Cinética enzimática. La velocidad enzimática sigue una curva denominada hipérbola descripta por la Ecuación de Michaelis y Menten:

Transcripción

1 Cinética enzimática Hemos visto que la concentración de sustrato es uno de los factores más importantes que determinan la velocidad de una reacción enzimática. La velocidad enzimática sigue una curva denominada hipérbola descripta por la Ecuación de Michaelis y Menten:

2 C B A Km es la concetración de sustrato a la que se alcanza la mitad de la Velocidad Máxima Para concentraciones de sustrato mucho menores que Km, la curva es lineal Para concentraciones de sustrato mucho mayores que Km, la velocidad no varía al aumentar el sustrato, la enzima está saturada

3 Cinética enzimática Vemos que Km es la concentración de sustrato para la cual la enzima alcanza la mitad de su velocidad máxima. Es una constante inversamente proporcional a la afinidad de una enzima por su sustrato. Para dos enzimas que comparten el mismo sustrato, aquella que tenga un menor Km tendrá mayor afinidad por el sustrato y viceversa. Además, la Velocidad máxima (Vmáx) es una constante para una dada concentración de enzima que se alcanza cuando la enzima está saturada (sustrato >> Km). Para aumentarla debo agregar más enzima.

4 Representación gráfica de Lineweaver y Burk Debido a que es necesario medir Vmáx y Km con la mayor exactitud posible, la representación hiperbólica no es conveniente, dado que expresa un valor asintótico de Vmáx. Experimentalmente es casi imposible medir este valor, por lo que se trabaja en valores cercanos a Km. Existen métodos algebráicos que permiten convertir la ecuación hiperbólica de Michaelis y Menten en ecuaciones lineales. La más comúnmente utilizada es la linealización de Lineweaver y Burk.

5 Linealización de Lineweaver-Burk: Partiendo de la Ecuación de Michaelis-Menten, construimos una recta de pendiente positiva (Km/Vmáx), y ordenada al orígen 1/Vmáx. Se extrapola (línea punteada), el valor para el cual 1/v es cero (-1/Km).

6 Inhibición enzimática Los inhibidores enzimáticos son sustancias químicas cuya acción sobre una enzima se traduce en una disminución de su actividad. El empleo de inhibidores en estudios farmacológicos y toxicológicos es de suma importancia en el estudio de enzimas del metabolismo, ya que su uso trae aparejado consecuencias profundas en el metabolismo involucrado. Se clasifican en dos grandes grupos: Reversibles: En este caso, si quitamos por algún método el exceso de inhibidor (p.ej. mediante diálisis), la inhibición se revierte y se recupera la actividad enzimática. Irreversibles: Ocurre lo contrario, aún quitando al inhibidor del sistema, no se recupera la actividad enzimática.

7 Inhibición reversible vs. irreversible Para los inhibidores reversibles, es posible plantear el siguiente equilibrio (reversible): E+I E-I Contrariamente, esto no es posible para los inhibidores irreversibles ya que actúan modificando o aún destruyendo irreversiblemente alguno de los grupos esenciales para la actividad enzimática.

8 Inhibidores reversibles- Tipos Los inhibidores reversibles pueden clasificarse en tres tipos: - Competitivos: Cuando se combinan reversiblemente con la enzima en el mismo sitio de unión al sustrato. En este caso, se forma o bien un complejo enzima-sustrato (E-S) o bien un complejo enzima-inhibidor (E-I) mutuamente excluyentes. - No competitivos: Aquí el inhibidor se une a la enzima en otro sitio distinto al sitio de unión al sustrato (regulación alostérica; allos: otro, stereos: sólido). En este caso, existe un complejo ternario compuesto por E-S-I, además de los complejos E-I y E-S. - Acompetitiva: Cuando el inhibidor se une en otro sitio (también es alostérico) pero sólo cuando la enzima ya se ha unido al sustrato. Es decir, se une únicamente al complejo E-S para dar E-S-I.

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10 Inhibidor competitivo- no competitivo No competitivo Competitivo

11 Inhibición competitiva Son sustancias estructuralmente similares al sustrato, que compiten con él en su unión al sitio activo Ejemplo: ácido p-aminobenzóico (metabolito bacteriano esencial), sulfonamida (antibiótico)

12 Aspectos cinéticos de la inhibición competitiva Los inhibidores competitivos, al compartir el sitio de unión con el sustrato, afectan el valor de Km, produciendo una mayor Km aparente, es decir, menor afinidad. Dicho de otro modo, es necesaria una mayor cantidad de sustrato para alcanzar Vmáx/2 (mitad de la velocidad máxima). Por otra parte, dado que pueden ser desplazados aumentando la concentración de sustrato, no afectan el valor de la Vmáx, a la que se llega a una mayor concentración de sustrato.

13 Aspectos cinéticos de la inhibición competitiva

14 Inhibición no competitiva Se unen en otro sitio (regulación alostérica), cambiando la conformación del sitio activo, sin impedir la unión de la enzima al sustrato. Pueden unirse tanto a la enzima (E-I) como al complejo enzima-sustrato (ES-I), formando complejos catalíticamente inactivos.

15 Aspectos cinéticos de la inhibición no competitiva Los inhibidores no competitivos, al no compartir el sitio de unión con el sustrato, no afectan el valor de Km, dado que se unen en otro sitio independiente sin afectar entonces la afinidad. De igual modo, no pueden ser desplazados aumentando la concentración de sustrato. Dado que no pueden ser desplazados aumentando la concentración de sustrato, disminuyen el valor de la Vmáx.

16 Aspectos cinéticos de la inhibición no competitiva

17 Inhibición acompetitiva Se unen a otro sitio pero únicamente al complejo enzima-sustrato, generando un complejo catalíticamente inactivo. No se unen a la enzima libre.

18 Aspectos cinéticos de la inhibición acompetitiva