Aplicación y Tecnología de Células Madre Adultas Autólogas en el Tratamiento de Enfermedades
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- Milagros Rodríguez Salazar
- hace 7 años
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1 Aplicación y Tecnología de Células Madre Adultas Autólogas en el Tratamiento de Enfermedades Ing. Levent Asanoski BioHuman, S.A. Comisión Intersectorial de Biotecnología CTI - Huehuetenango, 10 de junio de 2016
2 Antes de empezar Si necesitan usar su celular, por favor retirarse del salón para evitar interrumpir/distraer a los demás invitados Dispondremos de un espacio para sus preguntas al finalizar Contacto: Ing. Levent Asanoski cs@biohuman.com.gt +(502)
3 Revisión de Conceptos Básicos Células Madre Ing. Levent Asanoski
4 Qué son las células madre adultas?
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6 Células madre - Definición Son células que tienen la habilidad de dividirse por periodos indefinidos para dar lugar a células especializadas. Tienen 3 características principales: No especializadas Auto-renovables Habilidad para diferenciarse
7 Células madre: Stem cells Stem significa tronco, «células troncales». Tienen la capacidad de dividirse asimétricamente dando lugar a dos células hijas.
8 Células madre: Stem cells Stem significa tronco, «células troncales». Una de ellas tiene las mismas propiedades que la célula madre original (autorenovación).
9 Células madre: Stem cells Stem significa tronco, «células troncales». La otra tiene la capacidad de diferenciarse si las condiciones ambientales son adecuadas.
10 Células madre: Stem cells =
11 Reseña histórica En 1924, el científico ruso Alexander A. Maximow identificó un tipo de célula precursora en el interior del mesénquima que se diferenciaba en distintos tipos de células sanguíneas. En la década de los 60, los científicos Ernest A. McCulloch y James E. Till, demostraron la naturaleza clonal de las células de la médula ósea, perpetuandose al dividirse.
12 Reseña histórica En los años 70, Friedenstein y col definieron las células del estroma como células formadoras de colonias de fibroblastos (CFU-f). Posteriormente cultivaron células madre mesenquimales en presencia de estímulos osteogénicos como el ácido ascórbico, fosfato inorgánico y la dexametasona para desarrollar osteoblastos. Luego identificaron otros factores de crecimiento como el TGF-beta, que las inducía a convertirse en condrocitos.
13 Clasificación del origen de las células madre Células madre adultas empleadas en BioHuman Las céluas madre embrionarias representan un dilema ético y por lo tanto NO SE UTILIZAN EN BIOHUMAN
14 Células madre embrionarias Células madre embrionarias: Forman parte de la masa celular interna de un embrión de 4-5 días de edad (blastocisto).
15 Células madre embrionarias Células madre embrionarias: Son pluripotentes: Pueden dar origen a las 3 capas germinales: vectodermo vmesodermo vendodermo
16 Células madre embrionarias Característica fundamental: Pueden dividirse en una célula idéntica a sí misma, manteniendo una población estable de células madre y una célula diferenciada.
17 Células madre adultas vse encuentran en tejidos adultos: vsangre de cordón umbilical vsangre periférica vmédula ósea vgrasa corporal
18 Células madre adultas vencargadas de la renovación periódica: regenerar los tejidos en contínuo desgaste o tejidos que han sufrido un daño (ej: piel, sangre, hígado)
19 Células madre adultas Algunas células madre adultas son capaces de diferenciarse en más de un tipo celular (son multipotentes)
20 Células madre adultas Algunas células madre adultas son capaces de diferenciarse en más de un tipo celular (son multipotentes) Células madre hematopoyéticas en la médula ósea encargadas de la formación de todas las células de la sangre
21 Células madre adultas Algunas células madre adultas son capaces de diferenciarse en más de un tipo celular (son multipotentes) O las células madre adultas mesenquimales: que pueden diferenciarse en células musculares, vasculares, nerviosas, óseas, etc.
22 Células madre adultas Otras células madre adultas son precursoras directas de los tejidos donde se encuentran, por ejemplo las células madre de la piel, músculo o las células madre germinales.
23 Existen diversas técnicas experimentales para obtener células madre NOSOTROS NO USAREMOS CELULAS MADRE EMBRIONARIAS. *!
24 Clasificación de células madre según potencialidad 1) Células madre Totipotentes: pueden crecer y formar un organismo completo incluyendo todos los tipos celulares: vcomponentes embrionarios (tres capas embrionarias, linaje germinal, tejidos que darán lugar al saco vitelino)
25 Clasificación de células madre según potencialidad 1) Células madre Totipotentes: pueden crecer y formar un organismo completo incluyendo todos los tipos celulares: v Componentes extraembrionarios como placenta.
26 Clasificación de células madre según potencialidad 2) Células madre embrionarias pluripotentes Se encuentran en la masa celular interna (ICM) del blastocisto.
27 Clasificación de células madre según potencialidad 2) Células madre embrionarias pluripotentes Se encuentran en la masa celular interna (ICM) del blastocisto. Pueden convertirse en cualquier tejido del organismo (con exclusión de la placenta).
28 Clasificación de células madre según potencialidad Fueron las celulas madre más estudiadas por un tiempo, corresponden a las conocidas células madre embrionarias (Embryonic stem cells o ESC s)
29 Clasificación de células madre según potencialidad Tienen la capacidad de diferenciarse en todos los tipos celulares que aparecen en el organismo adulto, dando lugar a los tejidos y órganos incluso línea germinal y saco vitelino (pero no un organismo completo).
30 Clasificación de células madre según potencialidad 3) Células madre multipotentes Están presentes en tejidos adultos y embrionarios
31 Clasificación de células madre según potencialidad 3) Células madre multipotentes Sólo pueden generar células de su misma capa o linaje de origen embrionario
32 Clasificación de células madre según potencialidad Entre los típos de células madre multipotentes Células madre hematopoyéticas Células madre mesenquimales
33 Clasificación de células madre según potencialidad Entre los típos de células madre multipotentes Células madre hematopoyéticas Células madre mesenquimales Nosotros trabajamos con éste tipo de células
34 Clasificación de células madre según su potencialidad 4) Células madre unipotenciales: vtambién llamadas células progenitoras. v Sólo tienen capacidad de diferenciarse en un tipo de células. v Por ejemplo células madre progenitoras musculares sólo pueden diferenciarse en células musculares.
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37 Sitios de obtención de las células madre Sitios de obtención de Células madre Adultas: Médula ósea Tejido adiposo Cordón umbilical humano Sangre periférica Sangre menstrual Hígado Bazo Testículos Fluido amniótico Páncreas Periostio, membrana sinovial, músculo esquelético, dermis, pericitos, hueso trabecular, pulmón, pulpa dental, etc.
38 Caracterización Celular Estas células deben caracterizarse y deben cumplir con las especificaciones descritas para su validación.
39 Caracterización Celular Estas células deben caracterizarse y deben cumplir con las especificaciones descritas para su validación. HSC s: Crecen en suspensión, presentan marcadores específicos de células madre hematopoyéticas.
40 Caracterización Celular Estas células deben caracterizarse y deben cumplir con las especificaciones descritas para su validación. MSC s: Se adhieren al plástico y NO presentan marcadores hematopoyeticos. Presentan marcadores específicos de células madre mesenquimales.
41 Obtención de células madre
42 CELULAS MADRE ADULTAS MESENQUIMALES Células madre mesenquimales (MSCs) son células multipotenciales a partir de las cuales pueden originarse los diferentes tipos de tejidos conectivos. Tejido mesenquimal: es el tejido conectivo que procede del mesodermo y tiene una gran variedad de tipos celulares llamadas células mesenquimales.
43 MSC s como terapia celular Fácil aislamiento y expansión en cultivo Multipotenciales Efectos paracrinos Propiedades inmunomoduladoras Amplio rango de aplicaciones médicas
44 Multipotencialidad de MSC s Tienen capacidad de transformarse en un tejido diferente del que formaban parte y adaptarse a la condiciones del medio ØTejido adiposo ØTejido cartilaginoso ØTejido óseo ØTejido hematopoyético ØTejido muscular
45 PROPIEDADES INMUNOMODULADORAS DE MSC S Numerosos estudios demuestran que MSC s: Evitan el reconocimiento de antígenos interfiriendo en la función de las células dendríticas y de los linfocitos T.
46 PROPIEDADES INMUNOMODULADORAS DE MSC S Numerosos estudios demuestran que MSC s: Tienen un efecto inmunosupresor local debido a su capacidad de secretar citocinas.
47 PROPIEDADES INMUNOMODULADORAS DE MSC S Numerosos estudios demuestran que MSC s: Tienen un efecto inmunosupresor local debido a su capacidad de secretar citocinas. Su efecto inmunosupresor está potenciado por un medio inflamatorio con presencia de niveles elevados de interferón gamma.
48 PROPIEDADES INMUNOMODULADORAS DE MSC S Conducta migratoria de MSC s y HSC s: capacidad de llegar a los sitios de inflamación causados por lesión en los tejidos, al inyectarse vía intravenosa Chapel et al, demostraron usando un marcador fluorescente, que MSC s migran a los tejidos lesionados, en cantidad proporcional a la gravedad y a la geometría de la lesión, proceso conocido como homing (anidamiento).
49 PROPIEDADES INMUNOMODULADORAS DE MSC S La dirección migratoria sigue un gradiente de densidad de quimiocinas, liberadas después de los daños. El aumento de la concentración de quimiocinas inflamatorias en el lugar de la inflamación es un mediador clave del anidamiento de las MSC al sitio de la lesión.
50 TRATAMIENTOS CON CELULAS MADRE ADULTAS
51 Tratamientos con células madre adultas Células madre adultas pueden curar enfermedades, aliviar el dolor e inflamación. Se han usado para tratar diabetes, lesiones de la espina dorsal, daño en los músculos, Parkinson, destrucción neuronal, infartos y como apoyo en pacientes de cáncer. Se consigue mediante el trasplante de SC s derivadas de médula ósea, tejido adiposo, sangre periférica o de cordón umbilical En ocasiones se utilizamos la tecnología de proliferación in vitro para aumentar el número de células madre y cubrir las necesidades del paciente.
52 Tratamientos con células madre adultas El trasplante de células madre hematopoyéticas se ha usado con éxito desde hace 50 años para tratar: Talasemias, Anemia falciforme Anemia aplásica grave Inmunodeficiencias combinadas graves (SCID) Como apoyo en algunas leucemias y linfomas Nosotros trabajamos con AUTO-Transplantes, es decir, procedimientos AUTÓLOGOS
53 Tecnología de Obtención de Células Madre
54 PSCs - ipscs
55 PSCs - ipscs En los últimos años ha aumentado notablemente el interés en las ipscs ya que no representan un reto ético. Las ipscs son generadas a partir de células somáticas a través de la expresión forzada de factores de transcripción específicos que reprograman las células y las llevan a un estado pluripotencial.
56 PSCs - Cultivo El cultivar PSCs requiere una combinación compatible de medio de cultivo, matrices, y métodos de pase que soporten la salud y pluripotencialidad de la célula. Hay sistemas de cultivo que utilizan feeder cells y otros que son feeder cells free.
57 Sistemas de cultivo con feeder cells La gran mayoría utiliza fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) que han sido irradiados o tratados con mitomicina c para el arresto del ciclo celular. Esta inactivación previene el sobrecrecimiento de los MEF y competencia con las PSCs.
58 Sistemas de cultivo con feeder cells En ocasiones se utilizan fibroblastos humanos inactivados como alternativa más adecuada para aplicaciones clínicas.
59 Sistemas de cultivo con feeder cells Ventajas y Desventajas Ventajas: Las feeder cells proporcionan proteínas de la ECM, citocinas y factores de crecimiento necesarios para las PSCs, por lo que éstos son considerados cultivos ricos y robustos.
60 Sistemas de cultivo con feeder cells Ventajas y Desventajas Desventajas: Requieren mayores cuidados para evitar la diferenciación: cambios diarios de medio, pases frecuentes, etc. Aún así pueden observarse áreas de PSCs diferenciadas. Debido al microambiente indefinido, se limita la interpretación de estudios para entender la biología de las PSCs. Las feeder cells pueden ser fuente de patógenos o contaminantes que pueden inducir una respuesta inmune.
61 Sistemas de cultivo feeder cells free Basados en reemplazar las feeder cells suplementando el cultivo con los componentes necesarios para el crecimiento de las PSCs. Existen medios de cultivo especiales acondicionados con las proteínas secretadas por las feeder cells.
62 Sistemas de cultivo feeder cells free Existen superficies especiales de cultivo como Thermo Scientific Nunc Nunclon Vita, libre de componentes animales y mantiene la pluripotencialidad por más de 10 pases, combinado con un inhibidor de ROCK.
63 Sistemas de cultivo feeder cells free Ventajas y Desventajas Ventajas: Requieren menos pasos (no hay que remover feeder cells). Posibilidad de realizar pases de una sola célula. Desempeño más consistente. Libre de posibles contaminantes y/o patógenos (excepto geles).
64 Sistemas de cultivo feeder cells free Ventajas y Desventajas Desventajas: Requieren medios definidos, de alta complejidad. Superficies de cultivo especiales.
65 PSCs - Cultivo La generación de PSCs es a menudo un paso intermedio para los verdaderos fines experimentales. El propósito es aprovechar la capacidad proliferativa y la pluripotencialidad de las ipscs para generar cualquier tipo de célula. La diferenciación de las PSCs a un linaje específico se obtiene por exposición controlada a condiciones específicas. Algunos protocolos requieren la formación de cuerpos embrionarios, que son agregados 3D de células.
66 PSCs Tipos de Medios de Cultivo
67 Ejemplos de uso clínico de las MSC s
68 MSC Criterios de selección En el 2006, la Sociedad Internacional de Terapia Celular ó ISCT propuso tres criterios para definir las células madre mesenquimales (CMM): 1. Deben ser adherentes en cultivo 2. Deben expresar CD73, CD90 y CD105 en ausencia de antigenos hematopoyéticos como CD34, CD45, marcadores de monocitos, macrófagos y linfocitos B 3. Deben ser capaces de diferenciarse in vitro en osteoblastos, adipocitos y condrocitos bajo condiciones estándar de cultivo. Además de lo propuesto por ISCT, para clasificarlas como células madre: deben realizar procesos de autorenovación, y ser capaces de desarrollar «plasticidad clonogénica» o diferenciación hacia tejidos de diferentes capas embrionarias como ectodermo y endodermo.
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71 Parámetro Sangre periférica (Tecnología de BioHuman) Médula ósea (Procedimientos convencionales) Sangre de cordón umbilical (Procedimientos convencionales) Tejido adiposo (Procedimientos convencionales) Éxito de aislamiento 100% 100% 30-40% 100% Implica disponer de un banco Dificultad asociada a la extracción de la muestra Ninguna Requiere anestesia, aspirado de médula con el cordón umbilical. Frecuentemente implica un Requiere quirófano para extraer vía lipoaspirado trasplante celular Viabilidad % <5% <5% <5% Porcentaje de células madre por ml de tratamiento a aplicar tras manipulación de la muestra en procedimientos regulares 100% % 8.0x10-9 % 0.002% Probabilidad de obtener células madre viables como parte de un tratamiento Muy alta Baja Muy baja Baja Riesgo de contagio o infección Ninguno Medio Alto Bajo
72 Parámetro Sangre periférica (Tecnología de BioHuman) Médula ósea (Procedimientos convencionales) Sangre de cordón umbilical (Procedimientos convencionales) Tejido adiposo (Procedimientos convencionales) Éxito de aislamiento 100% 100% 30-40% 100% Implica disponer de un banco Dificultad asociada a la extracción de la muestra Ninguna Requiere anestesia, aspirado de médula con el cordón umbilical. Frecuentemente implica un Requiere quirófano para extraer vía lipoaspirado trasplante celular Viabilidad % <5% <5% <5% Porcentaje de células madre por ml de tratamiento a aplicar tras manipulación de la muestra en procedimientos regulares 100% % 8.0x10-9 % 0.002% Probabilidad de obtener células madre viables como parte de un tratamiento Muy alta Baja Muy baja Baja Riesgo de contagio o infección Ninguno Medio Alto Bajo
73 MSC - Potencial terápéutico En modelos experimentales se ha demostrado que las MSC son capaces de regenerar tejidos deteriorados o lesionados: hueso cartílago tejido hepático miocárdico
74 MSC - Potencial terápéutico Se ha demostrado que son capaces de modular reacciones inmunes en: colagenopatías esclerosis múltiple trasplantes de médula ósea
75 MSC - Potencial terapéutico Una de las principales aplicaciones clínicas de las MSC consiste en la reparación de hueso, demostrado in vivo en ratones y en caninos con defectos cráneo-faciales y defectos de huesos largos.
76 MSC - Potencial terapéutico También tienen efectos regenerativos en el cartílago.
77 MSC - Potencial terapéutico Las MSC también juegan un papel importante en la reparación de tendón con una efectividad del 30%.
78 MSC - Potencial terapéutico En la reparación de miocardio tienen el efecto de: la diferenciación in situ en cardiomiocitos liberación de factores solubles parácrinos que promuevan la proliferación de células residentes de tejido y/o la fusión de las MSC con células cardiacas.
79 MSC - Potencial terapéutico Defectos congénitos en el músculo esquelético como distrofia muscular y otras miopatías, pueden ser teóricamente restaurados con un transplante de MSC que mejora la estructura y función del músculo.
80 MSC - Potencial terapéutico Las MSC desempeñan un papel importante en terapias angiogénicas, importantes para el rescate de tejidos en enfermedades isquémicas severas.
81 MSC - Potencial terapéutico Además de las propiedades regenerativas de las MSC, éstas también tienen la facultad de afectar el funcionamiento del sistema inmune.
82 MSC - Potencial terapéutico Pueden inhibir la proliferación de linfocitos inducida por aloantígenos, mitógenos como fitohemaglutinina y concavalina A; así como la activación a través de anticuerpos anti CD3 y CD28.
83 MSC - Potencial terapéutico Durante la maduración de células dendríticas, pueden inhibir la expresión de moléculas involucradas en la presentación de antigenos como CD1a,CD40, CD80, CD86 y HLA-DR.
84 MSC - Potencial terapéutico En co-cultivo con células mononucleares de sangre periférica, las MSC incrementan la proporción de subpoblaciones de linfocitos T reguladores
85 Caso Clínico: Diabetes Tipo II Ulceras Isquémicas
86 Antecedentes Paciente de sexo femenino 62 años de edad, viuda, ama de casa. Desde hace 13 años fue diagnosticada con Diabetes Tipo II y como consecuencia desarrollo ulcera isquémicas en el pie izquierdo Se presentó a Biohuman y consulto acerca de la posibilidad de colocación de células madre autólogas para ayudar a tratar la lesión.
87 Tratamiento con células madre adultas Previó al tratamiento se le realizó análisis microbiológico, el resultado fue positivo. Se le dio tratamiento y se confirmó con análisis microbiológico negativo. NOTA: No es conveniente colocar células si presenta proceso infeccioso.
88 Tratamiento con células madre adultas Sesión Observaciones Primera Ausencia de infección de úlcera Segunda Dos semanas (Pospuso para verificar) Tercera Sesión Mes NOTA. Se mantuvo en observación la paciente para controlar la aparición de infecciones y los cambios en la cicatrización
89 Lesión Inicial
90 Lesión Inicial
91 Primera sesión colocación de células autólogas
92 Primera sesión colocación de células autólogas (video)
93 Evaluación post aplicación (1 semana)
94 Evaluación post aplicación (1 semana)
95 Segunda sesión Aplicación de células madre y gel autólogo
96 Segunda sesión Aplicación de células madre y gel autólogo
97 Segunda sesión Aplicación de células madre y gel autólogo - video
98 Evaluación post segunda sesión
99 Evaluación post segunda sesión
100 Evaluación post segunda sesión
101 Tercera sesión aplicación de células madre autólogas
102 Resultados
103 Resultados juzgue por usted mismo
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