Evaluación de daño del ADN en células bucales

Transcripción

1 Evaluación de daño del ADN en células bucales Técnica del cometa alcalino A.D. Vanesa Verónica Miana Dr. Elio Prieto Universidad Abierta Interamericana, CAECIHS 04 de diciembre de 2013

2 Cometa alcalino: Evaluación del daño genético Permite evaluar distintos tipos de lesiones y reparación en el ADN. Útil en la caracterización de la genotoxicidad de agentes y exposiciones a mezclas complejas.

3 Cometa alcalino: Características Un método sensible que detecta, rompimientos de cadena simples (roturas puentes de H).Sitios lábiles al-álcali en células individuales. Separación y fragmentación del ADN y su migración por peso molecular. Económico y rápido

4 Cometa alcalino Es una técnica que nos permite: Identificar riesgos, sobre efectos de contaminación, por ej. Desarrollar medidas preventivas Controlar los niveles de daño genético Predisposición genética del individuo

5 Cometa alcalino: Metodología Células: No necesitan cultivo Daño genético: Medición en forma directa a través de la visualización de los cometas por tinción con Bromuro de Etidio y con Microscopio de fluorescencia. En humanos se puede determinar daño genético en: linfocitos de sangre periférica células del epitelio bucal, nasal y vaginal

6 Cometa alcalino Determinación del daño genético Se mide el ADN migrado desde el nucleoide (por la rotura de cadenas de los puentes de H) Mediante una escala de 5 niveles: Que es ponderada para generar un Indice de daño según la formula: n0 (0) + n1 (1) + n2 (2) + n3 (3) + n4 (4) (n: número de células; (): Indica el nivel de daño)

7 Mucosa Bucal: Generalidades Epitelio Plano Estratificado Queratinizado No Queratinizado

8 Estrato Corneo Intrínseca Queratinocitos Estrato Granuloso Estrato Espinoso Estrato Basal Epitelio Plano Estratificado Queratinizado Tipos de poblaciones celulares Melanocitos P. Permanente Células Merkel Extrínseca Células Langerhans Granulocitos P. Transitoria Linfocitos Monocitos

9 Basal Epitelio Plano Estratificado No Queratinizado Estratos Membrana Basal Corneo Lámina propia Submucosa

10 MEMBRANA BASAL Consiste en una banda acelular estrecha constituida por dos regiones: La lámina basal y otra reticular. LAMINA PROPIA Lámina de tejido conectivo de espesor variable. Da sostén y nutrición al epitelio. Células: fibroblastos, macrófagos, linfocitos, células cebadas y células plasmáticas

11 SUBMUCOSA Formada por tejido conectivo laxo. Su función es unir la mucosa a los tejidos subyacentes. Se encuentra en algunas zonas de la cavidad bucal

12 Mucosa Bucal: Clasificación Revestimiento Masticatoria Especializada

13 Mucosa de Revestimiento El epitelio es de tipo no queratinizado El corion es laxo o semilaxo y presenta una submucosa bien desarrollada Se encuentra en labio, paladar blando, cara ventral de la lengua, mejillas y piso o suelo de la boca Su función es de protección

14 Mucosa Masticatoria Sometida a fuerzas de fricción y presiones del impacto masticatorio. A este tipo de mucosa corresponde la encía y el paladar duro. El epitelio es queratinizado o paraqueratinizado. Corion es denso o semi denso Carece de submucosa en la encía. Esta fijada al hueso

15 Mucosa Especializada Recibe este nombre porque aloja botones gustativos intraepiteliales. Estos tienen una función sensitiva destinada a la recepción de los estímulos gustativos y además posee papilas linguales.

16 MUCOSA YUGAL La superficie interna está revestida por mucosa lisa, rosada y húmeda. El epitelio es plano estratificado no queratinizado. Submucosa bien desarrollada De donde tomamos las muestras. Lamina propia de tejido fibroelástico músculo estriado, tejido adiposo.

17 Técnica para células bucales Revisión Bibliográfica

18 Cometa alcalino Utilizada en diferentes investigaciones: Detectar el daño en la mucosa por el uso de Plaguicidas en agricultores y fruticultores así como Hidrocarburos y otros contaminantes en áreas rurales y urbanas Por el uso de metales en tratamientos Odontológicos como Ortodoncias, Aleaciones de Amalgama, uso de sistemas adhesivos para composites (restauraciones), uso de prótesis mal higienizadas e inadaptadas, hábitos de la población (alcohol /Tabaco, en todas sus formas.)

19

20

21 Referencias

22 Técnica Cometa Alcalino Estándar

23 MEDIO Preparación en laminas 1000 rpm 5 min Aspirar sobrenadante Agarosa de bajo punto de fusión.

24 Esquema ensayo Cometa alcalino Suspensión Celular Disponer la capa de agarosa sobre las laminas Análisis Electroforesis alcalina (ph 10) Lisis Trat. Alcalina ph 10 Tinción Bromuro de Etidio

25 IMÁGENES DE COMETAS TEÑIDOS CON BROMURO DE ETIDIO

26 Técnica Cometa Alcalino para células Bucales

27 Transporte al laboratorio PBS Preparación en laminas 2000 rpm 10 min Aspirar sobrenadante Agarosa de bajo punto de fusión.

28 Suspensión Celular Preparación de las laminas Tinción Bromuro de Etidio Electroforesis alcalina (ph 13) Lisis Trat. Alcalino ph 10 Análisis Proteinasa K, 1 hora a 37ºC Esquema ensayo Cometa alcalino

29 Técnica Cometa Alcalino para células Bucales

30 Transporte al laboratorio PBS Preparación en laminas 2500 rpm 10 min Aspirar sobrenadante Agarosa de bajo punto de fusión.

31 Suspensión Celular Preparación de láminas Tinción Bromuro de Etidio Tratamiento con tripsina al 25% por 30 min. y Proteinasa k 1 mg/ 1mL por 1 hora. Análisis Electroforesis alcalina (ph 7.5) Lisis Trat. Alcalino ph 9.1 Esquema ensayo Cometa alcalino

32 COMIENZO DEL TRABAJO ENSAYO Se realizaron varios procesos de obtención de células VERO y aplicación del protocolo estandard de electroforesis en células aisladas en gel de agarosa Una vez familiarizada con el método, pase a la obtención y procesamiento de células de mucosa oral Sujetos: dos hombres y dos mujeres, muestreados en dos ocasiones con una excepción. Total de muestras 14

33 Células VERO

34 Hasta cuando me van a seguir sacando células estos tipos

35 DISPOSITIVO PARA TOMA DE MUESTRA: ESPÁTULA DE AYRE Zona de empleo en la cavidad bucal Zona de empleo habitual en cérvix uterino

36 PROCEDIMIENTO ADAPTADO A LAS CONDICIONES DEL LABORATORIO Raspado con células de mucosa oral

37

38 Resultados

39 Toma de la muestra Pruebas 1-2 Prueba 3 De ambos carrillos con Espátula de Ayre. Tubo falcón con 4 ml de PBS. De ambos carrillos con Espátula de Ayre. Tubo falcón con 4 ml de PBS. Centrifugado 1000 rpm x 5 min rpm x 5 min Resuspensión celular Agarosa BPF 75 μl Agarosa BPF 75 μl Lisis Celular 2,5 M Nacl, 100 mm EDTA, 10 mm Tris, 10% DMSO, 1% Triton-X (ph10) 24 hs 4 C 24 hs. 2,5 M Nacl, 100 mm EDTA, 10 mm Tris, 10% DMSO, 1% Triton-X (ph10) 24 hs 4 C 7 días Trat. Alcalino Soluc. Buffer ph min Soluc. Buffer ph min Electroforesis solución 30 ml NaOH/5.0 ml EDTA ph ml NaOH/5.0 ml EDTA ph 10 Electroforesis condición 25 m 300 m A 25 v 25 m 300 m A 25 v Neutralización dh 2 O + Soluc Neutral: 0.4 trizma base ph7.5 Tinción BrEt BrEt Resultados Células completas, sin lisis de membrana celular. dh 2 O + Soluc Neutral: 0.4 trizma base ph7.5 Células completas, sin lisis de membrana celular.

40 Toma de Muestras Prueba 4-5 Prueba 6 Prueba 7 De ambos carrillos con Espátula de Ayre. Tubo falcón con 4 ml de PBS. Centrifugado 2000 rpm x 10 min Idem Idem Resuspensión celular Agarosa BPF 75 μl Idem 12 ml PBS + Agarosa BPF 75 μl Lisis celular 2,5 M Nacl, 100 mm EDTA, 10 mm Tris, 10% DMSO, 1% Triton-X (ph10) 24 hs 4 C 7 días Trat. Proteinasa K 100 μl P K (10 mg/ml) 37 C x 30 min Trat. Alcalino Soluc. Buffer ph min Electroforesis Solución 30 ml NaOH/5.0 ml EDTA ph 10 Electroforesis condición 25m 300 m A 25 v Idem Idem Neutralización dh 2 O + Soluc Neutral: 0.4 trizma base ph7.5 Tincion BrEt Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem Idem 100 μl P K (10 mg/ml) 37 C x 1 hora. Idem Idem Idem Resultado Células vacías, enteras, nucleosomas Nucleoides. ADN con poca migración. Células lisadas, ADN migrado y cometas 1 en cada 6 campos.

41 INDICADORES DE DAÑO EN EL COMETA

42 Cometas mucosa oral

43 ZONAS DE ROTURA IRREGULAR DE LA MEMBRANA

44

45 Cometa en nivel 1

46

47