florey, Heatley, el que no recibió el premio, como el "maestro de los micro-métodos" (The micro master). De Alexander Fleming poco diremos; es casi el único conocido y endiosado de los tres premiados. En nuestro país, como en otros, calles, avenidas, clínicas, institutos, hospitales, colegios, y hasta una imprenta, llevan su nombre. A su personalidad, suficientemente excepcional, el periodismo y la propaganda le han fabricado mitos que periódicamente se repiten y adornan 6. Para muestras algunos botones, por ejemplo: un mito repetido en un éxito editorial local 7. O atolondradas contribuciones vernáculas al mito, por ejemplo: "Alexander Fleming, que trabajaba en un hospital público y gratuito en Londres, descubrió la penicilina" 8. O este otro: "A diferencia del médico escocés que llevó adelante sus investigaciones en un modesto laboratorio, Florey contaba con un laboratorio bien equipado y con un aceitado equipo de investigadores" 9. Por supuesto que son o medias verdades o fantasías. El lector interesado puede recurrir, para clarificarse, a la documentada biografía de Fleming escrita por Gwyn MacFarlane 10 (traducida al castellano), a la biografía de Florey escrita por el mismo MacFarlane 11, a la de Chain escrita por Ronald W. Clark 12, o, para empezar, al libro de Lax. Pero, quien desee conocer cómo la penicilina llegó a la terapéutica, nada mejor que el capítulo Penicillin: Historical introduction en Antibiotics, obra escrita por Florey y sus colaboradores 13. El trabajo de Fleming sobre el descubrimiento de la penicilina se publicó en Desde entonces hasta

3 1940 sólo se utilizó el caldo de cultivo del Penicillium notatum como antiséptico local con buenos pero no resonantes resultados. Los intentos de extraer la sustancia activa se abandonaron por ser ésta muy lábil. No se hicieron experimentos en animales para determinar su eficacia en infecciones sistémicas, "esto es, su poder quimioterapéutico no se había revelado" 13a. Aquí interviene, a fines de 1939, el "aceitado equipo" de la Sir William Dunn School of Pathology de Oxford, y el trabajo sobre la penicilina "es tomado vigorosamente por Chain, Florey y Heatley" 13b. Chain, se ocuparía de las propiedades químicas y bioquímicas, Heatley, al comienzo asistente de Chain, de la producción, de cómo cultivar la mayor cantidad posible de P. notatum que produzca la mayor cantidad del principio activo y, finalmente, de separarlo del caldo de cultivo y purificarlo, Florey se ocuparía de los aspectos biológicos y farmacológicos y de la ardua tarea de conseguir fondos. Entre septiembre de 1939 y mayo de 1940 trabajaron para obtener esa cantidad de penicilina. Finalmente Heatley consigue un "extracto de penicilina" suficiente para estudiar su toxicidad y realizar la prueba terapéutica. El 25 de mayo de 1940 llega la prueba terapéutica: inyectan dos ratones con una cepa de estreptococo hemolítico y les administran cinco dosis del extracto de penicilina a distintos tiempos después de la infección; otros dos ratones se infectan y reciben sólo una dosis de penicilina una hora después de infectados. Cuatro ratones sirven de controles, se infectan y no reciben penicilina. De los ratones que reciben cinco dosis de penicilina uno muere 16 días después, el otro vive indefinidamente; los que reciben sólo una dosis de penicilina mueren dos y seis días después. Todos los controles mueren dentro de las 16 ½ horas después de la inyección de estreptococos. Total de ratones: ocho. Cuando, después del experimento, Florey, Chain y Heatley se reunieron, se dice que Florey dijo: It looks quite promising. Con otra persona mostró más entusiasmo, le dijo: It looks like a miracle 11a. The experiment, imperfect as it was, sufficed to give grounds for the hope that penicillin would have some systemic chemotherapeutic properties so that is was clear that further investigation should be carried out with as great speed as possible. N.G. Heatley devoted his attention to the production of penicillin while the collaboration of others workers secured a wider examination of the other problems involved. [ ] 13c. El párrafo enumera una lista de colaboradores y termina con esta frase: The work was much accelerated by the most intimate collaboration of all concerned and the success attained was undoubtly due to the combined efforts of the members of the group. Heatley se concentró en la producción de penicilina y consiguió: 1) Cultivar una gran cantidad de hongos que produjeran más rápido mayor cantidad de penicilina, suficiente para que Chain estudiara sus características químicas y Florey probara sus propiedades biológicas. Primero en Oxford, en escala reducida (y el recipiente más eficiente para el cultivo resultó el orinal chato de los hospitales). Luego se trasladó a EE.UU. para colaborar en la producción en escala industrial. 2) Un método para medir la actividad de esa penicilina, el método del cilindro y

4 la placa, usado luego millones de veces. 3) Un ingenioso método de contracorriente para extraer la inestable penicilina del caldo del cultivo sin perderla en los pasos intermedios. El procedimiento estaba basado en hechos conocidos desde 1932: si una solución acidificada con penicilina se mezcla y sacude con éter, la penicilina pasa al éter, pero no si la solución tiene ph neutro. La contribución de Heatley, a su juicio risible, aunque admitía que le había costado un duro esfuerzo mental, fue sacudir el extracto etéreo con agua mantenida en ph neutro con un buffer o álcali, de esa manera la penicilina pasaba a la fase acuosa 14. 4) Demostrar su estabilidad en los tejidos y líquidos del organismo: el hígado y la sangre de rata no la destruían. Florey pensó que si Alemania invadía Gran Bretaña y se producía el desastre, debían destruir registros y aparatos; a Heatley se le ocurrió preservar la cepa de Penicilliun notatun productor de la penicilina, frotando esporas del hongo, indetectables y durmientes, en el forro de sus ropas. De allí el título de The mold in Dr. Florey's coat. Las esporas se frotaron en las ropas de Florey, Chain, Heatley y otras dos personas, si alguno escapaba podía reanudar el trabajo 11b, 4a. Chain, hijo de un químico industrial, quería patentar los descubrimientos. Florey, indeciso, y ante la insistencia de Chain, recurrió al consejo de E. Mellamby, Secretario, y de Sir Henry Dale, Presidente, del Medical Research Council, quienes lo persuadieron de que no era ético patentar un descubrimiento médico. Florey, probablemente de acuerdo con ellos, no insistió, no lo hizo 11c. Y el Reino Unido debió pagar regalías por muchos años para fabricar una droga descubierta, aislada, investigada y desarrollada allí. Heatley, hijo de un veterinario, desde niño mostró una habilidad manual fuera de lo común, como la de su padre. Estudió en Cambridge, fue ayudante de Frederick Gowland Hopkins y se convirtió en un experto en cualquier micro-método: químico, bioquímico, físico, etc. Recomendado por Chain fue reclutado por Florey cuando estaba a punto de instalar un laboratorio comercial; Heatley comenzó como asistente de Chain, pero no pueden concebirse dos personalidades más distintas y opuestas. Ocurrió lo que era de esperar, pasó a depender directamente de Florey. Heatley era: "El más versátil ingenioso y habilidoso mecánico en cualquier escala, grande o minúscula. A su formación en biología y bioquímica podía añadirles sus habilidades técnicas en óptica, trabajo con vidrio o metal, plomería, carpintería y toda labor en electricidad necesaria en esos días pre-electrónicos. Sobre todo podía improvisar, usar los más improbables pedazos de equipos de laboratorio o domésticos para hacer un trabajo con la mínima pérdida posible de tiempo" 11d. "Modesto en exceso, cortés, bueno, considerado, constante en buscar la manera de ayudar a colegas y amigos [y a becarios inexpertos, desorientados, y cortos de genio]. Era un jugador de equipo más que un líder" 15. La publicidad y la fama atraparon a Fleming. A los tres premiados se les concedió el rango de caballeros. Florey quiso compartir las coronas suecas con sus colaboradores, E. P. Abraham le aconsejó no hacerlo, divididas no serían muchas para nadie. En agradecimiento Florey compró, a cada uno, un juego de copas de vino de cristal sueco de color azul. Heatley nunca las usó; en ellas no se puede apreciar el color del vino,

5 dijo, y cuando se rompió una copa, no le importó 4b. Florey fue luego Presidente de la Royal Society, Provost del Queen's College de Oxford, se convirtió en Lord Florey, Baron of Adelaide and Marston, y recibió la Orden del Mérito, la más alta distinción civil del Reino Unido. Después de la penicilina, Heatley colaboró en el comienzo del estudio que condujo a las cefalosporinas. El trabajo lo continuaron E. P. Abraham y Guy Newton quienes descubrieron, purificaron y establecieron la estructura de la cefalosporina C, la primera de la familia. Esta vez el compuesto y la estructura del anillo básico se patentaron y los cuantiosos beneficios se dedicaron a la investigación en la universidad y el Lincoln College 16. E.P. Abraham le ofreció a Heatley participar en los beneficios, Heatley le respondió que el sueldo de la Universidad bastaba para su familia 4c. A Heatley no lo alcanzó la publicidad ni la fama ni la fortuna. La Royal Society no lo incorporó cuando fue propuesto. Su apocamiento y el rumor que sólo era un par de manos de Florey no lo favorecieron. Los honores llegaron tarde; finalmente llegaron. En 1978, cuando se retiró, Heatley recibió la Orden del Imperio Británico (OBE) y, en 1990, la Universidad de Oxford le confirió el grado honorario de Doctor en Medicina, el primero conferido en los 800 años de historia de la universidad 4d. La interpretación más breve y acertada de esta historia es la de Henry Harris, sucesor de Florey en la Sir William Dunn School of Pathology: To sum it all up: without Fleming, no Chain or Florey; without Chain, no Florey; without Florey, no Heatley; without Heatley, no penicillin. 17. Juan Antonio Barcat jabarcat@yahoo.com.ar 1. Nobel Foundation. En: consultado Fara P. Pandora's Breeches. Women, Science and Power in the Enlightment. London: Pimlico, Epi-logue, p Comentario en Medicina (Buenos Aires) 2005; 65: Rothman T. Lost in Einstein's Shadow. Einstein gets the glory, but others were paving the way. Am Sci 2006; 94: Lax E. The mold in Dr. Florey's coat. The story of the penicillin miracle. New York: Henry Holt, a)p126; b)260-1; c)p 260; d)p Nobel Foundation. En: consultado el Barcat JA. Churchill, Fleming y la penicilina. Medicina (Buenos Aires) 1994; 54: Paenza A. Matemática... Estás ahí? Sexta Edición. Buenos Aires: Siglo XXI, p 96-7). 8. Capanna P. El precio del saber. Página/ Marconi A. Informe penicilina. Página/ MacFarlane G. Alexander Fleming. The man and the Myth. Cambridge (MA): Harvard UP, Versión en español: Fleming. Barcelona: Salvat, MacFarlane G. Howard Florey. The making of a great scientist. Oxford: Oxford UP, a) p 315; b) p 321-2; c) p 336; d) p Clark RW. The life of Ernst Chain. Penicillin and Beyond. New York: St. Martin's Press, Florey HW. Chain E, Heatley NG, Jennings MA, Sanders AG, Abraham EP, Florey ME. Antibiotics, II. Chapter 15: Penicillin: Historical Introduction. p a) p 637; b) p

6 635; b) p Anón. Making Penicillin Possible: Norman Heatley Remembers. (An interview with Norman Heatley). En: Science Watch, Nov/Dec com/interviews/norman_heatly.htm; consultado el Anón. Norman Heatley - A remarkable man. Fusion. A newsletter of the Sir William Dunn School of Pathology. 2004; 1: 6-9 (Issue 3. Trinity 2004). En: ox.ac.uk/news.htm; consultado el University of Oxford. Annual Review 2000/2001. En: consultado el Harris H. Howard Florey and the development of penicillin. Notes Rec R Soc Lond. 1999; 53: Fundación Revista Medicina [Buenos Aires] Combatientes de Malvinas 3150 (C1427ARO) Ciudad Autónoma de Buenos Aires República Argentina Tel./Fax: (+54 11) revmed@intramed.net.ar

7 SECUNDARIOS Metabolitos secundarios microbianos. Un tipo más complejo de productos industriales es aquel en el que el producto deseado no se produce durante la fase primaria del crecimiento sino durante la fase estacionaria. Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria se denominan metabolitos secundarios y son algunos de los metabolitos más comunes y más importantes de interés industrial. Los más conocidos y más ampliamente estudiados son los antibióticos y en la imagen inferior puede verse la cinética del proceso de obtención de la penicilina. Mientras que el metabolismo primario es generalmente similar en todas las células, el metabolismo secundario presenta claras diferencias entre un organismo y otro. Las características reconocidas del metabolismo secundario son: 1. Cada metabolito secundario sólo lo forman relativamente pocos organismos. 2. Los metabolitos secundarios, aparentemente no son esenciales para el crecimiento y la reproducción. 3. La formación de metabolitos secundarios es extremadamente dependiente de las condiciones de crecimiento, especialmente de la composición del medio. Con frecuencia, se produce la represión de la formación del metabolito secundario. 4. Con frecuencia, los metabolitos secundarios se producen como un grupo de estructuras estrechamente relacionadas. Por ejemplo, se ha visto que una sola cepa de una especia del Streptomyces produce 32 antibióticos distintos pero relacionados, del tipo antraciclina. 5. Con frecuencia es posible obtener una espectacular superproducción de metabolitos secundarios, en tanto que los metabolitos primarios, ligados como están al metabolismo primario, usualmente no se pueden superproducir de una manera tan espectacular. Los metabolitos secundarios son moléculas sintetizadas por determinados microorganismos, normalmente en una fase tardía de su ciclo de crecimiento, cuyas características son: (i) No son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce. En estado natural, sus funciones se hallan ordenadas a la supervivencia de la

8 especie, pero cuando los microorganismos que los producen se desarrollan en cultivo puro los metabolitos secundarios no desempeñan esa misión. (ii) Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados químicamente entre sí. Por ejemplo, una única cepa de una especie del género Streptomyces produce 32 antraciclinas diferentes. (iii) Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de organismos. (iv) La producción puede perderse fácilmente por mutación espontánea (degeneración de la raza), por lo que son muy importantes las técnicas de conservación de estos microorganismos. De todos los productos tradicionales obtenidos por fermentación, los más importantes para la salud humana son los metabolitos secundarios. Donde se incluyen, además de los antibióticos, ciertas toxinas (micotoxinas), alcaloides (ácido lisérgico), factores de crecimiento vegetal (giberelinas) y pigmentos. Los metabolitos secundarios mejor conocidos son los antibióticos, de los que se han descubierto más de 5000, cifra que aumenta a razón de una media aproximada de 300 por año, aunque la mayoría carecen de utilidad pues son tóxicos para los organismos vivos. Aproximadamente el 75% de los antibióticos conocidos son producidos por actinomicetos. Algunas especies son excepcionales productores de antibióticos, por ejemplo Streptomyces gryseus produce al menos 40 antibióticos diferentes. El metabolismo secundario se da en fases Trofofase e idiofase.. La trofofase es la fase de crecimiento logaritmico (el prefijo trofos, significa "crecimiento" ) donde normalmente no se producen los metabolitos secundarios, mientras que la fase de producción de metabolitos es la idiofase. Si estamos tratando con un metabolito secundario debemos asegurar que durante la trofofase se proporcionen las condiciones apropiadas para un excelente crecimiento y que las condiciones se alteren

9 adecuadamente y en el momento oportuno para que la formación del producto sea excelente. Aunque es una simplificación pensar sólo en dos fases, esta simplificación nos permite comprender mejor la fermentación industrial de los metabolitos secundarios. Es decir, si nosotros queremos producir un metabolito secundario primero debemos asegurar las condiciones apropiadas durante la trofofase para un buen crecimiento y después, debemos alterar esas condiciones en el momento adecuado para asegurar una excelente producción del metabolito secundario. Este retraso en la formación de metabolitos secundarios es uno de los principales mecanismos mediante el cual los microorganismos productores de antibióticos evitan el suicidio, puesto que al comienzo de la fase logarítmica de crecimiento son sensibles a su propio antibiótico, para posteriormente, durante la idiofase, volverse resistentes al antibiótico que están produciendo En el metabolismo secundario, la producción en cuestión puede no derivarse del sustrato primario del crecimiento, sino a partir de un producto que él mismo formó a partir del sustrato primario del crecimiento. Por tanto, el metabolito secundario se produce, generalmente, a partir de varios productos intermedios que se acumulan, bien en el medio de cultivo o bien en las células, durante el metabolismo primario. Una característica de los metabolitos secundarios es que las enzimas implicadas en la producción del metabolito secundario están regulados separadamente de las enzimas del metabolismo primario. En algunos casos se han identificado inductores específicos de la producción de metabolitos secundarios. Por ejemplo, se ha identificado un inductor específico de la producción de estreptomicina, un compuesto denominado Factor A. EFECTO DE LOS PRECURSORES O INDUCTORES EN LOS METABOLITOS SECUNDARIOS Los factores que ponen en marcha la producción de metabolitos secundarios al final de la trofofase no se conocen; únicamente se sabe que este mecanismo

10 se dispara normalmente cuando algún nutriente del medio se ha agotado. En algunas ocasiones el nutriente responsable es una fuente de Carbono, en otras, sin embargo es el Nitrógeno o el Fósforo. La explicación puede ser que al faltar nutrientes se alteren los metabolitos primarios y se originen inductores de los enzimas encargados de la síntesis de los metabolitos secundarios. Otra explicación puede ser que al faltar la fuente de Carbono cesa la represión por catabolito, sintetizándose a partir de este momento los enzimas necesarios para la biosíntesis de estos metabolitos secundarios. Cualquiera que sea el mecanismo general por el que se dispara el metabolismo secundario al final de la trofofase, es un hecho que en este punto hay unos cambios muy fuertes en la composición enzimática de las células, apareciendo los enzimas que están específicamente relacionados con la formación de metabolitos secundarios. Sin embargo, e independientemente de este aspecto general del metabolismo secundario, se ha puesto de manifiesto la existencia de sistemas de regulación que juegan un papel importante en la síntesis de determinados productos industriales. Las manipulaciones, tanto del medio de cultivo como de las condiciones ambientales que se llevan a cabo durante el screening secundario de una forma sistemática, incluyen la adición de centenares de aditivos en los medios de cultivo que puedan actuar como posibles precursores del producto que estamos investigando. Ocasionalmente se encuentra un precursor que incrementa de forma notable la producción de este metabolito secundario. El precursor puede incluso dirigir la síntesis de un determinado producto de entre varios que se producían anteriormente; es lo que se conoce como biosíntesis dirigida. Como ejemplos de precursores están el ácido fenilacético en el caso de la producción de bencil penicilina; determinados aminoácidos específicos en la producción de actinomicinas y tirociclinas; ácidos benzoicos sustituidos en la formación de novobiocinas. En muchas fermentaciones, sin embargo, los precursores no muestran ninguna actividad. Esto es debido a que su síntesis por el microorganismo no es el

11 factor limitante de la producción del metabolito secundario. En estos casos, la adición de aditivos ha revelado efectos dramáticos, tanto estimuladores como inhibidores en la producción del metabolito secundario por parte de una molécula no precursora. Este efecto se debe normalmente a la interacción de estos compuestos con los mecanismos reguladores del microorganismo productor. Precisamente, estudiando estos efectos se puso de manifiesto que los mecanismos reguladores de los microorganismos ejercen un efecto notable en la producción de los metabolitos secundarios. INDUCCION ENZIMATICA EN LOS METABOLITOS SECUNDARIOS A lo largo de los estudios sobre el papel que el triptófano juega como estimulador de la biosíntesis de alcaloides por Claviceps (Cornezuelo del centeno) se puso de manifiesto que la inducción enzimática juega un papel importante en la producción de metabolitos secundarios. Si bien el triptófano es un precursor en la biosíntesis de estos alcaloides, no es un factor limitante; ya que su efecto estimulador se debe en gran parte a la inducción de la síntesis de los enzimas que dan lugar a la síntesis de los alcaloides. Existen tres razones que han llevado a esta conclusión: (i) Los análogos del triptófano, que no se incorporan a la molécula del alcaloide, es decir, que no son precursores, estimulan la producción de los alcaloides. (ii) El triptófano se debe añadir durante la trofofase ya que si se añade durante la idiofase tiene poco efecto. (iii) El triptófano añadido es absorbido por la célula durante la fase de crecimiento y alcanza su mayor concentración intracelular justo antes de la síntesis de los alcaloides. Otro efecto de inducción similar es el de la metionina en la biosíntesis de cefalosporina por Cephalosporium acremonium. A pesar de que la metionina provee azufre al antibiótico, la estimulación de la formación de cefalosporina C

12 se debe a un efecto de inducción. Se llegó a esta conclusión ya que la metionina debe añadirse durante la trofofase; además, la metionina puede ser reemplazada por su análogo norleucina que no tiene azufre en su molécula, por lo que su efecto no puede ser debido al hecho de aportar azufre. La inducción también juega un papel muy importante en determinar la relación entre los componentes de la mezcla que se produce en una fermentación. Por ejemplo, en la fermentación para la producción de estreptomicina se produce estreptomicina y manósido estreptomicina. La conversión de manósido estreptomicina en estreptomicina se cataliza mediante el enzima -Dmanosidasa que es inducido por manano. V. REGULACION POR RETROALIMENTACION EN LOS METABOLITOS SECUNDARIOS La regulación por retroalimentación también parece jugar un papel fundamental en el metabolismo secundario. Por ejemplo, el cloranfenicol al igual que la cicloheximida, penicilina y otros antibióticos limitan su propia producción actuando por retroalimentación generalmente sobre el primer enzima de la ramificación que conduce a la síntesis de este metabolito. Otro caso de regulación por retroalimentación sucede cuando la ruta metabólica ramificada, mediante la cual se sintetiza el metabolito secundario, conduce a su vez a la síntesis de un metabolito primario, como es el caso de la lisina y la penicilina en Penicillium chrysogenum. En un primer momento se encontró que la L-lisina disminuía la producción de penicilina, pero no se sabía porqué; hasta que se descubrió que el -aminoadipato es un intermediario en la biosíntesis de los dos, lisina y penicilina. La disminución en la formación de penicilina por lisina está causada por la inhibición por retroalimentación de la homocitrato sintasa, que es el primer enzima en la biosíntesis de lisina. Otro camino mediante el cual actúa la regulación por retroalimentación en la formación de metabolitos secundarios implica la inhibición y la represión de las fosfatasas por fosfato. Muchas fermentaciones se inhiben por ortofosfato

13 (H 3 PO 4 ) a concentraciones (>10 mm) que no son inhibidoras para el crecimiento. En algunos casos se explica ya que los intermediarios de la ruta metabólica del producto que nos interesa están fosforilados, aunque el producto final no lo esté. Las fosfatasas actuarían en estos intermediarios. Un ejemplo lo tenemos en la biosíntesis de estreptomicina donde actúan varias fosfatasas en la formación de estreptidina y en el último paso, desfosforilación de la estreptomicina fosfato, donde el enzima que cataliza esta reacción también está inhibida por el fosfato inorgánico. VI. REGULACION CATABOLICA EN LOS METABOLITOS SECUNDARIOS La represión catabólica fue observada en la industria de antibióticos mucho antes de que se conociera y se entendiera el significado general de este fenómeno. Durante el desarrollo de la producción de penicilina se observó que la glucosa, que era una magnífica fuente de carbono para el crecimiento del microorganismo, era un sustrato muy malo para la producción de penicilina; sin embargo, se observó que la lactosa, que soporta un crecimiento muy pobre, es un buen sustrato para la producción de penicilina. Por lo tanto, el medio clásico de Jarvis y Johnson lleva una mezcla de glucosa y lactosa. Los mecanismos moleculares de la regulación catabólica se esclarecieron en la década de los 70. Hoy sabemos que la regulación catabólica está mediada por el nivel intracelular de un nucleótido especial, el monofosfato cíclico de adenosina (AMPc), cuyo nivel intracelular es inverso a la concentración de glucosa en el medio de cultivo. Mientras existe glucosa en el medio de cultivo el nivel intracelular de AMPc es sumamente reducido, debido a que la glucosa inhibe la actividad adenilciclasa, enzima que interviene en la síntesis de AMPc. Cuando la glucosa del medio se agota, la concentración intracelular de AMPc aumenta rápidamente. El AMPc sintetizado forma un complejo con una proteína existente en la célula, denominada "proteína receptora de AMPc". Este complejo de proteína receptora y AMPc actúa sobre el gen promotor al objeto de inducir la síntesis de los enzimas necesarios para la utilización de otras

14 fuentes de carbono distintas a la glucosa. La glucosa inhibe gran cantidad de metabolitos secundarios. La represión catabólica también juega un papel importante en la determinación de la concentración relativa de cada uno de los antibióticos de una misma familia química que se producen en una fermentación. Este es el caso de la producción de estreptomicina por Streptomyces gryseus. Como ya hemos dicho, el manano es el inductor de la manosidasa que convierte la manósido estreptomicina en estreptomicina; sin embargo, este enzima no se sintetiza si hay glucosa (>0,5%) en el medio debido a la represión catabólica. Sólo cuando la glucosa ha desaparecido se produce el enzima que es inducido por manano. En este caso la represión catabólica juega un papel fundamental en el porcentaje de manósido estreptomicina producido en esta fermentación. VII. REGULACION POR EL ESTADO O CARGA ENERGETICA EN LOS METABOLITOS SECUNDARIOS La producción de clortetraciclina se reduce en gran cantidad cuando existe fosfato inorgánico en el medio. En las fermentaciones para la producción de clortetraciclina, la idiofase comienza cuando se agota el fosfato en el medio. Puesto que en la biosíntesis de clortetraciclina donde intervienen 72 intermediarios, ninguno de ellos fosforilado, este efecto del fosfato no se debe a la regulación por retroalimentación de fosfatasas. Sin embargo, es posible que esta regulación esté mediada por la carga energética ya que el contenido en ATP de dos cepas de Streptomyces aureofaciens, una poco productora (200 µg/ml) y la otra muy productora (2000 µg/ml) de clortetraciclina, difieren en que la cepa menos productora tiene de 2 a 4 veces más ATP que la más productora. En ambas cepas la concentración de ATP aumenta en la trofofase y disminuye en la idiofase, durante la producción de clortetraciclina. VIII. INCREMENTO DE LA PRODUCCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS La mayoría de los controles descritos en este capítulo se eliminan mediante manipulación ambiental o mediante la obtención de mutantes mal regulados.

15 1.- Manipulación ambiental Catabolito: eliminación de la glucosa del medio. Inducción: adición de manano al medio. Carga energética: disminución de fosfato en el medio. Precursores: adición de precursores al medio. 2.- Selección de mutantes mal regulados A. Revertientes La estrategia consiste primeramente en seleccionar las mejores cepas productoras del antibiótico. Estas cepas se someten a mutación con un agente mutágeno (UV, luz ultravioleta o NTG, nitrosoguanidina). De los mutantes obtenidos se seleccionan aquellos que no sean productores del antibiótico (se seleccionan aquellas cepas que poseen una proteína inactiva). Estos mutantes se vuelven a someter a mutación y se seleccionan aquellas cepas que sean de nuevo productoras del antibiótico (se obtienen mutantes dobles desregulados en un gen en el que actúa esa proteína inactiva). B. Resistencia a análogos La estrategia es la misma que la descrita con los metabolitos primarios. C. Mutasíntesis Se realiza mediante la mutación en el gen que codifica para un precursor del antibiótico natural, con lo que se consigue la síntesis de una molécula de antibiótico incompleta. Cuando se añade al medio el precursor que no puede sintetizar el microorganismo, éste reanuda la producción del antibiótico natural. De esta manera se pueden obtener nuevos antibióticos simplemente añadiendo precursores con estructuras ligeramente diferentes.

16 TEMA 12: TIPOS DE FERMENTADORES Dr. Pedro F. Mateos González I. INTRODUCCION El objetivo de la biotecnología es obtener productos metabólicos útiles a partir de materiales biológicos. La biotecnología comprende dos fases distintas: la fermentación y la recuperación de los productos. Para el cultivo de microorganismos en condiciones óptimas, así como para la producción, por parte de los microorganismos, de los metabolitos o los enzimas deseados, deben ser desarrollados procedimientos de fermentación como son el desarrollo de cepas mediante manipulación genética y/o la regulación del metabolismo mediante la optimización del medio de cultivo así como el control adecuado de los factores físico-químicos que afectan al rendimiento de las fermentaciones industriales (0 2, Tª, ph, etc.). La recuperación del producto o "procesamiento posterior" (del inglés downstream processing) conlleva la extracción y purificación de los productos biológicos. La recuperación en los procesos bioquímicos difiere de la recuperación química, principalmente, en que los materiales biológicos son frecuentemente mucho más lábiles. Por lo tanto, la producción de productos metabólicos útiles a partir de microorganismos conlleva una íntima relación entre la Ciencia y la Tecnología. por un lado se deben desarrollar los microorganismos de interés industrial y por otro se debe asegurar que estos microorganismos puedan crecer en gran cantidad bajo aquellas condiciones que originen el mejor rendimiento posible del producto. A simple vista uno puede pensar que aquellas condiciones que se han encontrado ser las más efectivas a pequeña escala deberían ser igual de efectivas a larga escala y que para conseguir este objetivo únicamente es necesario usar un recipiente mayor con el correspondiente incremento de

17 volumen del medio. Nada más lejos de la realidad. Por ejemplo, se puede conseguir un buen crecimiento de un microorganismo aerobio en un matraz de 200 ml mediante agitación en un incubador usando un rotor de 300 w. Si nosotros simplemente ampliamos este sistema, un único fermentador de litros requeriría un agitador con un motor de 15 megawatios. Dicho motor debería ser tan grande como una casa y el calor generado durante la agitación herviría a los microorganismos. En líneas generales, un proceso típico de fermentación comienza con la formulación y esterilización del medio de cultivo así como la esterilización del equipamiento. Las células se crecen primero en un cultivo de mantenimiento (5 a 10 ml), posteriormente en un matraz (200 a ml) y de ahí en un prefermentador (10 a 100 L) para finalmente inocular el fermentador de producción (1.000 a L). Una vez que la fermentación se ha completado, las células se separan del cultivo líquido. Si el producto es intracelular, se rompen las células, se eliminan los restos celulares y se recupera el producto del fluido libre de restos celulares. Si el producto es extracelular, se purifica a partir del sobrenadante libre de células. Hasta ahora hemos visto el desarrollo de las cepas así como el diseño de los medios de cultivo. A continuación vamos a desarrollar los aspectos tecnológicos de las fermentaciones. II. DISEÑO Y FUNCIONAMIENTO DEL FERMENTADOR El estudio detallado del diseño de un fermentador cae fuera del objetivo de esta asignatura que se concentra en los principios biológicos de la biotecnología. Sin embargo, como la tecnología de los procesos fermentativos es una amalgama de técnicas biológicas e ingeniería química, se hace necesario proporcionar un breve resumen de los tipos de fermentadores disponibles y de sus principales características. A continuación paso a describir una lista de 13 puntos considerados como los criterios más importantes para el diseño de un fermentador: 1.- El tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante numerosos días, así como para las operaciones de más larga duración.

18 2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir las necesidades metabólicas de los microorganismos. 3.- El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible. 4.- Debe tener un sistema para el control del ph. 5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras. 6.- Debe existir un sistema para el control de la temperatura. 7.- Las pérdidas por evaporación no deben ser excesivas. 8.- El diseño del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el funcionamiento, recolección, limpieza y mantenimiento sean mínimas. 9.- El tanque debe ser versátil para la aplicación de diversas modalidades de procesos Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea posible, soldaduras La geometría del fermentador debe ser similar a otros tanques más pequeños o mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos a diferentes escalas deben emplearse los materiales más baratos que proporcionen resultados satisfactorios Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador. El mantenimiento de un ambiente aséptico y unas condiciones aeróbicas son, probablemente, los dos puntos de mayor relevancia que hay que considerar. Los fermentadores más ampliamente utilizados a nivel industrial están provistos de mecanismos de agitación, dispersión y aireación así como de sistemas para el control de la temperatura, ph y formación de espuma.

19 III. TIPOS DE FERMENTACIONES 1.- Fermentación discontinua Una fermentación discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema cerrado". Al inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y se inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el ph. La composición del medio de cultivo, la concentración de la biomasa y la concentración de metabolitos cambia generalmente como resultado del metabolismo de las células observándose las cuatro fases típicas de crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte. En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final de la fase logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte (metabolitos secundarios). 2.- Fermentación alimentada (fed-batch) En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir, todos los sustratos se añaden al principio de la fermentación. Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la fermentación alimentada que se utiliza en la producción de sustancias como la penicilina. En los procesos alimentados, los sustratos se añaden escalonadamente a medida que progresa la fermentación. La formación de muchos metabolitos secundarios está sometida a represión catabólica (efecto glucosa). Por esta razón en el método alimentado los elementos críticos de la solución de nutrientes se añaden en pequeñas concentraciones al principio de la fermentación y continuan añadiéndose a pequeñas dosis durante la fase de producción. 3.- Fermentación continua En la fermentación continua se establece un sistema abierto. La solución nutritiva estéril se añade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solución utilizada de los nutrientes, con los microorganismos, se saca simultáneamente del sistema.

20 El objetivo fundamental de la industria de las fermentaciones es minimizar costes e incrementar los rendimientos. Este objetivo puede alcanzarse si se desarrolla el tipo de fermentación más adecuado para cada paso en particular. Si bien los procesos de fermentación continua no se utilizan de forma general en la industria, debido fundamentalmente al mayor nivel de experiencia que se tiene en el crecimiento de células en fermentación discontinua, el coste de producción de biomasa mediante cultivo continuo es potencialmente inferior al de cultivo discontinuo. De este modo se han instalado plantas de producción para la producción continua de proteína de origen unicelular a partir de n- alcanos, compuestos C1 y almidones. Aunque muchas fermentaciones para la producción de metabolitos funcionan bien como procesos continuos, sólo unos pocos procesos han resultado útiles para la aplicación práctica por varias razones: a.- Muchos métodos de laboratorio operan continuamente durante solamente 20 a 200 horas; para que sea de utilidad industrial el sistema debe ser estable durante al menos 500 a horas. b.- Mantener las condiciones estériles a escala industrial a lo largo de un largo período de tiempo es difícil. c.- La composición de los sustratos debe ser constante a fin de obtener una producción máxima. La composición de las soluciones de nutrientes industriales son variables (líquido de maceración del maiz, peptona, etc.) lo que puede originar cambios en la fisiología de la célula y disminuir la productividad. d.- Cuando se utilizan cepas de alto rendimiento se producen mutantes degenerados, los cuales pueden crecer en cultivo continuo más deprisa que las cepas de producción por lo que el rendimiento disminuye con el tiempo ya que cada vez son menos células las que sintetizan el producto de interés. 4.- Reactores de enzimas o células inmovilizadas Consiste en pasar el medio fresco a través de un biorreactor en el que por diversas técnicas hemos inmovilizado células (o enzimas). En el biorreactor se producen las transformaciones bioquímicas que deseamos y recuperamos el producto transformado tras su paso por la columna. Con este sistema se eliminan los problemas de desequilibrio (estabilidad) del sistema continuo

21 clásico y además el producto resultante está libre de células. Presenta el inconveniente de que no todos los microorganismos pueden inmovilizarse. Existen tres métodos de inmovilizar las células: a.- Asociación física mediante resinas de intercambio iónico. La unión se puede romper fácilmente. b.- Unión covalente mediante glutaraldehido, tolueno, di-isocianato, iodo acetil celulosa. Unión fuerte aunque inactivación. c.- Atrapamiento mediante colágeno, gelatina, agar, alginatos, poliacrilamida, poliestireno. Es el método más utilizado en inmovilización de células; para ello se mezclan las células con el polisacárido líquido y posteriormente se deja enfriar para que solidifique. Finalmente se fragmenta o granula y se empaqueta en una columna. IV. FACTORES FISICO-QUIMICOS QUE AFECTAN AL RENDIMIENTO DE LAS FERMENTACIONES INDUSTRIALES 1.- Oxígeno 2.- Temperatura 3.- ph 1.- Oxígeno Uno de los factores más críticos en la operación de fermentación a gran escala es el suministro de un intercambio de gases adecuado. El oxígeno es el sustrato

22 gaseoso más importante para el metabolismo microbiano y el anhídrido carbónico es el producto metabólico más importante. El oxígeno no es un gas muy soluble ya que una solución saturada de oxígeno contiene aproximadamente 9 mg / L de este gas en agua. debido a la influencia de los ingredientes del cultivo, el contenido máximo de oxígeno realmente es más bajo de lo que debería ser en agua pura. El suministro se logra pulverizando aire en el fermentador durante el proceso. La ley de Henry describe la solubilidad del oxígeno en soluciones de nutrientes en relación a la presión parcial del oxígeno en la fase gaseosa: P 0 C = H En esta ecuación C es la concentración de O 2 de la solución de nutrientes a saturación, P 0 es la presión parcial del gas en la fase gaseosa y H es la constante de Henry que es específica para cada tipo de gas. A medida que aumenta la concentración de O 2 en la fase gaseosa, aumenta la proporción de O 2 en la solución de nutrientes. En consecuencia, la presión más alta de O 2 se consigue durante la aireación con oxígeno puro. Comparado con el valor obtenido al utilizar aire (9 mg O 2 /L), en agua se disuelven 43 mg O 2 /L cuando se utiliza oxígeno puro. Otra característica es que a medida que aumenta la temperatura desciende la solubilidad del oxígeno. Una vez disuelto el O 2 éste tiene que transferirse desde la burbuja de gas a cada célula individual. Para ello deben ser superadas varias resistencias parcialmente independientes: a.- La resistencia dentro de la película de gas a la interfase. b.- La penetración de la interfase entre la burbuja de gas y el líquido. c.- Transferencia desde la interfase al líquido. d.- Movimientos dentro de la solución de nutrientes. e.- Transferencia a la superficie de la célula. En las fermentaciones que se llevan a cabo con organismos unicelulares como

23 bacterias o levaduras, el factor más importante que controla la velocidad de transferencia es la resistencia en la interfase entre la burbuja de gas y el líquido. Las células microbianas próximas a la burbuja de gas pueden absorber directamente el O2 a través de la interfase aumentando la transferencia del gas a estas células. En los aglomerados de células o en las bolitas de micelio, la transferencia de gas dentro del aglomerado puede ser un factor limitante. Por último indicar la concentración crítica de oxígeno que es el término utilizado para expresar el valor de la velocidad específica de absorción de oxígeno que permite la respiración sin impedimentos. Esta concentración crítica de oxígeno suele tener unos valores concretos para cada microorganismo oscilando de forma general entre el 5% y el 25% de los valores de saturación de oxígeno en los cultivos. 2.- Temperatura La temperatura es otro de los parámetros esenciales para el éxito de una fermentación. Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la óptima tienen retardado su crecimiento y por lo tanto reducida la producción celular, es decir su productividad. Por otro lado, si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una respuesta de estrés al choque térmico con la consiguiente producción de proteasas celulares que ocasionan una disminución en el rendimiento de los productos proteicos. A fin de obtener rendimientos óptimos, las fermentaciones deben ser llevadas a cabo en un margen estrecho de temperatura y a ser posible constante. La velocidad de producción de calor debida a la agitación y a la actividad metabólica de los microorganismos no se ve compensada por las pérdidas de calor que resultan de la evaporación, por lo que se debe recurrir a sistemas de refrigeración. Dentro de éstos, los más utilizados en las fermentaciones industriales son las camisas de agua. 3.- ph La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre ph 5,5 y 8,5. Pero durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son liberados al medio, lo que puede originar un cambio del ph del medio de cultivo. Por lo tanto se debe controlar el ph del medio de cultivo y añadir un ácido o una base cuando se necesite para mantener constante el ph. Por supuesto que esta adición del ácido o base debe ser mezclada rápidamente de tal manera que el ph del medio de cultivo sea el mismo en todo el fermentador.

24 V. AGITACION Y MEZCLADO La agitación es la operación que crea o que acelera el contacto entre dos o varias fases. Una fermentación microbiana puede ser considerada como un sistema de tres fases, que implica reacciones líquido-sólido, gas-sólido y gaslíquido. 1.- La fase líquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. Puede existir, en algunos casos, una segunda fase líquida si existe un sustrato inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos. 2.- La fase sólida consiste en células individuales, bolitas de micelio, sustratos insolubles o productos del metabolismo que precipitan. 3.- La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de oxígeno, para la eliminación del CO 2 o para el ajuste del ph con amonio gaseoso. Una adecuada agitación de un cultivo microbiano es esencial para la fermentación ya que produce los siguientes efectos en las tres fases: 1.- Dispersión del aire en la solución de nutrientes. 2.- Homogeneización, para igualar la temperatura, ph y concentración de nutrientes, en el fermentador. 3.- Suspensión de los microorganismos y de los nutrientes sólidos. 4.- Dispersión de los líquidos inmiscibles. Bajo estas premisas se podría concluir que cuanto mayor sea la agitación, mejor será el crecimiento. Sin embargo, la agitación excesiva puede romper las células grandes e incrementar la temperatura lo que ocasiona un descenso en la viabilidad celular. Por lo tanto, se debe conseguir un balance entre la necesidad del mezclado y la necesidad de evitar el daño celular.