Laboratorio de Salud Pública: Presentación de Experiencias con Métodos Rápidos de Detección

Transcripción

1 Presentación de Experiencias con Métodos Rápidos de Detección Instituto de Ciencias de la Salud Consejería de Sanidad de Castilla-La Mancha

2 Ecología: Abundante su presencia en biocapas Sistemas acuáticos antropogenicos. Relación con protozoos como comensal o parásito. Viven en su interior y se reproducen en muchas ocasiones. Protectores de agresiones externas. Rowbotham TJ 1980 Importante papel en la amplificación y propagación de la Legionella (Rowbotham TJ 1980, Baranree JM 1986). Aparente relación con su capacidad patogénica (Breiman RF 1990, Cirillo JD 1994, Byrne B & Swanson MS 1998). La Legionella coloniza pero no se reproduce en la biocapa (Donlan RM 2005, Murga R, 2001)

3 RD 2210/95, 28 diciembre, incluye la legionelosis como EDO. R.D. 865/03 por el que se establecen criterios higiénico sanitarios para la prevención y control de la legionelosis. Instalaciones con mayor probabilidad de proliferación y dispersión de Legionella: Instalaciones con menor probabilidad de proliferación y dispersión de Legionella: Análisis realizado según la norma ISO 11731, Water quality - detection and enumeration of Legionella. UNE-ISO 11731, Almacenamiento. Concentración. Descontaminación. Siembra. Incubación. Confirmación

4 Inconvenientes recuento en placa. (ISO 11731, 1998). Crecimiento lento: resultados más allá de un semana. Enmascaramiento debido a la microbiota acompañante. Posibles células viables y no cultivables. Recuento de colonias de muy distinta procedencia. 1 Vacuola (10 3 bacterias) -1 UFC (Berk SG, 1998)

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6 Inhibición de Legionella por otros Microorganismos En ocasiones, la microbiota acompañante puede inhibir el crecimiento de Legionella. Ejemplo especies del género Aeromonas o Pseudomona. La presencia de algunos microorganismos en la muestra no desciende la viabilidad de Legionella pero sí su cultivabilidad. Francisco Javier Castro LRSP Comunidad de Madrid Cotuk, A. et al., 2005; Amin A. et al., 2013; Giao M.S. et al., 2011

7 Confirmación (ISO 11731) Morfología característica. Las colonias de Legionella son frecuentemente de color blanco, gris, azul o púrpura, pero también pueden ser de color marrón, rosa, verde-amarillento o rojo intenso Punto UNE-ISO 11731:2007 "Crecimiento excesivo de microorganismos que dificulta la posible detección de Legionella en la muestra analizada. "

8 PCR a tiempo real. Fundamento del método. Multiplica (amplifica) pequeñas cantidades de ADN cientos de miles o millones de veces por la acción de la enzima ADN polimerasa. La amplificación se realiza en un termociclador, aparato capaz de calentar y enfriar rápidamente las muestras. La amplificación se mide al detectar la fluorescencia emitida por un fluoróforo excitado.

9 qpcr Reacción en cadena de la Polimerasa. ISO/TS 12869:2012 (Water quality Detection and quantification of Legionella spp. and/or Legionella pneumophila by concentration and genic amplification by quantitative polymerase chain reaction (qpcr). General testing conditions Expression of the results Technical protocol for the characterization and the validation of the method Procedure Test report Quality controls Concentration DNA extraction DNA amplification Quantitative detection

10 Inconvenientes PCR Tiempo Real. La legislación solo admite ISO (ISO 11731, 1998). Distintas unidades. Falta de exactitud del método de referencia No disponibilidad de la bacteria para estudios posteriores. Imposibilidad de diferenciar células vivas y muertas. Posible presencia de inhibidores de la reacción.

11 Whiley H & Taylor M, 2014 Estudios que en los últimos 10 años han comparado resultados de qpcr y Cultivo: 28 En todos los casos los resultados por qpcr es mayor que en cultivo. Solo en un caso salen resultados equivalentes. Sumando los resultados obtenidos en todos los estudios: PCR: 2.856/3.967 (72%) Cultivo: 1.331/3.967 (34%)

12 ANSES, 2009 Señala las ventajas de el análisis mediante PCR: - Resultados más rápidos. - Mayor detección (brotes) - Posibilidad de generar resultados específicos de L. pneumophila Parece razonable obtener unos valores de referencia para PCR. Estos se deben obtener a través del análisis de la comparación de los resultados de ambos métodos, en una misma serie de muestras.

13 Lee JV et al, 2011 Objetivo: Definir el umbral de acción de la PCR en tiempo real para el seguimiento de la legionela en los diferentes tipos de sistemas de agua Estudio Multicéntrico 7 laboratorios de 6 países. Cada laboratorio al menos 6 sistemas por ambos métodos, durante al menos 6 semanas

14 RESULTADOS 232 muestras de torres de refrigeración. Legionella pneumophila Δ=0,71 (log) Legionella sp Δ=2,03 (log) 506 muestras da agua sanitaria caliente y fría Legionella pneumophila Δ=0,62 (log) Legionella sp Δ=1,05 (log)

15 Motivos de No Equivalencia Presencia de microorganismos dañados, moribundos o muertos que no son capaces de crecer en un medio artificial pero todavía contiene ADN y pueden ser detectado por la PCR Perdida de microorganismos a lo largo del proceso de cultivo: concentración filtración, resuspensión, tto. ácido y calor, medio selectivo con antibióticos. Inhibición por otros microorganismos presentes En poblaciones muy activas y en crecimiento: genoma dividido, pero no división celular. Peores resultados para Legionella spp pues el método fue diseñado originalmente para Legionella pneumophila PCR. Reacciones cruzadas con otros especies no aisladas o descritas. NF T90-461: validada 36 cepas de Legionella spp de varias especies y 17 especies no Legionella spp del mismo ecosistema

16 Enzimoinmunoensayo combinado con una retención magnética del microorganismo diana. Cuantificación mediante método colorimétrico. Resultado en U.F.C

17 CEIA (captura magnética e inmunoensayo) 1) Captura sólo de Legionella. Especificidad Elimina la competencia en crecimiento en placa. Elimina la confusión con la morfología. La captura depende de lo dañada que esté la célula: células viables no sean cultivables 2) Las células capturadas se marcan con una enzima que produce un color. Procedimiento identificación sencillo. Limitaciones: Bacteria no disponible para posteriores estudios. Se desconocen otras por el momento.

18 Objetivo Comparar efectividad y eficiencia de los métodos rápidos de detección y recuento de Legionella spp frente al método de la norma ISO 11731, (Water quality - detection and enumeration of Legionella. UNE-ISO 11731, 2007) para tener elementos objetivos que permitan tomar decisiones respecto a su implantación en un laboratorio de salud pública.

19 Se realizó un experimento con 20 muestras de 250 ml cada una, desglosadas de la siguiente manera: Un control negativo. Metodología (Madrid) Una muestra con 10 2 UFC de Legionella spp. (Bioréference, Eurofins, France). Seis muestras con 10 3 UFC de Legionella spp. más un conjunto de microbiota interferente conocida, divididas en dos bloques. 3 muestras adicionadas con Mix 1: P. aeruginosa, E. faecalis y E. coli. 3 muestras adicionadas con Mix 2: P. aeruginosa y Hongo. Seis concentrados de muestras ambientales procedentes de torres de refrigeración positivas (MA 1, MA 2, MA 3, MA 4, MA 5, MA 6 ). Las seis muestras anteriores adicionadas con 10 3 UFC de Legionella spp.

20 Identificación SIM log UFC +/- Cultivo log UFC +/- CN ND - ND - L. spp (10 2 ) L. spp (10 3 ) + MIX ND - L. spp (10 3 ) + MIX ND - L. spp (10 3 ) + MIX ND - L. spp (10 3 ) + MIX L. spp (10 3 ) + MIX L. spp (10 3 ) + MIX NA + MA ND - MA ND - MA ND - MA MA ND - MA L. spp (10 3 ) + MA L. spp (10 3 ) + MA L. spp (10 3 ) + MA L. spp (10 3 ) + MA L. spp (10 3 ) + MA L. spp (10 3 ) + MA Tabla 3.- Resultados del experimento Cultivo SIM realizado en la Comunidad de Madrid.

21 Resultados (Madrid) Separación Inmunomagnética Positivo Negativo Total Cultivo Positivo Negativo Total Tabla 4.- Tabla de contingencia relacionando positivos negativos de cultivo en placa y SIM.

22 Resultados (Madrid) Separación Inmunomagnética Acción Alerta Satisfactorio 10 4 UFC l UFC l -1 < 10 3 UFC l -1 Total Cultivo Acción 10 4 UFC l Alerta 10 3 UFC l Satisfactorio < 10 3 UFC l Total Tabla 4.- Tabla de contingencia relacionando los resultados por niveles de acción de cultivo en placa y SIM.

23 Metodología (Castilla - La Mancha) Primer estudio: 14 muestras inoculadas con Legionella spp. (Bioréference, Eurofins, France). Niveles de dopaje realizados: 5 muestras muestras muestras muestras naturales provenientes de torres de refrigeración. Estas 18 muestras de 2 litros se procesaron por PCR y Separación Inmunomagnética (1L + 1L).

24 Metodología (Castilla - La Mancha) Segundo estudio: 65 muestras naturales provenientes de diferentes equipos e instalaciones para analizar la máxima variabilidad de los métodos. Agua sanitaria (caliente y fría) Torres de refrigeración Nebulizadores Balnearios Estas muestras, también de 2 litros, se concentraron mediante filtración en 20 ml, de los cuales se utilizaron: 10 ml para PCR 9 ml para Separación inmunomagnética 1 ml restante para cultivo en placa (sin tratamiento)

25 Resultados (Castilla - La Mancha) Separación Inmunomagnética Acción Alerta Satisfactorio Total Legionella spp Sanitaria Torres 10 4 UFC/vol 10 3 UFC/vol <10 3 UFC/vol Acción 10 5 UG/vol 10 6 UG/vol qpcr Alerta 10 4 UG/vol 10 5 UG/vol Satisfactorio < 10 4 UG/vol < 10 5 UG/vol Total /83 (89%) Tabla 5.- Tabla de contingencia relacionando los resultados por niveles de actuación de qpcr y SIM.

26 Resultados (Castilla - La Mancha) Separación Inmunomagnética Acción Alerta Satisfactorio Total Legionella spp 10 4 CFU l CFU l -1 <10 3 CFU l -1 Acción 10 4 CFU l Cultivo Alerta 10 3 CFU l Satisfactori o <10 3 CFU l Total /65 (94%) Tabla 6.- Tabla de contingencia relacionando los resultados por niveles de actuación de cultivo en placa y SIM.

27 Resultados (Castilla - La Mancha) qpcr Acción Alerta Satisfactorio Total Sanitaria 10 5 UG/vol 10 4 UG/vol < 10 4 UG/vol Legionella spp Torres 10 6 GU l GU l -1 < 10 5 GU l -1 Acción 10 4 CFU l Cultivo Alerta 10 3 CFU l Satisfactorio <10 3 CFU l Total /65 (94%) Tabla 7.- Tabla de contingencia relacionando los resultados por niveles de actuación de cultivo en placa y qpcr.

28 Conclusiones Los resultados de los métodos analizados presentan un porcentaje de coincidencia frente a nivel de actuación cercano al 90%. Los métodos alternativos utilizados muestran ser tanto o más efectivos para la detección de Legionella spp. en muestras de rutina que el método de referencia. La elección de uno u otro se debe motivar en otro tipo de elementos tales como coste, objetivos del análisis, disponibilidad de medios y personal o el tipo de muestras gestionadas en el laboratorio. Frente a muestras muy sucias el método que peor respuesta presenta es el cultivo en placa, debido principalmente a la presencia de microbiota interferente. En el caso de qpcr, esta suciedad puede provocar inhibiciones en la detección, debido a sustancias presentes en la muestra. SIM y qpcr presentan el inconveniente de no disponer finalmente de la bacteria para estudios posteriores. Importante en brotes.

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