n de tratamientos físicos

Transcripción

1 Universidad Nacional de General San Martín Tesis para optar por el título t tulo de Doctor en Biología a Molecular y Biotecnología Participación de expansinas en el ablandamiento de frutilla: regulación hormonal, expresión en distintas variedades y efecto de la aplicación de tratamientos f n de tratamientos físicos Lic. Marcela C. Dotto Director: Dr. Pedro M. Civello Co-Director: Dr. Gustavo A. Martínez Instituto de Investigaciones Biotecnológicas Instituto Tecnológico de Chascomús 2008

2 A mis padres

3 Agradecimientos En primer lugar quiero agradecer a mis directores, Marcos y Gustavo, por haberme dado la oportunidad de realizar mi trabajo de Tesis en la UB4 del IIB- INTECH. Pero sobre todo por haberme acompañado y ayudado durante todo este camino de formación profesional. A todos los AMIGOS que fui encontrando a lo largo de este tiempo, que fueron imprescindibles para que esta etapa sea inolvidable y feliz. Son muchos para nombrarlos a todos, algunos están lejos y hace tiempo que no veo y otros todavía están cerca cada día, pero todos son y serán una parte fundamental de mi vida. A mi familia que siempre estuvo presente a pesar de la distancia, apoyándome en todas mis decisiones. A Josi, que me acompañó en estos últimos años y se convirtió en una de las personas más importantes de mi vida. Gracias por estar siempre y por tenerme tanta paciencia... A aquellos que de alguna manera hicieron tan linda esta etapa de mi vida, Muchas Gracias a Todos...

4 Los resultados presentados en esta tesis han sido publicados en revistas internacionales o presentados como comunicaciones a congresos: Publicaciones: Marcela C. Dotto, Gustavo A. Martínez, Pedro M. Civello. (2006) "Expression of expansin genes in strawberry varieties with contrasting fruit firmness". Plant Physiology and Biochemistry 44, Marina A. Pombo; Marcela C. Dotto; Gustavo A. Martínez; Pedro M. Civello. Influence of UV-C irradiation on gene expression and enzyme activities associated to cell wall degradation in strawberry fruit. Manuscrito enviado a Postharvest Biology and Technology Marcela C. Dotto, Gustavo A. Martínez, Pedro M. Civello. Effect of heat treatments on expansin gene expression in strawberry fruit. Manuscrito enviado a Postharvest Biology and Technology Marcela C. Dotto, Gustavo A. Martínez, Pedro M. Civello. Hormonal regulation of expansin gene expression in strawberry fruit. Manuscrito enviado a Plant Physiology and Biochemistry Comunicaciones a congresos: Marcela Dotto; Camilla Stephens; Gustavo Martínez; Pedro Civello; Victoriano Valpuesta. "Cloning and functional analysis of the proximal promoter region of FaEXP2 gene in strawberry fruit. XLIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Bioquímica y Biología Molecular (SAIB 2007) Dotto, Marcela C.; Pombo, Marina A.; Martínez, Gustavo A. y Civello, Pedro M. La expresión de genes involucrados en la degradación de la pared celular en frutilla aumenta durante las primeras horas posteriores al corte del fruto IV Jornadas de Biología y Tecnología Postcosecha y I Jornadas de Postcosecha del Cono Sur, Marcela Dotto, Gustavo Martínez; Pedro Civello. "La expresión de expansinas de frutilla (Fragaria x ananassa) es afectada por tratamientos térmicos". XXVI Reunión de la Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV 2006) Dotto, Marcela; Martínez, Gustavo; Civello, Pedro. "Hormone influence on the expression of strawberry expansin genes". Pombo, Marina; Dotto, Marcela; Martínez, Gustavo and Civello, Pedro. Influence of UV-C irradiation on expansin and pectin-methylesterase gene expression in strawberry fruit. XLI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Bioquímica y Biología Molecular (SAIB 2005) Marcela Dotto; Gustavo Martínez y Pedro Civello. Clonado del ADNc completo y análisis de la expresión del gen de FaExp4 en distintas variedades de frutilla. XXV Reunión de la Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV 2004) Dotto, M.; Martínez, G.and Civello, P.M. Analysis of expansin gene expression in strawberry fruits. XXXIX reunión anual de la Sociedad Argentina de Investigación Bioquímica y Biología Molecular (SAIB 2003)

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9 ABREVIATURAS 1-MCP: 1-metilciclopropeno - 32 P-ATP: deoxiadenosina trifosfato marcado con 32 P en posición ABA: ácido abscísico AIA: ácido 3-indol-acético ARN: ácido ribonucleico ADN: ácido desoxirribonucleico BSA: albúmina sérica bovina CTAB: bromuro de hexadeciltrimetilamonio DEPC: dietil pirocarbonato DMSO: dimetilsulfóxido dntps: deoxinucleósidos 5 -trifosfato DTT: ditiotreitol EST: fragmento de secuencia expresado (Expressed Sequence Tag) EDTA: ácido etilendiamintetracético GA: giberelinas GA 3: ácido giberélico IPTG: isopropil-tio- -D-galactósido LB: medio Luria-Bertani MOPS: ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico M-MLV: virus de la leucemia murina NAA: ácido naftalén acético ORF: marco abierto de lectura (Open Reading Frame) PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reaction) PEG: polietilenglicol PVP: polivinilpirrolidona SDS: dodecil sulfato de sodio TBE: buffer Tris-Borato-EDTA TCA: ácido tricloroacético UFC: unidades formadoras de colonias X-Gal: 5-bromo-4-cloro-3-indoil- -D-galactósido 1

10 RESUMEN El excesivo ablandamiento es uno de los principales factores que determinan el deterioro postcosecha de los frutos. El proceso de ablandamiento es a su vez complejo y contribuyen al mismo diversos fenómenos, siendo el desensamblaje de la pared celular el factor principal de los cambios de textura del fruto durante la maduración. Las expansinas son un grupo de proteínas que participan en el desensamblaje de la pared celular y se ha demostrado su participación en el ablandamiento de diversos frutos. En frutilla se conocen siete genes que codifican para expansinas, de los cuales dos (FaEXP2 y FaEXP5) se expresan específicamente durante la maduración y fueron incluídos en este estudio, junto con otros tres genes (FaEXP1, FaEXP4 y FaEXP6) cuya expresión se encuentra no solo en fruto sino también en otros tejidos de la planta. Se trabajó con tres variedades de frutilla (Fragaria x ananassa cv. Selva, Camarosa y Toyonaka) que presentan firmeza contrastante durante la maduración y se analizó la expresión de los genes mencionados. Además, se comparó el perfil de expresión de estos genes en frutos y tejidos de las especies Fragaria chiloensis y Fragaria x ananassa. La información acerca de la regulación hormonal de estos genes en frutilla es prácticamente nula, a excepción de un trabajo previo donde se informa que la expresión FaEXP2 es aparentemente independiente de la presencia de etileno o auxinas. Por lo tanto, en el presente trabajo se analizó la posible regulación hormonal de los genes mencionados por ABA, GA 3, auxinas y etileno. En relación con este punto además se clonó y caracterizó un fragmento del promotor proximal del gen FaEXP2 a fin de analizar sus posibles elementos reguladores en cis y de encontrar una zona mínima con capacidad promotora. En la búsqueda de metodologías que permitan prolongar la vida postcosecha de frutos, ha crecido el interés por la posibilidad de utilizar tratamientos físicos en reemplazo del uso de compuestos químicos potencialmente nocivos. En particular, la aplicación de tratamientos térmicos de altas temperaturas y la irradiación de frutos con UV-C han resultado beneficiosas en distintos aspectos de la postcosecha, a la vez que provoca un retraso de la maduración. Por lo tanto, se analizó la expresión de estos genes en frutos en respuesta a tratamientos térmicos de alta temperatura e irradiación con UV-C. Finalmente, se analizó la influencia del etileno en relación con aumentos en los niveles de expresión de genes asociados a la degradación de pared celular inmediatamente después de la cosecha de los frutos. 2

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12 INTRODUCCIÓN GENERAL 1. Maduración de frutos Las plantas con flores completan su reproducción y ciclo de vida mediante la formación de frutos, los cuales protegen a las semillas durante su desarrollo y promueven su dispersión en el ambiente a través de diferentes mecanismos. En el proceso de formación de un fruto carnoso se pueden distinguir dos etapas predominantes: el desarrollo y la maduración. El desarrollo inicial del fruto se produce luego de la fertilización y está caracterizado por una activa división celular de los tejidos que soportan o rodean a la semilla, lo que produce un aumento en el tamaño del mismo. Posteriormente, la división celular cesa, pero el fruto continúa su crecimiento como consecuencia del aumento del tamaño de las células. Una vez finalizado el desarrollo, sigue la etapa de la maduración del fruto, la cual abarca una suma de cambios bioquímicos y fisiológicos que, en general, incluyen modificaciones de la estructura de la pared celular y de la textura, conversión del almidón en azúcares simples, degradación de clorofilas, alteraciones en la biosíntesis y acumulación de pigmentos, y cambios en el aroma y el sabor (Giovannoni, 2001; White, 2002). La maduración de frutos ha sido ampliamente estudiada debido a las características únicas de este proceso de desarrollo. La relevancia de este campo de estudio viene dada tanto por el conocimiento que aporta a la biología vegetal, como por su importancia práctica en relación con la alimentación humana (Adams- Phillips y col., 2004). Los frutos son un componente importante de una dieta saludable dado que constituyen una excelente fuente de vitaminas, minerales, antioxidantes y fibras. Profundizar en el conocimiento del proceso de maduración permite mejorar la calidad de los frutos, lo cual beneficia tanto a los consumidores como a los productores. Una vez alcanzada la madurez comercial, los frutos son cosechados, transportados, almacenados y finalmente comercializados. Durante todo este período los frutos sufren deterioros ocasionados por causas diversas que conducen a importantes pérdidas. El factor principal que determina el deterioro postcosecha de los denominados frutos carnosos, tal como la frutilla, es el ablandamiento, el cual influencia la vida útil de comercialización ya que puede reducir la aceptabilidad del fruto y favorecer el ataque de patógenos. Esto limita el transporte y almacenamiento, lo cual incide directamente sobre el costo final del producto, generando importantes inconvenientes a productores y consumidores (Brummell y Harpster, 2001). El desensamblaje de la pared celular es en gran medida responsable del ablandamiento y de los cambios de textura que se producen durante la

13 maduración. Sin embargo, el rol preciso que cumplen en el ablandamiento cada una de las modificaciones de los componentes de la pared celular, y de las correspondientes enzimas involucradas, no ha sido aún plenamente establecido (Brummell y Harpster, 2001). Los modelos que describen las bases bioquímicas de la reestructuración de la pared celular se han tornado progresivamente más complejos a medida que aumenta el número de enzimas y genes potencialmente involucrados en el proceso. Por ejemplo, en los genomas de Arabidopsis y arroz y en una gran cantidad de colecciones de ESTs de varias especies divergentes de plantas, se ha revelado que las familias de proteínas conocidas y putativas que modifican la pared celular están codificadas por docenas de genes, lo que sugiere un proceso altamente complejo (Rose y col., 2004). 2. La pared celular La pared celular se encuentra rodeando todas las células vegetales (ver Figura 1 y Figura 4 A). Durante muchos años se la consideró como una estructura rígida y estática, pero últimamente se ha puesto en evidencia que la pared celular posee una organización dinámica esencial para la división, el alargamiento y la diferenciación celular (Roberts, 1989; Roberts, 1990), así como también para la respuesta a estrés biótico y abiótico (Ellis, 2002; Vogel, 2004). Asimismo, se ha visto que es la fuente de señales para el reconocimiento entre células del mismo o de distintos organismos (Pennell, 1998; Brownlee, 2002). Durante el proceso de crecimiento celular, el cual es conducido por la presión de turgencia interna, la pared celular juega un rol fundamental ya que debe ser lo suficientemente fuerte para soportar estas presiones y a la vez flexible para permitir los cambios de volumen necesarios para el crecimiento de las células. La extensibilidad de la pared celular depende al menos de dos factores distintos, pero que están interconectados entre sí (Darley y col., 2001). Uno de estos factores es la composición de la pared celular y las distintas interacciones que tienen lugar entre los distintos componentes. El otro factor es el conjunto de modificaciones que se producen en dichos componentes y que pueden controlar la extensión de la pared. Estas modificaciones alteran el ensamblaje de los componentes, pero la integridad global de la estructura de la pared se mantiene, permitiendo así la extensión de la misma sin perturbar su funcionalidad (Rose y Bennet, 1999). El desensamblaje de la pared es característico de diferentes eventos del desarrollo de una planta, tales como la abscisión de frutos y de hojas, el crecimiento del tubo polínico, la germinación de semillas, la senescencia floral y

14 también el proceso de maduración de frutos, dentro del cual se enmarca esta tesis, donde se producen cambios sustanciales e irreversibles en la arquitectura de la pared Composición de la pared celular Se pueden distinguir dos tipos distintos de pared celular: la pared celular primaria, presente en células en crecimiento, altamente hidratada; y la pared celular secundaria, presente en células que ya cesaron su crecimiento, caracterizadas principalmente por la presencia de lignina. La pared celular primaria es un material complejo, que consiste en una red de microfibrillas de celulosa embebida en una matriz de otros polisacáridos. De acuerdo a la composición de estos polisacáridos, se pueden distinguir las paredes celulares primarias Tipo I o Tipo II (Carpita y Gibeaut, 1993). En las paredes celulares Tipo I, el principal polisacárido que entrecruza a las microfibrillas de celulosa es el xiloglucano. Este tipo de pared se encuentra en dicotiledóneas y en algunas monocotiledóneas. Las paredes de Tipo II son características de plantas de la familia Poaceae, y en vez de xiloglucano el principal polisacárido que entrecruza las microfibrillas es el glucoarabinoxilano Componentes estructurales En general la pared celular primaria está compuesta, aproximadamente, por un 30 % de celulosa, 30 % de hemicelulosas, 30 % de pectinas y el resto comprende proteínas estructurales y enzimas que modifican la arquitectura de la pared. Sin embargo, en el caso de los frutos el contenido de pectinas puede estar aumentado y constituir hasta un 50 % de la composición de la pared (Fischer y Bennett, 1991). - Celulosa: está formada por cadenas lineales de (1 4)- -D-glucopiranosa asociadas entre sí a través de enlaces de hidrógeno, formando microfibrillas cristalinas (Figura 1). Cada microfibrilla se forma por un agrupamiento espontáneo y la cristalización de decenas de cadenas lineales. Las microfibrillas tienen un grosor de entre 3 y 5 nm y una longitud de varios micrómetros, suficientemente largas para dar varias vueltas a la circunferencia celular. Es posible que las hemicelulosas, como el xiloglucano, queden atrapadas entre las microfibrillas durante la biosíntesis resultando, de esta manera, en regiones desordenadas (o paracristalinas) de las microfibrillas (Cosgrove, 2005).

15 Figura 1: Representación de las microfibrillas de celulosa. Cada microfibrilla está formada por varias cadenas lineales de residuos de glucosa (representados en color celeste). Las microfibrillas de celulosa son componentes estructurales de todas las células vegetales. - Hemicelulosas: en dicotiledóneas (paredes Tipo I), la hemicelulosa principal es el xiloglucano, una cadena lineal de (1 4)- -D-glucopiranosa que pueden presentar en el carbono 6 de los residuos de glucosa alguno de los siguientes sustituyentes: residuos laterales de xilosa; ramificaciones cortas de xilosa y galactosa o de xilosa, galactosa y fucosa, que pueden presentar O- acetilaciones. Las uniones entre los residuos de las cadenas laterales son del tipo o (1 2) (Figura 2). Estos polímeros de xiloglucano se entrecruzan con dos o más microfibrillas de celulosa. Otros componentes hemicelulósicos de la pared primaria de las dicotiledóneas son mucho menos abundantes e incluyen xilanos, glucomananos y galactomananos (Fischer y Bennett, 1991). Se demostró que hay al menos tres dominios de xiloglucano en las paredes celulares de dicotiledóneas (Pauly y col., 1999). Uno de ellos es el xiloglucano

16 fácilmente extraíble, digerible por endo- -glucanasas y que se encuentra en la pared probablemente intercalado físicamente con otros polímeros. Otra fracción comprende un dominio inaccesible a las enzimas, que se mantiene en la pared por interacciones más fuertes que las anteriores, como enlaces de hidrógeno con las microfibrillas de celulosa. El tercer dominio, también inaccesible a enzimas, se mantendría en la pared unido por interacciones aún más fuertes que las mencionadas previamente; estaría asociado íntimamente a las microfibrillas y probablemente provenga de cadenas de polisacáridos que quedaron atrapadas durante la formación de las mismas. Figura 2: Representación de hemicelulosas de dicotiledóneas: Se representa la molécula de xiloglucano con las distintas cadenas laterales que posee. En la cadena principal los residuos de glucosa (Glc, esferas azules) se unen a través de enlaces (1 4); puede presentar regiones con ramificaciones laterales unidas por enlaces (1 6) compuestas por un único residuo de xilosa (Xil, esferas amarillas) o ramificaciones cortas de xilosa- (1 2)-galactosa (Gal, esferas celestes; pueden presentar O-acetilaciones representadas con cuadrados celestes) o ramificaciones cortas de xilosa- (1 2)-galactosa- (1 2)-fucosa (Fuc, esferas naranjas). Adaptado de Somerville y col.(2004) - Pectinas: son una clase de polisacáridos complejos definidos inicialmente por su capacidad de ser extraídos con agua caliente, agentes quelantes o ácidos diluidos. Típicamente poseen azúcares ácidos como ácido galacturónico y glucurónico, así como también azúcares neutros como ramnosa, galactosa y arabinosa. Algunas pectinas, como los homogalacturonanos, poseen una estructura primaria simple formada por un polímero lineal de residuos de ácido galacturónico unidos por enlaces -(1 4) (Figura 3 A). Otras pectinas pueden presentar residuos de xilosa unidos a la cadena central por enlaces -(1 2), espaciados de una manera

17 regular, constituyendo así los xilogalacturonanos (Figura 3 B). Dentro de las pectinas más abundantes se encuentran los ramnogalacturonanos I (RG I), los cuales poseen subunidades repetidas de disacáridos (1 2)- -L-ramnosil (1 2)- -Dgalacturónico, con largas cadenas laterales de arabinanos, galactanos y arabinogalactanos (Figura 3 C). Otras pectinas menos abundantes son los Ramnogalacturonanos II (RG II), con un esqueleto de residuos de galacturonanos y ramificaciones laterales complejas, compuestas de numerosos azúcares neutros (Fischer y Bennett, 1991; Cosgrove y col., 1997; Brummell, 2006). Las pectinas se encuentran principalmente en paredes celulares primarias, sugiriendo que tienen un rol importante en la extensión de la pared. La elevada concentración de pectinas presente en la pared le proveería un alto potencial de hidratación, lo cual le confiere mayor resistencia a la compresión (Darley y col., 2001). Los geles hidratados que forman las pectinas mantendrían a las microfibrillas de celulosa separadas, facilitando su desplazamiento lateral durante el crecimiento celular, a la vez que las mantienen ancladas en un lugar determinado cuando el crecimiento se detiene. Las pectinas contribuyen a determinar la porosidad y el grosor de la pared y además forman la laminilla (o lámina) media, una película adhesiva rica en estos compuestos que mantiene unidas a células adyacentes (ver Figura 4). Las pectinas también son un blanco primario del ataque de patógenos, y sus productos de degradación funcionan como potentes desencadenantes de las respuestas de defensa de la planta (Cosgrove, 2005). - Proteínas estructurales: se han descrito varios tipos de proteínas estructurales de las paredes celulares de plantas y se las clasifica de acuerdo a su composición predominante de aminoácidos en, por ejemplo, glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, proteínas ricas en prolina, etc. También se encuentran incluidas en este grupo las extensinas, que pese a su nombre no estarían involucradas en la extensión de la pared. La mayoría de las proteínas estructurales están altamente glicosiladas (por ejemplo, las proteínas con arabinogalactanos, AGPs). Vale la pena destacar que las proteínas estructurales manifiestan grandes variaciones en su abundancia, dependiendo del tipo de célula, del estadio de desarrollo y de la estimulación previa de la planta (heridas, ataque de patógenos, etc.) (Cosgrove y col., 1997; Darley y col., 2001).

18 Figura 3: Representación de pectinas. (A) Homogalacturonano: compuesto de residuos de ácido galacturónico, algunos de ellos metilados; (B) Xilogalacturonano: cadena principal compuesta de residuos de ácido galacturónico con residuos laterales de xilosa. (C) Ramnogalacturonanos tipo I (RG I): pectinas con cadena principal compuesta de residuos alternados de ramnosa y ácido galacturónico. Presenta ramificaciones complejas, como arabinanos, galactanos y arabinogalactanos.

19 2.3. Modelo de la pared celular primaria Diversos tipos de enlaces mantienen conectados y unidos a los componentes de la pared celular. El xiloglucano y los xilanos se unen a las microfibrillas de celulosa a través de enlaces de hidrógeno. Las moléculas de RG II se unen de a pares a través de enlaces diésteres de boro; los homogalacturonanos se unen a través de puentes de calcio y probablemente las pectinas se unen entre sí por medio de enlaces éster, o a otros glicanos y compuestos fenólicos (Carpita y Gibeaut, 1993; Iiyama, 1994; Carpita y McCann, 2000). Se han reportado también enlaces covalentes entre el xiloglucano y las cadenas laterales de los RG I (Thompson y Fry, 2000; Popper y Fry, 2005), y entre los RG I y las proteínas estructurales extensinas (Qi y col., 1995). El entrecruzamiento físico entre moléculas también podría jugar un rol importante, por ejemplo entre las moléculas de xiloglucano o xilanos con las microfibrillas de celulosa, o los RG I podrían ubicarse alrededor de las microfibrillas uniendo estrechamente la red de pectinas con la de celulosa-hemicelulosa (Vincken y col., 2003; Zykwinska y col., 2005). Teniendo en cuenta las evidencias experimentales, existen varios modelos de la pared celular primaria. Uno de los modelos más ampliamente aceptado es el que se ha denominado modelo de multi-capa (Cosgrove, 2000). En este modelo (Figura 4 B), se propone que las microfibrillas de celulosa están recubiertas de una capa de xiloglucano y luego embebidas en sucesivas capas de hemicelulosas, cada una de ellas más débilmente unida que la anterior, formando la red de celulosahemicelulosa; finalmente, se encuentran las pectinas llenando los espacios entre la red mencionada Modificaciones de la pared celular durante la maduración y ablandamiento Durante la maduración, la arquitectura de la pared celular y de los polímeros que la componen es modificada progresivamente, produciéndose cambios en la textura del fruto. Estos cambios de textura pueden variar entre las distintas especies. En frutos como la frutilla o la palta, que ablandan en forma intensa y desarrollan una textura carnosa durante la maduración, las modificaciones que llevan a la disolución de la pared celular y el consecuente ablandamiento es evidente. En cambio, en otros frutos como la manzana, que presenta una textura quebradiza, no se observa dicha disolución de la pared durante la maduración. Un proceso común para todos los frutos en este período es la reducción en la adhesión célula-célula debido a la degradación y solubilización de las pectinas de la laminilla media, que comienza temprano en la maduración en frutos blandos como el tomate,

20 y más tarde en frutos como la manzana. Durante la maduración también se produce una disminución del ph en el espacio de la pared, que generalmente está acompañada por la disminución de la turgencia celular debido al aumento en la concentración de solutos en el espacio de la pared y a la relajación de la misma (Brummell y Harpster, 2001). A B Figura 4: Pared celular vegetal. A: Micrografía electrónica de transmisión de paredes celulares. Se muestran dos células adyacentes, indicando sus respectivos citosoles, membrana plasmática, paredes celulares y la lámina media, rica en pectinas. B: Modelo de multi-capas de la pared celular primaria de dicotiledóneas. En la parte superior se esquematiza la vista lateral (en el plano de la pared, paralela a la membrana plasmática). En la parte inferior se representa la sección transversal, en ángulo recto con respecto a la vista lateral. En este modelo se presentan a las microfibrillas de celulosa recubiertas con hemicelulosas fuertemente unidas o hemicelulosas que quedaron atrapadas entre las microfibrillas, a su vez cubiertas por una capa de hemicelulosas unidas más débilmente. Esta red de celulosa-hemicelulosa se encuentra embebida en la matriz de pectinas que llena los espacios entre las microfibrillas. lm = laminilla media; mp = membrana plasmática. Adaptado de Cosgrove (2000).

21 Las modificaciones en los componentes de pared a lo largo de la maduración han sido analizadas en una gran cantidad de frutos. En breve, las diferentes modificaciones observadas en los distintos trabajos indican que el ablandamiento es un proceso que involucra múltiples factores y cambios en diversos polímeros, y que las alteraciones varían considerablemente entre especies. Las diferencias en la composición de la pared celular y la marcada diversidad en los cambios producidos en la pared entre las distintas especies, contribuyen a las diferencias en textura y firmeza características de sus frutos maduros. Probablemente estas diferencias son el resultado de las variaciones de abundancia, actividad y momento de acción de las distintas familias génicas que codifican para las diversas proteínas de la pared celular expresadas durante la maduración (Brummell, 2006). En general, la depolimerización de los componentes de la red de pectinas se produce al inicio de la maduración y luego continúa durante la misma, por lo que ha sido ampliamente correlacionada con el ablandamiento. En etapas tempranas de la maduración, también se produce pérdida de las cadenas laterales de galactanos y arabinanos de los RG I, así como demetilación de homogalacturonanos y solubilización de poliurónidos, lo cual podría conducir a la relajación de la red de celulosa-hemicelulosa. Estos cambios estructurales, combinados con el aumento en la porosidad de la pared por la pérdida de las cadenas laterales de los RG I, convierte a la pared en una estructura mucho más abierta, lo cual aumenta la accesibilidad de enzimas que actúan en las cadenas principales de los polímeros y, por lo tanto, contribuye al desensamblaje progresivo de la pared (Brummell, 2006). Todos estos cambios son realizados por una amplia gama de enzimas y proteínas cuya expresión y actividad ha sido analizada durante la maduración de diversos frutos, incluyendo uvas (Nunan y col., 2001); manzana (Goulao y col., 2007); pimiento (Priya Sethu y col., 1996); carambola (Chin y col., 1999) y frambuesa (Iannetta y col., 1999), entre otros. Dentro de las enzimas habitualmente analizadas por su papel durante la maduración se pueden mencionar las siguientes: - Endo-(1 4)- -D-glucanasas (EGs, EC ): Como se mencionó más arriba, los residuos de glucosa de las cadenas de celulosa y hemicelulosa se encuentran unidos por enlaces -(1 4). Es lógico pensar que estas endoglucanasas, que han sido encontradas en diversas especies como tomate y frutilla (Maclachlan y Brady, 1994; Palomer y col., 2004), actúen en la pared celular sobre sustratos como la celulosa o hemicelulosas. Sin embargo, en los ensayos de actividad que se han

22 realizado in vitro no se detectó actividad sobre celulosa cristalina. El sustrato que generalmente se ha utilizado para la medida de la actividad endoglucanasa es carboximetilcelulosa, el cual es un derivado artificial no cristalino de la celulosa que no corresponde a un posible sustrato in vivo. En ensayos in vitro se ha observado que estas enzimas son capaces de actuar sobre xiloglucano, razón por la cual se ha propuesto que éste podría ser su sustrato in vivo (Brummell y Harpster, 2001). Sin embargo, medidas de actividad de EGs en distintas plantas no han revelado un patrón uniforme de especificidad de sustrato y diferentes isoenzimas presentan afinidades variables por los distintos glucanos ensayados (Vicente y col., 2007). - Xiloglucano endotransglicosilasas (XETs, EC ): Estas enzimas actúan cortando enlaces internos -(1 4) de una cadena de xiloglucano y transfiriendo el extremo reductor originado a la posición C-4 de una unidad de glucosa perteneciente al extremo no reductor de otra cadena de xiloglucano. Presentan una alta afinidad por el xiloglucano, tanto como dador y como aceptor (Campbell y Braam, 1999). Esta actividad ha sido detectada en frutos de tomate, manzana y kiwi, entre otros, y se ha encontrado una alta actividad en frutos en expansión (Redgwell y Fry, 1993; Maclachlan y Brady, 1994; Percy y col., 1996). - Pectin esterasas (PEs, EC ): Los poligalacturonanos son secretados a la pared celular con un alto porcentaje de sus grupos carboxilos esterificados con grupos metilo. El grado de metilación disminuye considerablemente durante la maduración. Esto es llevado a cabo por las pectin metilesterasas, enzimas que eliminan los grupos metilo de la posición C-6 de residuos de ácido galacturónico en pectinas de alto peso molecular. La demetilación de las pectinas modifica el ph y la carga de la pared celular, lo cual permite la agregación de poliurónidos en estructuras unidas por iones calcio, y hace a los poliurónidos susceptibles al ataque por poligalacturonasas (Brummell y Harpster, 2001). - Poligalacturonasas (PGs): son enzimas que catalizan la ruptura hidrolítica de las uniones de galacturónido, y se clasifican en endo (EC ) o exopoligalacturonasas (EC ) de acuerdo a su modo de acción. Aunque ambos tipos se han encontrado en frutos, las enzimas específicas de la maduración de frutos son del tipo endo-poligalacturonasas (Hadfield y Bennett, 1998). El sustrato para las PGs en la pared celular son principalmente los homogalacturonanos, los cuales son secretados a la pared celular en una forma altamente metilesterificada. Dado que se ha determinado que las PGs muestran

23 una mayor afinidad por la forma de-esterificada, se ha postulado que las pectinas serían primero demetiladas por la acción de pectin metilesterasas y luego hidrolizadas por la acción de las PGs (Fischer y Bennett, 1991; Carpita y Gibeaut, 1993). - Pectato liasas (PLs, EC ): estas enzimas catalizan la ruptura, dependiente de Ca 2+, de las pectinas de-esterificadas a través de un mecanismo de eliminación Beta. Se han aislado varios genes en plantas que muestran alta similitud con pectato liasas, los cuales se expresan principalmente en los granos de polen maduros y en tubos polínicos en desarrollo. Asimismo, se han identificado genes con homología a PLs en paredes celulares de diversos frutos (Medina-Escobar y col., 1997; Marín-Rodríguez y col., 2002). - Expansinas: estas proteínas fueron aisladas como mediadoras del crecimiento ácido (ver más adelante) y hasta el momento no se ha logrado detectar que las mismas posean algún tipo de actividad enzimática. Sin embargo, las expansinas cumplirían un rol fundamental en una serie de procesos que involucran el desensamblaje de la pared celular. Si bien el mecanismo de acción de las expansinas no es totalmente conocido, se ha propuesto que las mismas actuarían en la interfase celulosa-hemicelulosa, debilitando las uniones no-covalentes establecidas entre dichos polímeros (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995). En la siguiente sección se describen estas proteínas en detalle. 3. Expansinas 3.1. Relación con el crecimiento ácido Las expansinas fueron aisladas por primera vez como mediadoras del crecimiento ácido. Este término se refiere al aumento de la velocidad de crecimiento que ocurre cuando las células vegetales en crecimiento son expuestas a soluciones ácidas, debido a que la pared celular se vuelve más extensible en condiciones de ph ácido. La mayor extensibilidad no es un efecto directo del ph sobre los polímeros de la pared celular, sino que es mediado por uno o más factores proteicos que, de alguna manera, producen la extensión de la pared. Esta conclusión se basa en estudios realizados in vitro con paredes celulares, que fueron tratadas térmicamente para desnaturalizar a las proteínas presentes y que consecuentemente perdieron la capacidad de extensión en respuesta a la disminución del ph del medio (Figura 5 A). Sin embargo, la sensibilidad al ph fue ampliamente reestablecida con la adición de una fracción proteica purificada a

24 partir de la pared celular, a la cual se denominó expansina (Figura 5 B) (McQueen- Mason y col., 1992). La dependencia del ph de la extensión de la pared inducida por expansinas concuerda con la del crecimiento ácido, con un ph óptimo cercano a 4 y una disminución gradual entre ph 4 y 7 (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995). Cabe señalar que la actividad de las expansinas también es estimulada e inhibida por los mismos agentes químicos que afectan el crecimiento ácido de las paredes. Por lo tanto, las expansinas parecen ser los principales mediadores proteicos responsables de este crecimiento (McQueen-Mason y col., 1992). Figura 5: Identificación de expansinas como mediadoras del crecimiento ácido. (A): fenómeno de crecimiento ácido en paredes aisladas de hipocótilo en crecimiento de pepino. En un medio ácido (ph 4,5) la velocidad de elongación aumenta considerablemente con respecto a la observada a ph 7,0. (B): en paredes aisladas inactivadas por calor, no se observa el crecimiento ácido (Control), mientras que se vuelve a observar el aumento en la velocidad de elongación al agregar una fracción proteica que contiene expansinas purificadas (Carpita y McCann, 2000). 3.2 Características estructurales de las expansinas Las expansinas son proteínas pequeñas constituidas por aminoácidos, y su estructura incluye dos dominios (dominio 1 y dominio 2) precedidos de un péptido señal de aproximadamente 15 a 25 aminoácidos (Figura 6). Dicho péptido señal dirigiría a estas proteínas a la ruta secretoria, según programas de predicción como PSORT (Nakai y Horton, 1999) o TargetP (Emanuelsson y col., 2000), conduciéndolas a la pared celular. Luego de la

25 eliminación de este péptido se generan proteínas maduras con un tamaño de aproximadamente kda. Inicialmente se identificaron dos miembros de la familia que actualmente se conoce como -expansinas o EXPA (ver más adelante), estas proteínas eran capaces de provocar el alargamiento de paredes celulares aisladas (McQueen-Mason y col., 1992). Posteriormente se demostró que proteínas pertenecientes a una familia conocida como el grupo I de alérgenos del polen de gramíneas, eran también capaces de alargar paredes celulares aisladas. Estas proteínas comparten solo entre un 20 y 40 % de identidad de aminoácidos con las -expansinas previamente conocidas, por lo que se denominó a esta nueva familia como -expansinas. Más tarde se encontraron proteínas análogas a estas últimas también en tejidos vegetativos, tanto en otras gramíneas como en otros grupos de plantas (Sharova, 2007). En base a análisis filogenéticos, actualmente se reconocen cuatro familias de expansinas en plantas, representadas esquemáticamente en la Figura 6 (Sampedro y Cosgrove, 2005). De la familia más numerosa a la menos numerosa se denominan: -expansinas (EXPA), -expansinas (EXPB), expansina-like A (EXLA) y expansina-like B (EXLB). La familia EXPA está compuesta por 26 genes en Arabidopsis y 34 en arroz. La familia EXPB, como se mencionó previamente, en un principio fue conocida como el grupo I de los alérgenos del polen y posteriormente se la identificó como un grupo de expansinas en base a la similitud de secuencia y a la capacidad de extender paredes celulares en gramíneas; esta familia posee 6 representantes en Arabidopsis y 19 en arroz. El genoma de Arabidopsis posee tres representantes del grupo EXLA, mientras que en el genoma de arroz se han hallado cuatro genes. Finalmente, cada uno de estos genomas posee un representante de la familia EXLB (Choi y col., 2006). Las expansinas son proteínas evolutivamente conservadas. La identidad entre secuencias de la familia de las -expansinas generalmente se encuentra entre 60 y 90 %. Las -expansinas se caracterizan por tener una mayor diversidad, presentando una identidad entre distintos miembros de la familia que varía entre 28 y 76 %. Por otro lado, la identidad de aminoácidos entre y -expansinas está entre un 20 y 40 % (Cosgrove, 1998). La conformación de las expansinas está más conservada que su secuencia; por ejemplo, la similitud topológica entre las y expansinas es de un 75 % (Cosgrove y col., 1997).

26 Figura 6: Esquema de la estructura de las cuatro familias de expansinas: EXPA, EXPB, EXLA y EXLB. Se indican las posiciones de los residuos conservados de cisteína (C), el dominio HFD y los triptófanos (W). Se destaca el péptido señal (en celeste) y se indican con flechas rojas los 6 residuos de cisteína y el residuo de triptófano conservados en todas las familias. El dominio 1 corresponde a la región con homología a endoglucanasas y el dominio 2 correspondería al dominio de unión a carbohidratos (CBD: carbohydrate binding domain). Adaptado de Choi y col. (2006). Los residuos de aminoácidos conservados en las cuatro familias se representan en la Figura 6. Las familias de y -expansinas (EXPA y EXPB) poseen residuos de cisteína (C) conservados en su dominio N-terminal (dominio 1), y un dominio His-Phe-Asp (HFD) en la zona central. Este motivo de HFD y los residuos de cisteína están también altamente conservados en la familia 45 de las glicosil hidrolasas, una familia de enzimas con actividad endoglucanasa también conocida como la familia K de celulasas, donde el motivo HFD forma parte del sitio activo de la enzima, el cual incluye también un residuo de ácido aspártico. Los intentos por detectar actividad endoglucanasa en expansinas han sido infructuosos. Pese a disponer de un dominio HFD, las expansinas carecen del residuo de ácido aspártico mencionado, necesario para realizar la catálisis en las endoglucanasas, lo cual podría explicar la ausencia de esta actividad enzimática en los ensayos in vitro (Yennawar y col., 2006). Las expansinas presentan, además, una serie de residuos de triptófano (W) en su región C-terminal (Figura 6), similares a los presentes en los dominios de unión a celulosa de proteínas microbianas, por lo que se postula que esta zona estaría involucrada en la unión proteína-polisacárido (Shcherban y col., 1995). Las proteínas EXLA también poseen residuos de cisteína conservados en su zona N-terminal y de triptófano en su zona C-terminal, sin embargo no presentan el dominio HFD en su zona central, las posiciones de los residuos de triptófano son diferentes a los de las y -expansinas y además poseen otros residuos de triptófano adicionales al final de la región C-terminal. Por último, la familia EXLB tampoco posee el dominio HFD, presentan los residuos de cisteína conservados y uno de los residuos de triptófano de la zona C-terminal (Figura 6).

27 Las -expansinas y las -expansinas han sido ampliamente caracterizadas y se ha demostrado su capacidad para extender paredes celulares (McQueen-Mason y col., 1992; Cosgrove, 1999). Sin embargo, de las familias expansina-like A y B solo se conocen sus secuencias génicas y no se ha analizado aún su funcionalidad. A modo de ejemplo, se muestra en la Figura 7 un apilamiento de secuencias de 3 -expansinas (CsEXPA1 de pepino, LeEXPA2 de tomate y AtEXPA1 de Arabidopsis) y 3 -expansinas (Cim1 de soja; Os VB de arroz y Lol P1 de Lolium perenne). Se destacan con flechas los residuos de C y W conservados en las dos familias, y además se resaltan con recuadros el dominio HFD, los dos residuos de C extra que poseen las -expansinas y un residuo de W conservado en la zona N- terminal que presentan las -expansinas. Usando técnicas cristalográficas se logró determinar la estructura de una expansina de maíz (Zea m1, Yennawar y col., 2006). Los 6 residuos de cisteína conservados en ambas familias se encuentran formando enlaces disulfuro, los cuales serían fundamentales para el correcto plegamiento de estas proteínas y les confieren la estructura terciaria conservada a las dos familias. Probablemente, las -expansinas carezcan de un lazo ( loop ) determinado por el par de residuos de cisteína extras que están presentes en las -expansinas. Además, las -expansinas poseen uno o dos sitios de glicosilación (secuencia consenso Asn-X-Ser/Thr), que no se encuentran en las -expansinas (Wu y col., 2001a).

28 Figura 7: Apilamiento entre secuencias de -expansinas y -expansinas. Se indican con flechas azules los residuos de cisteína y con flechas rojas los residuos de triptófano conservados en las dos familias y se recuadra en color naranja el dominio HFD también común a las dos familias. Además, se recuadra en verde la posición del residuo de triptófano conservado solo en la familia EXPB y en violeta los dos residuos de cisteína conservados solo en la familia EXPA. Es posible observar además la alta identidad entre miembros de una misma familia, sobre todo en EXPA. -expansinas: AtEXP1, CsEXP1, LeEXP2; -expansinas: Cim1, Lol P1, Os VB.

29 3.3 Mecanismo de acción El efecto de las expansinas sobre las propiedades reológicas de la pared celular ha sido ampliamente estudiado, y también es considerable el conocimiento de las características bioquímicas y moleculares de estas proteínas en diferentes sistemas. Sin embargo, el mecanismo preciso por el cual las expansinas hacen a la pared más extensible aún no ha sido completamente esclarecido. El modelo actual de la acción de las expansinas se basa en la interpretación de resultados de los primeros estudios bioquímicos realizados in vitro con estas proteínas (McQueen- Mason y col., 1992; McQueen-Mason y Cosgrove, 1994; McQueen-Mason y Cosgrove, 1995). Luego del descubrimiento de dos expansinas capaces de inducir la extensión de paredes celulares aisladas (McQueen-Mason y col., 1992), se pudo establecer que las mismas no eran capaces de hidrolizar polisacáridos de la matriz. En diferentes ensayos no se logró detectar actividad endo o exoglucanasa (McQueen-Mason y Cosgrove, 1994; McQueen-Mason y Cosgrove, 1995), pectinasa (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995) o transglicosilasa (McQueen-Mason y col., 1993), pero se demostró que tenían la capacidad de relajar la tensión de las paredes celulares. Además se determinó que estas proteínas se unían a la interfase entre las microfibrillas de la matriz (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995) y que eran capaces de debilitar papel constituido por celulosa pura, donde las fibras de celulosa están interconectadas por puentes de hidrógeno. De este modo se propuso un modelo, representado en la Figura 8, en el cual las expansinas actúan facilitando el deslizamiento de los polímeros de la pared celular cuando estos están sometidos a alguna tensión, debilitando la fuerza de la unión de los enlaces de hidrógeno que mantienen unidos a los componentes de la red de celulosa-hemicelulosa (McQueen- Mason y Cosgrove, 1995). En este modelo, otras enzimas de la pared celular podrían alterar su estructura, afectando indirectamente la extensión de la misma. Por ejemplo, las hidrolasas podrían acortar los polímeros de la matriz, reduciendo la resistencia viscosa de la pared y favoreciendo el desplazamiento de los polímeros entre sí. Por otro lado, un mayor entrecruzamiento de la matriz, causado por ejemplo por la acción de peroxidasas y pectin-metilesterasas, aumentaría el tamaño de las unidades estructurales que intervienen en el desplazamiento de los polímeros, traduciéndose este aumento de tamaño en una mayor resistencia al movimiento de los polímeros entre sí (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995; Cosgrove, 1998), contribuyendo a reestructurar la pared celular para adecuarla a un nuevo estado de menor tensión.

30 Figura 8: Mecanismo de acción de las expansinas. Cuando la pared está sometida a tensión (representado por las flechas azules), las expansinas (en amarillo) relajarían esa tensión actuando en la interfase entre las microfibrillas de celulosa y las moléculas de hemicelulosas que las recubren, debilitando la fuerza de la unión de los enlaces de hidrógeno que participan en dicha unión. Posteriormente actuarían otras enzimas (como XETs, representadas en verde) que remodelarían la pared adecuándola al nuevo estado de menor tensión. Adaptado de Carpita y McCann (2000).

31 3.4 Metodología para el estudio de las expansinas Las funciones de las expansinas son estudiadas utilizando las metodologías convencionales habitualmente empleadas para otras proteínas. Por ejemplo, la participación de expansinas en varios de los procesos mencionados en la Tabla I fue detectada al establecer patrones de cambios paralelos entre la actividad de las expansinas y la velocidad del proceso en estudio. La búsqueda de una posible correlación entre la actividad de expansinas y un determinado proceso se realiza analizando tanto plantas salvajes como modificadas genéticamente o por condiciones inducidas por el entorno. Sin embargo, la cuantificación de la actividad expansina es un problema complicado. Los ensayos de dicha actividad son llevados a cabo raramente y se realizan con un extensiómetro (Figura 5). Están basados en la capacidad de las expansinas de restituir el crecimiento ácido de paredes celulares aisladas inactivadas por calor, generalmente de hipocótilo de pepino, o de aumentar la extensibilidad de materiales artificiales compuestos de celulosa-xiloglucano. Generalmente, tales ensayos se llevan a cabo con una fracción proteica de la pared celular soluble en medio salino, y no con expansinas purificadas. Estas condiciones de extracción son suficientes para la determinación de la potencial actividad expansina; en cambio, las -expansinas no son extraídas en soluciones salinas y su efecto sobre la elongación de paredes aisladas de pepino es casi nula. Además, este método es adecuado para la determinación de actividad expansina involucrada en la regulación del crecimiento de paredes celulares, pero no en otros procesos mediados por expansinas como el ablandamiento de frutos (Sharova, 2007). Frecuentemente, se correlaciona el nivel de expresión de ARNm de los genes de expansina de interés con un determinado proceso en el que estarían involucradas, y no se avanza más allá de esta determinación (se enumeran ejemplos en las secciones 3.5 y 3.6). Los análisis en los cuáles se ha cuantificado el contenido de expansina con anticuerpos son menos frecuentes. En algunos casos se han utilizado anticuerpos anti CsEXP1, una -expansina de pepino, aún en otras especies. Sin embargo, hay que destacar que estos anticuerpos no reconocen todas las -expansinas; por ejemplo, no reconocen a la -expansina LeEXP1 de tomate (Rose y col., 2000), contra la cual existe un anticuerpo que ha sido usado en algunos trabajos (Rose y col., 1997; Dotto y col., 2006). Es importante destacar que tanto los ensayos de actividad expansina usando un extensiómetro, como la detección de expansinas con anticuerpos son útiles para evaluar el contenido global de un conjunto de expansinas, pero que al momento de estudiar un gen de expansina en particular es necesario recurrir al

32 análisis de los niveles de ARNm, ya que permite inferir posibles funciones de cada miembro en particular de la familia de expansinas en una especie dada. Sin embargo, es fundamental tener en cuenta y, si es posible, determinar las modificaciones post-transcripcionales y/o post traduccionales que pudieran estar regulando la expresión de dichos genes en particular. 3.5 Procesos en los que participan las expansinas Se han encontrado y -expansinas involucradas en distintos procesos del crecimiento y desarrollo de diversas especies de plantas. Ejemplos de estas correlaciones se resumen en la Tabla I. La familia de las -expansinas es la que ha sido más ampliamente caracterizada y pertenecen a esta familia las expansinas que han sido asociadas con el desarrollo y la maduración de frutos. Tabla I Procesos en los que participan las expansinas Proceso -expansinas -expansinas germinación del polen y desarrollo del tubo polínico embriogénesis y germinación crecimiento de internodos y coleóptilos crecimiento de la raíz iniciación y crecimiento de hojas simbiosis desarrollo floral _ desarrollo del embrión y germinación de semillas de tomate (Chen y col., 2001) y arroz (Huang y col., 2000) zonas de elongación de hipocótilos de tomate (Caderas y col., 2000) y de pepino (Shcherban y col., 1995); crecimiento de internodos de trigo (Lin y col., 2005) y arroz (Cho y Kende, 1997a; Cho y Kende, 1997b); OsEXPA4 en coleóptilos y mesocótilos de arroz (Choi y col., 2003) elongación de raíces de maíz (Wu y col., 2001b; Kam y col., 2005), arroz (Shin y col., 2005) y soja (Lee y Kende, 2001) crecimiento de hojas de Arabidopsis (Cho y Cosgrove, 2000), festuca (Reidy y col., 2001) y álamos (Gray-Mitsumune y col., 2004). Inducción de localización ectópica del primordio de hoja en tomate (Fleming y col., 1997; Pien y col., 2001) entre Melilotus alba Sinorhizobium meliloti (Giordano y Hirsch, 2004); raíces de pepino micorrizas (Balestrini y col., 2005) desarrollo floral en Mirabilis jalapa (Gookin y col., 2003) Zea m1 en maíz (Wu y col., 2001a), penetración del tubo polínico (Li y col., 2003) desarrollo de embriones somáticos en pino (Bishop- Hurley y col., 2003); alto contenido de Cim1 en suspensiones de células de soja en división (Downes y col., 2001) zona de elongación de internodos de arroz (Lee y Kende, 2001) y trigo (Lin y col., 2005) zona de elongación de raíces de maíz (Wu y col., 2001b; Kam y col., 2005) hojas en desarrollo de festuca (Reidy y col., 2001) - desarrollo floral temprano en Mirabilis jalapa (Gookin y col., 2003)