MANUAL PRÁCTICO DE PRODUCCIÓN DE CONCHA PRIETA Anadara tuberculosa, EN CONDICIONES DE LABORATORIO

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1 MANUAL PRÁCTICO DE PRODUCCIÓN DE CONCHA PRIETA Anadara tuberculosa, EN CONDICIONES DE LABORATORIO Ecuador, 2015 SUBSECRETARÍA DE ACUACULTURA Av. Francisco de Orellana S/N Justino Cornejo Cdla. Kennedy Norte. Edificio Gobierno Zonal de Guayaquil Piso 12 Telf: 593 (4) CONCEPTO AZUL SA.: Circunvalación Norte 528B y Estero Salado, Urdesa Norte P.O.Box A Telefax conceptazul@gmail.com i

2 ii Índice Introducción... 1 I. Recolección de reproductores... 1 II. Selección... 2 II.1. Aspecto externo... 2 II.2. Sex ratio... 3 II.3. Madurez sexual... 4 III. Transporte... 5 IV. Acondicionamiento... 5 V. Alimentación de los reproductores... 6 VI. Inducción al desove... 7 VII. Desove... 8 VIII. Evaluación de óvulos y espermatozoides IX. Fecundación... 9 X. Cultivo larvario de Anadara tuberculosa X.1. Preparación de tanques para cultivo larvario X.2. Cultivo larvario en fase planctónica a. Cultivo b. Alimentación X.3. Cultivo larvario en fase bentónica a. Cultivo b. Asentamiento c. Engorde d. Alimentación e. Transporte y aclimatación de la semilla en Campo e.1. Preparación de la semilla para su despacho e.1.1. Monitoreo durante la etapa de engorde e.1.2. Cosecha Separación por tallas e.1.3. Biometrías e.1.4. Transporte e.1.5. Siembra Conclusión Agradecimientos Referencias bibliográficas... 22

3 iii Lista de las Ilustraciones Fig. 1: Anadara similis (a); Anadara tuberculosa (b)... 2 Fig. 2: Selección de reproductores... 3 Fig. 3: Órganos sexuales de A. tuberculosa: (a) hembra y (b) macho... 3 Fig. 4: Madurez sexual... 4 Fig. 5: Limpieza de reproductores... 5 Fig. 6: Proceso de clarificación... 6 Fig. 7: Cinética de elevación de la temperatura del agua para inducir el desove... 7 Fig. 8: Instalación para la inducción al desove de A. tuberculosa... 8 Fig. 9: Reproductores desovando... 8 Fig. 10: Desove de una hembra (a) y de un macho (b)... 9 Fig. 11: Fecundación Fig. 12: Siembra de óvulos fecundados Fig. 13: Desarrollo embrionario a 26ºC Fig. 14: Sistema de filtración mecánica (filtro de carbón activado, y filtros cartuchos) Fig. 15: Tanques cilindro cónicos de 500L para el cultivo larvario de A. tuberculosa Fig. 16: Desarrollo larvario de las fases planctónicas Fig. 17: Drenaje de tanques de cultivo larvario Fig. 18: Limpieza de larvas mediante tamices Fig. 19: Tanque de asentamiento y fijación larval Fig. 20: Desarrollo larvario de la fase bentónica Fig. 21: Cosecha de semilla de concha prieta A. tuberculosa Fig. 22: Biofilm formado por Navícula spp Fig. 23: Sistema de engorde de la semilla de concha prieta A. tuberculosa Fig. 24: Limpieza y desdoble de semillas de A. tuberculosa Fig. 25: Cosecha de semillas de A. tuberculosa Fig. 26: Separación por talla de semillas de A. tuberculosa Fig. 27: a) Selección y drenaje de semillas, b) Concha/gramo de las semillas de A. tuberculosa Fig. 28: a) Despacho de semillas en tarrinas, b) Caja transportadora Fig. 29: Medición de la salinidad de una poza para cultivo intermedio de las semillas Fig. 30: Ciclo de producción en laboratorio de la concha prieta... 21

4 Introducción Anadara tuberculosa, o concha prieta es un molusco bivalvo que habita los sustratos fangosos de manglares ubicados desde la Laguna Ballena (Baja California), hasta Tumbes, Perú (Mackenzie, 2001). La extracción del recurso concha constituye una de las pesquerías ancestrales más tradicionales del Ecuador y sostiene la economía de miles de familias asociadas a su extracción y comercio. Sin embargo, varios indicadores alertan que este recurso está siendo sobreexplotado (Mora y Moreno, 2009, Mora et al., 2012). En el Ecuador, la comercialización de la concha prieta abarca dos especies: A. tuberculosa (concha prieta) y A. similis (concha macho). Hoy en día esta actividad extractiva se desarrolla principalmente en los ecosistemas manglares de la provincia de Esmeraldas (Palma Real, San Lorenzo, Limones, Muisne), de Guayas (Puerto El Morro e Isla Puná) y de El Oro (Archipiélago de Jambelí) (Mora y Moreno, 2009) sosteniendo la economía familiar de miles de familias asociadas a su extracción y comercio. Esta actividad se viene intensificando debido a la creciente demanda nacional y del Perú. Ello se traduce por un aumento de las capturas nacionales, además del incremento del esfuerzo de pesca y de la proporción de individuos extraídos por debajo de la talla mínima legal de 45 mm de longitud total. Así mismo, la zona de Muisne y el Archipiélago de Jambelí han sido recientemente catalogados como sobreexplotados (Mora et al., 2012). El posible impacto socio-económico-ecológico de la desaparición de este recurso emblemático del ecosistema manglar ha conducido a proyectos de producción de semilla en condiciones artificiales de laboratorio en México (Robles-Mungarray et al., 1999), El Salvador (Vasquez et al., 2009), Perú (Diringer et al., 2011) y recientemente en Ecuador (Subsecretaria de Acuacultura; 2014) con fines: 1) de repoblamiento por siembra masiva de semillas en medio natural, y 2) como especie acuícola alternativa que podría ser cultivada de forma familiar debido a su bajo costo de producción. Este manual tiene como objetivo poner al alcance metodologías para la producción sostenible en laboratorio del molusco bivalvo A. tuberculosa con fines de operaciones de manejo y repoblamiento que responde a la necesidad creciente de preservar la continuidad de la especie. I. Recolección de reproductores La recolección de los reproductores de A. tuberculosa se realiza mediante la pesca directa en los manglares o por la compra de ejemplares en los puertos donde llegan los extractores artesanales concheros que las han obtenido en zonas permitidas del manglar. 1

5 2 II. Selección La selección de los reproductores constituye la primera etapa del proceso productivo, y corresponde a la obtención de ejemplares sexualmente maduros que presentan las características fenotípicas deseables. En la mayoría de los bivalvos, la madurez sexual depende del tamaño del animal más que de su edad, y el tamaño que alcanzan en la madurez sexual varía de una especie a otra y según la distribución geográfica. La producción de óvulos y esperma es un proceso denominado gametogénesis cuyo inicio depende de varios factores como el tamaño del bivalvo, la temperatura así como la cantidad y calidad de alimento que recibe el reproductor. De acuerdo a los diferentes estudios realizados entre Colombia y Perú, la talla de la primera madurez sexual se alcanza a partir de los 23 mm de longitud total en los individuos más precoces y que el 50% de la población esta sexualmente madura a los 45mm de longitud de valva. Esta talla es igualmente la talla mínima legal para la extracción. II.1. Aspecto externo El proceso de selección de los reproductores considera los siguientes puntos: 1. Diferenciar y seleccionar los individuos de la especie A. tuberculosa de otros bivalvos con morfología similar (A. similis) que son comercializados en conjunto. a b Fig. 1: Anadara similis (a); Anadara tuberculosa (b)

6 3 2. Verificar el aspecto externo del animal: ausencia de deformidad, huecos, y rajaduras, tomando como referencia que la talla mínima debe ser superior a 45mm. a b Fig. 2: Selección de reproductores 3. Descartar los animales débiles o moribundos, incapaces de cerrarse herméticamente ante cualquier estimulo. Luego de estas primeras etapas de selección, se requiere evaluar el nivel de madurez del lote y el sex ratio (proporción de hembras y machos) sacrificando entre el 5 y 10% de los animales seleccionados. II.2. Sex ratio (proporción de hembras y machos) Las conchas prietas A. tuberculosa son bivalvos dioicos que no presentan dimorfismo sexual. En consecuencia, la determinación del sexo requiere sacrificar el individuo. El sexo de los individuos se determina fácilmente en los reproductores sexualmente maduros y en proceso de maduración por el color de sus gónadas, de color blanquecina y de consistencia pegajosa en los machos y de apariencia granular y de color anaranjado en las hembras (Cruz, 1984). a b Fig. 3: Órganos sexuales de A. tuberculosa: (a) hembra y (b) macho

7 4 II.3. Madurez sexual La clasificación de la madurez sexual de los reproductores considera la siguiente tabla elaborada por Malca et al. (1996): ESTADÍOS DENOMINACIÓN CARACTERÍSTICAS I INMADURO Las gónadas rodean parcialmente al intestino. II EN DESARROLLO Las gónadas rodean completamente al intestino. III DESARROLLADO Las gónadas rodean completamente al intestino y parcialmente al estómago. IV MADURO Las gónadas rodean completamente al intestino y estómago. V DESOVADO Se observan pequeñas trazas o residuos gonadales. A B C D F D G Fig. 4: Madurez sexual E A) Ejemplar en estadio indiferenciado, no hay presencia de gónadas. B) Ejemplar macho en estadio de maduración inicial. C y D) Ejemplares en estadio de maduración y desarrollo (hembra izquierda, macho derecha). E) Hembras en máxima maduración: las gónadas pueden ser observadas fácilmente cubriendo la zona del estómago. F) Corte longitudinal de la gónada (hembra) apreciándose una contextura granulosa. G) Corte longitudinal de la gónada (macho).

8 5 III. Transporte Los reproductores de A. tuberculosa son relativamente resistentes y pueden soportar varios días en seco con la condición de estar protegidos de la luz solar directa y de no sufrir cambios bruscos de temperaturas. Si el transporte dura menos de 20 horas, esto se puede realizar en bolsas plásticas abiertas para evitar elevación de temperatura. Para trayectos más largos se recomienda transportar los organismos en una caja térmica con una esponja húmeda. A pesar de la resistencia de los animales, es importante minimizar las condiciones de estrés para evitar un desove espontáneo (no planificado) durante la aclimatación en laboratorio. IV. Acondicionamiento El acondicionamiento consiste en la preparación de los reproductores a la fase crítica de desove, para garantizar la producción de gametos de buena calidad. Este procedimiento permite mantener, acelerar o retrasar la maduración sexual de los bivalvos mediante el control de la temperatura así como de la cantidad y calidad de la dieta de microalgas. Los bivalvos tropicales exhiben generalmente períodos de desove pocos definidos y son capaces de desovar durante la mayor parte del año. Los diferentes estudios de fisiología reproductiva de A. tuberculosa indican que existen individuos maduros todo el año, con una mayor prevalencia entre los meses de febrero a marzo (Mendoza et al., 2007). Por lo antes mencionado, el acondicionamiento de A. tuberculosa consiste esencialmente en colectar, seleccionar los reproductores e inducir el desove dentro de los 10 primeros días de acondicionamiento. Es posible sincronizar el desove, acelerar la maduración de los reproductores y/o incrementar la proporción de animales maduros con una alimentación adecuada, y manteniéndolos en un intervalo de temperatura de C durante al menos 2 semanas. Al llegar al laboratorio, las conchas colectadas son limpiadas con cepillos de cerdas plásticas y agua de mar, para eliminar toda suciedad adherida que puedan tener. Fig. 5: Limpieza de reproductores

9 6 Luego, se realiza una etapa de clarificación, que consiste en no alimentar a los animales durante 24h con el fin de vaciar los residuos de sus contenidos estomacales. Para ello, se transfiere los reproductores en canastillas suspendidas dentro de un tanque de fibra de vidrio de forma cilíndrica con 200 litros de agua de mar filtrada a 1µm que debe ser renovada continuamente. Fig. 6: Proceso de clarificación Los reproductores aclimatados son mantenidos en suspensión en agua filtrada a 1µm renovada al 100% cada 3 días. La calidad del agua se mantiene sifoneando diariamente el fondo del tanque. Las experimentaciones apuntan a que los animales sean mantenidos en aguas que presenten una salinidad de 30 a 35ppt y una temperatura de 24 a 28 C. V. Alimentación de los reproductores La alimentación de los reproductores es esencial y condiciona la formación de gametos de calidad. Primero, es importante considerar que la dieta propuesta debe cubrir los requerimientos biológicos y reproductivos del animal, en particular en las cantidades y composición de los ácidos grasos poli insaturados (PUFAs). La utilización de dieta mixta, que consiste en la mezcla de diferentes microalgas disminuye los riesgos de carencias alimenticias. Segundo, es importante asegurar una cantidad de alimento suficiente para que el animal disponga de la energía necesaria para la formación de gónadas. Para compensar la ausencia de información sobre los requerimientos alimenticios de los reproductores de A. tuberculosa, se considera una mezcla de varias microalgas; Isocrysis galvana, Pavlova luthery, Chaetoceros gracillis Chaetoceros calcitrans, y Thalasiosira sp., a una concentración final de al menos cel/ml. El monitoreo del consumo de las microalgas permite evaluar las cantidades de microalgas a proporcionar. La alimentación puede estar fraccionada en 2 raciones diarias, realizadas después de los recambios. Otro método cuantitativo consiste en calcular la ración alimenticia basándose en la evaluación del peso de los adultos. Se asume que la ración alimenticia necesaria para los reproductores oscila entre el 2% y el 4% del peso seco medio de carne no blanda después de secarlos en un horno (de 60 a 80 C de 48 a 72 horas). La fórmula presentada a continuación permite determinar el peso seco por adulto de las algas necesario para una ración diaria al 3%.

10 7 g de ración por día por adulto = 0.03 X peso seco medio de la carne (g). El g de ración por día puede corresponder a una masa de microalga en pasta si existe este insumo. Caso contrario se considera un volumen de microalga a distribuir mediante la evaluación de la concentración del cultivo de microalgas relacionado con el peso de la microalga, constante en mg/millón de células disponible por cada especie (Helm et al., 2006). VI. Inducción al desove En los bivalvos, la inducción al desove consiste en provocar la expulsión de los gametos maduros como respuesta a la aplicación de uno a más estímulos. Existen varias técnicas de inducción de desove en los bivalvos, como choque térmico, choque químico, choque de microalgas, estimulación por adición de esperma en el agua y finalmente sacrificio de los reproductores, colecta y mezcla de los gametos. La inducción puede realizarse en animales acondicionados por varios días o en animales recién recolectados del medio ambiente. A. tuberculosa puede ser inducida al desove con éxito mediante: choques químicos (formol), choque solar (dejando secar al sol los animales), choque térmico (cambio brusco de temperatura). El método más recomendable corresponde al choque térmico gradual, el cual consiste en elevar la temperatura del agua de mar que se encuentra normalmente entre 25 C a 28 C hasta 35 C manteniendo esta temperatura durante 5 horas hasta la inducción del desove. (Vasquez et al., 2009). Temperatura de desove temperatura (ºC) temperatura tiempo (horas) Fig. 7: Cinética de elevación de la temperatura del agua para inducir el desove También se observa que la utilización de choques térmicos bruscos es igualmente eficiente. Los organismos son suspendidos en canastillas dentro de recipientes plásticos con agua de mar, la cual es temperada mediante un termostato. Los animales son conservados bajo observación constante para registrar el inicio del desove.

11 8 Fig. 8: Instalación para la inducción al desove de A. tuberculosa VII. Desove En los cultivos de bivalvos, se considera 2 formas de realizar la fecundación: (1) El desove masal que consiste en dejar desovar los reproductores en un tanque profundo de gran volumen donde la fecundación es aleatoria. Este tipo de desove no permite colectar información confiable pero es más sencillo de realizar y no perturba a los animales. (2) El desove individual que consiste en retirar cada reproductor que comienza a expulsar sus gametos y transferirlo en una jarra de aproximativamente 1L donde terminará de desovar. Los gametos de las jarras pueden ser contados para realizar una fecundación según las proporciones 1 óvulo por 100 espermatozoides. La fecundación tiene lugar en otro recipiente sin reproductores donde se mezclan los gametos. Esta técnica permite seleccionar los reproductores y gametos viables antes de realizar la mezcla. Generalmente los reproductores que inician el desove estimulan a sus congéneres, lo que permite una relativa sincronización de la emisión de gametos. Fig. 9: Reproductores desovando El color y la apariencia de los gametos expulsados permiten determinar el sexo del animal.

12 9 VIII. Evaluación de óvulos y espermatozoides. Los reproductores que inician el desove deben ser monitoreados para evaluar la calidad de los productos sexuales emitidos. La fertilización, debe llevarse a cabo mediante el uso exclusivo de los gametos que han sido emitidos de forma continua y fluida por los reproductores. Los animales que presentan emisiones de gametos interrumpidas con o sin presencia de grumos celulares corresponden a desoves parciales o a abortos y no son recomendables para las operaciones productivas. Esos animales deben ser retirados La emisión de los gametos del macho se aparenta a la expulsión de un chorro lechoso continuo, a diferencia del desove de las hembras que tiene un aspecto granular y anaranjado. a b Fig. 10: Desove de una hembra (a) y de un macho (b) En el caso de la fecundación controlada, los productos sexuales son revisados al microscopio antes de ser utilizados para verificar su calidad. Los óvulos recién desovados tienen forma de pera pero adquieren una forma esférica al entrar en contacto con el agua de mar y miden aproximativamente 55µm. Los óvulos incapaces de hidratarse dentro de los minutos post emisión deben ser rechazados. Los espermatozoides son redondos exhiben una cola y presentan una buena actividad. En el caso del desove controlado, las suspensiones de óvulos son tamizadas suavemente con una malla de 55µm antes de la fecundación para eliminar restos fecales contaminantes de los adultos. Este proceso permite reducir el riesgo de una proliferación bacteriana o de otros microorganismos durante la fase siguiente del proceso de cultivo. IX. Fecundación La fecundación corresponde a la fusión entre los gametos masculinos y femeninos expulsados. En el caso del desove controlado, la operación consiste en mezclar los productos sexuales elegidos (esperma y óvulos). Es posible realizar una fecundación masal (mezcla de todos los gametos en un recipiente más grande) o una fecundación controlada (un macho seleccionado con una hembra seleccionada) en caso que se desea realizar trazabilidad genética. La fecundación se ejecuta dentro de un lapso de 30 minutos, y puede realizarse por grupos en caso de que algunos reproductores no estén sincronizados.

13 10 Fig. 11: Fecundación Los óvulos fecundados son colocados en tanques de 500 litros de capacidad con agua de mar filtrada a 1 µm. Fig. 12: Siembra de óvulos fecundados El desarrollo embrionario de A tuberculosa es similar al desarrollo observado en otras especies de bivalvo, marcado por la expulsión de los glóbulos polares y con las diferentes divisiones celulares hasta la obtención de una larva trocófora. Esta etapa dura aproximadamente 6 a 8 horas a una temperatura de 26 C. Es importante realizar observaciones microscópicas para evaluar la calidad y velocidad de división y obtener un aproximado de la tasa de fecundación. Fig. 13: Desarrollo embrionario a 26 C: Óvulo fecundado de 55µm (A); Aparición del primer glóbulo polar (B); Divisiones celulares(c, D, E y F); Larva trocófora (G y H).

14 11 X. Cultivo larvario de Anadara tuberculosa Las metodologías utilizadas para el cultivo larvario de A. tuberculosa en el laboratorio fueron principalmente adaptadas de las metodologías presentadas por Helm et al. (2006), utilizando recomendaciones de Robles-Mungaray et al. (1999) y Vásquez et al. (2009). X.1. Preparación de tanques para cultivo larvario Los cultivos se realizaron en tanques negros de 500L a 2000L de capacidad con agua de mar filtrada a 1µm y aireación constante. El material del tanque (fibra de vidrio, plástico) y la forma (cilíndricos, cilindro cónicos) pueden variar. Las paredes internas no deben presentar irregularidades o rugosidades. Antes de la siembra, los tanques son desinfectados con hipoclorito de sodio, el cloro es neutralizado con vitamina C antes de ser finalmente enjuagados con agua de mar filtrada. Los tanques de cultivo son llenados con agua de mar pasada por filtro de carbón, filtro de cartucho y finalmente un bolso de 1 µm. En función de la calidad microbiana del agua de bombeo se recomienda esterilizarla por UV después de las etapas de filtración. Fig. 14: Sistema de filtración mecánica (filtro de carbón activado, y filtros cartuchos) La aireación del cultivo es primordial para facilitar la suspensión de las larvas planctónicas y para favorecer una distribución uniforme de las microalgas. Para ello, se sumerge en el fondo del tanque una piedra difusora cuyo flujo está regulado por una válvula. La aireación debe ser suave al inicio del cultivo y se incrementa a medida que las larvas van desarrollándose.

15 12 Fig. 15: Tanques cilindro cónicos de 500L para el cultivo larvario de A. tuberculosa El desarrollo larvario de la concha prieta es muy parecido al desarrollo observado en la mayoría de los moluscos bivalvos. Este proceso cuenta con: Una fase planctónica con los estadios de; larva trocófora, larva D o veliger, larva umbonada, larva con ojo. Una fase intermedia con el estadio de larva pediveliger en la cual la larva presenta un comportamiento plancto-bentónico y empieza a buscar un substrato adecuado para asentarse. Una fase bentónica cuando la larva pierde su capacidad natatoria pasando por los estadios de; larva asentada, larva metamorfoseada y finalmente semilla. X.2. Cultivo larvario en fase planctónica a. Cultivo El cultivo larvario en tanques de 1 TN de capacidad se inicia con una densidad de 5 larvas / ml. El cultivo puede iniciar con larvas trocóforas o con larvas D que son cosechadas en la superficie del tanque de eclosión ayudados con un tamiz de ojo de malla de 35 µm. Se recomienda iniciar el cultivo con larvas D, obtenidas a partir del tanque de eclosión. La duración de este ciclo depende principalmente de la temperatura, de la calidad y cantidad del alimento disponible así como de la densidad. Fig. 16: Desarrollo larvario de las fases planctónicas a) larva tipo D, b) larva umbonada, c) larva con ojo, d) larva pediveliger En estas condiciones, el desarrollo larvario dura entre 15 a 18 días a 28 C desde la larva D hasta el asentamiento.

16 13 A partir del estadio de larva D, las tanques de cultivo larvarios deben ser completamente drenados todos los días o pasando en intervalos de un día en función del nivel de suciedad. Las larvas son cosechadas en sistemas de tamices con ojos de malla adaptados a su tamaño puestos en baldes. Posteriormente, las larvas son transferidas en tamices más pequeños que son drenados con grandes cantidades de agua limpia filtrada a 1 µm. Esta proceso permite: uniformizar los lotes, desechar las larvas más pequeñas, eliminar las heces acumuladas y disminuir las cargas microbianas. Fig. 17: Drenaje de tanques de cultivo larvario Fig. 18: Limpieza de larvas mediante tamices Las larvas seleccionadas y limpias regresan al tanque de producción previamente llenado con agua de mar temperada y limpia antes de ser alimentadas. Es importante de mantener una temperatura estable durante el cultivo. La temperatura adecuada para el cultivo larvario de A. tuberculosa se sitúa entre 27 C y 28 C en todos los estadios larvarios. La salinidad debe permanecer en 35ppt. Los cultivos deben ser monitoreados al nivel macroscópico y microscópico todos los días y, de ser posible, varias veces al día. El laboratorio debe contar con un microscopio con micrómetro para evaluar el tamaño de los animales a lo largo del cultivo. Es muy importante tener registradas todas las informaciones disponibles del cultivo en un cuaderno de producción.

17 14 b. Alimentación En los cultivos de moluscos bivalvos, la alimentación consiste esencialmente de microalgas unicelulares. Estas microalgas condicionan el éxito del cultivo larvario. Los cultivos de microalgas deben cumplir con los siguientes requisitos: Calidad; tamaño y forma adecuada de la célula, un aporte nutritivo que cubra los requerimientos fisiológicos, cultivos que poseen una carga microbiana mínima. Cantidad; el suministro debe estar en cantidades adecuadas para no ensuciar el cultivo pero que no falten las microalgas. Oportunidad; fragmentación de las dosis, adición de microalgas de tamaño de célula adecuada al tamaño de la larva. Para proporcionar una dieta que cubra los requerimientos fisiológicos se aconseja la utilización de dos o más especies de microalgas de alto valor nutritivo. Las especies consideradas son generalmente microalgas flageladas y diatomeas céntricas. Para el cultivo larvario de concha prieta se considera las siguientes microalgas: Isochrysis galvana y Pavlova lutherii son especies flageladas que proporcionan ácidos grasos y perfiles de HUFAS parecidos pero P. lutherii posee más 22:6n3 (DHA - ácido docosahexaenoico) y ambas especies son de tamaño adecuado para alimentar los primeros días de la etapa larvaria. Chaetoceros calcitrans y C. gracillis son diatomeas de composición bioquímica adecuada para el crecimiento por ser ricas en 20:5n3 (EPA - ácido eicosapentaenoico) y HUFAS pero su tamaño es mayor que las flageladas. Por ello estas especies son suministradas al menos 2 días después del inicio del cultivo en cantidades pequeñas que van aumentando hasta representar el 60% de la dieta. La alimentación se divide en al menos 2 dietas. La primera se suministra inmediatamente después del recambio de agua, mientras que las siguientes están distribuidas de manera a mantener alimento hasta el día siguiente. La tabla a continuación representa las concentraciones de células a mantener en el cultivo. dens idad total es pecies dias Cel/ml Is ocrhrys is Pavlova C. calcitrans C. gracillis % % 10% % 10% 5% % 10% 5% 5% % 10% 10% 10% % 10% 10% 10% % 10% 10% 10% % 10% 10% 20% % 10% 10% 20% % 15% 15% 20% % 15% 15% 20% % 15% 15% 20% % 20% 10% 30% % 20% 10% 30% % 10% 10% 40% % 10% 10% 40% % 10% 10% 50% % 10% 10% 50% Tabla 1: Dieta alimenticia usada diariamente para el cultivo larvario de A. tuberculosa

18 15 X.3. Cultivo larvario en fase bentónica a. Cultivo Al pasar al estadio de pediveliger (250 µm), las larvas se preparan para adherirse al sustrato, culminación de su vida plantónica. En este estadio, la larva cambia de comportamiento y explora el fundo en búsqueda de un sitio de asentamiento. Este momento es crucial ya que es durante este proceso que se presentan las mayores tasas de mortalidad. Para favorecer la fijación se aconseja transferir las larvas pediveliger en tanques negros cilíndricos que presentan gran superficie de fondo. Para ello se utilizan tanques de 2m de diámetro y una capacidad de 2 TN. En esta etapa, los tanques son llenados hasta una altura de 50 cm como máximo con agua de mar filtrada. Se agrega larva pediveliger a los tanques a razón de 100 larvas /cm2. El cultivo se mantiene con aireación constante. Fig. 19: Tanque de asentamiento y fijación larval Es importante continuar con recambios diarios o pasando un día para eliminar las suciedades que se acumulan en el fondo del tanque. Estas deben ser despegadas suavemente enviando un flujo de agua. Cuando las larvas presentan un comportamiento de asentamiento, la temperatura de cultivo deber ser incrementada a 29 C-30 C para favorecer la fijación. b. Asentamiento La etapa de asentamiento puede demorar de 2 a 3 días. Las larvas que no se han fijado en este lapso de tiempo probablemente no lograron transformarse y morirán. a b c Fig. 20: Desarrollo larvario de la fase bentónica a) larva asentada, b) larva metamorfoseada, c) post larva de 1 mm.

19 16 El cultivo en los tanques de asentamiento se prolonga hasta obtener larvas metamorfoseadas de 1mm que son llamadas semillas. En condiciones controladas, este estadio se obtiene de 20 a 25 días después del asentamiento. Se recomienda de esperar que las semillas midan por lo menos 1 mm antes de iniciar la cosecha. La cosecha de las semillas se realiza raspando el fondo lentamente. Las larvas son recuperadas por sifoneo y limpiadas con abundante agua. Una biometría por peso permite evaluar la tasa de sobrevivencia entre la fase de pediveliger y la cosecha. Esta tasa oscila entre el 10 y el 25% de la población de larva pediveliger. Fig. 21: Cosecha de semilla de concha prieta A. tuberculosa Al contrario de otras especies de moluscos bivalvos, se observa que el uso de sustratos (concha molida, arena, PVC, etc.) no es necesario y no favorece la fijación. Sin embargo, buenos resultados de fijación fueron obtenidos con la colonización natural del fondo del tanque por un biofilm de microalgas bentónicas, en particular del género Navícula spp., Estos biofilms espontáneos fueron favorecidos con la exposición a una luz solar moderada de los tanques de asentamientos 3 a 4 días antes de la siembra. Fig. 22: Biofilm formado por Navícula spp. La formación dirigida de este biofilm puede realizarse en caso de tener un cultivo de Navícula. Los tanques de cultivo pueden ser sembrados 2 días antes de la transferencia de las larvas pediveliger. También, se observa que las tasas de asentamiento pueden incrementarse con la administración de cepas de microalgas ricas en glicógeno como Rodomonas sp. Estas cepas suplementadas a la dieta normal unos días antes de la fijación permiten a las larvas ganar reservas energéticas importantes para la metamorfosis.

20 17 c. Engorde Las semillas colectadas son sembradas en canastas suspendidas en tanques negros cilindrocónicos de 500L. Este sistema permite posicionar las semillas en el fondo de los tanques. El crecimiento se realiza a temperatura ambiente y a 35ppt de salinidad con fuerte oxigenación. El nivel de agua de cultivo debe sobrepasar las canastas para permitir una mejor distribución del alimento. La limpieza de los animales y del fondo se realiza a diario pasando suavemente un flujo de agua limpia enviado a presión para levantar la suciedad. En esta etapa de su vida, las semillas tienen la capacidad de formar bisos para prenderse fuertemente al fondo o a las paredes. Cuando las condiciones de cultivo se deterioran y en particular cuando el alimento escasea las semillas tienden a salir de las canastas y del tanque. Este comportamiento es mínimo si las concentraciones de microalgas del tanque se mantienen suficientemente altos. Fig. 23: Sistema de engorde de la semilla de concha prieta A. tuberculosa d. Alimentación Durante la fase de asentamiento se observa una breve disminución del consumo de microalgas. Se asume que es durante esta etapa que las larvas utilizan las reservas acumuladas para realizar la metamorfosis. Una vez metamorfoseadas, el consumo de microalgas va incrementando de forma exponencial a medida que crece la semilla. En esta etapa se subministra cel/ml, ración que debe ser repartida en dos dietas o más para una mayor eficiencia. En esta etapa parte de la dieta está compuesta por la diatomea Thalassiossira sp. A este nivel es muy importante evaluar constantemente la concentración en microalgas del agua para determinar si se incrementa o si se mantiene la dosis. En las etapas post fijación, muchos laboratorios de producción de semillas de bivalvos cuentan con una unidad de cultivo de microalgas nativas. El objetivo de esta unidad consiste en fertilizar agua del medio sin filtración previa para favorecer un bloom de microalgas nativas presente en el medio.

21 18 e. Transporte y aclimatación de la semilla en Campo e.1. Preparación de la semilla para su despacho El objetivo del laboratorio de producción de semillas de bivalvo reside en producir y entregar grandes cantidades de semillas de calidad lo más pronto posible debido al incremento rápido del costo de mantenimiento de las semillas a medida que crecen. A la vez, se considera que mientras más grandes sean las semillas, mejores serán los resultados de engorde en el medio natural. En efecto los individuos pequeños son menos aptos a enfrentar las variaciones ambientales naturales, lo que se traduce en menores sobrevivencias, además son más complicados a mantener en suspensión y a manipular. Por ello, es importante mantener un equilibrio entre el tiempo máximo de las semillas en las condiciones controladas ofertas por los laboratorios y despachar rápidamente los productos al campo. e.1.1. Monitoreo durante la etapa de engorde Durante este proyecto, se considera que las semillas de concha prieta podrían ser transferidas a etapas de cultivo intermediario o siembra directa entre los 3-5mm de longitud de valva. El monitoreo diario de las semillas hasta el despacho consiste en alimentar, limpiar los animales y controlar la sobrevivencia de los lotes mantenidos en las canastas de engorde. Además, cada 15 días, los lotes son cosechados en su integridad, para realizar mediciones de longitud, evolución de pesos individuales, sobrevivencia, limpieza completa de las semillas y de los sistemas de cultivos, cambio de malla y desdoble de ser necesario. e.1.2. Cosecha Fig. 24: Limpieza y desdoble de semillas de A. tuberculosa Las semillas de concha prietas son desprendidas con mucho cuidado manualmente o con la ayuda de una malla de celosía doblada o de un suporte rígido y delgado. a) b) Fig. 25: Cosecha de semillas de A. tuberculosa a) Manual, b) con malla de celosía doblada

22 19 Separación por tallas La semilla que será sembrada en campo debe tener un mínimo de 3 mm de longitud de valva. La separación por talla de los animales es esencial para entregar lotes homogéneos y así minimizar la dispersión natural de tamaño que puede existir dentro de un mismo lote. La selección se realiza mediante el uso de clasificadores manuales que corresponden a secciones de tubo de PVC acoplados con mallas de luces de tamaño descendente. La operación de clasificación de semillas limpias se realiza en el agua. Se añade una pequeña cantidad de semilla a una malla de tamaño ligeramente inferior al de los animales más grandes y se coloca el clasificador en el agua hasta que no se escape más semilla a través de la malla. Los animales retenidos por la malla son retirados. El proceso puede repetirse con clasificadores de luces de malla más pequeños si es necesario. Fig. 26: Separación por talla de semillas de A. tuberculosa e.1.3. Biometrías Una vez separadas por clase de talla, la tarea siguiente consiste en determinar la biomasa de semillas en cada lote. Los tamices que contienen las distintas clases necesitan drenarse totalmente hasta que toda el agua se haya escurrido de las semillas retenidas. Las semillas son transferidas sobre una malla de nailon recortada para formar un haz que es suavemente balanceado para retirar toda el agua. Se puede acelerar el drenaje dando golpes suaves con trapos secos o toallas de papel para absorber el exceso de agua de la malla. Las larvas son pesadas con la ayuda de una balanza digital de precisión. La estimación poblacional se realiza recuperando 3 sub muestras de 1g para conteo individual. Fig. 27: a) Selección y drenaje de semillas, b) Concha/gramo de las semillas de A. tuberculosa

23 20 El promedio de concha/gramo obtenido es extrapolado para determinar la cantidad de semillas disponibles. e.1.4. Transporte Para transportes cortos, las semillas son transportadas desde el laboratorio hasta el campo en tarrinas tapadas con agua de mar limpia. Estas tarrinas son colocadas en una caja transportadora, la cual contiene en el fondo una esponja húmeda. Fig. 28: a) Despacho de semillas en tarrinas, b) Caja transportadora En verano, la transferencia de los tanques al engorde suele darse al inicio de la mañana o a final de la tarde cuando las temperaturas son más bajas. La transferencia tiene que hacerse en el menor tiempo posible para reducir estrés y mortalidades. Experimentaciones de transportes más largos bajo 2 metodologías demostraron que las semillas resisten a viajes de 18h sin inconvenientes con sobrevivencias del 100% a los 15 días. 1. Transporte en seco que consiste en colocar las semillas (superiores a 3mm de longitud de las valvas) sobre una esponja colocada en un balde con hielo. La temperatura dentro del balde tapado varía de 20 hasta 22 C. 2. Transporte en agua por el cual las semillas son transferidas en tarrinas con agua de mar limpia. A las 18 horas se devolvieron las semillas a sus condiciones normales de cultivo. e.1.5. Siembra Las semillas de A. tuberculosa de 3mm en adelante, producidas en laboratorio, están perfectamente adaptadas a la cría en campo y exhiben excelentes sobrevivencias (superiores al 90%) cuando son protegidas de los depredadores y cuando las variaciones naturales de los parámetros físico-químicos fluctúan entre los rangos de tolerancia de la especie. Fig. 29: Medición de la salinidad de una piscina para cultivo intermedio de las semillas Las experimentaciones en campo indican que A. tuberculosa soporta fluctuaciones de temperaturas del agua entre 25 C hasta 32 C, niveles de oxígeno disuelto de 1 hasta 2 mg/l. Sin embargo, salinidades inferiores a 25 ppt y superiores a 45 ppt inducen mortalidades altas. Las semillas mostraron buena tolerancia a temperaturas bajas (18 C) sin afectar la sobrevivencia pero con crecimientos nulos. Antes de sembrar, se recomienda aclimatar las semillas a sus nuevas condiciones de cultivo verificando siempre que las condiciones del medio receptor correspondan a los mínimos fisiológicos exigidos por la especie.

24 21 El tiempo de aclimatación depende de la diferencia que existe entre los parámetros fisicoquímicos de la tarrina y del ambiente receptor. Los parámetros importantes a equilibrar son temperatura, ph y salinidad. En caso de transporte a distancias cortas y cuando los parámetros entre las 2 aguas son similares, las tarrinas son transferidas en un tanque con agua del ambiente receptor para mantener la temperatura durante la aclimatación. Luego se adiciona un 30% a 50% de agua del cubo dentro de las tarrinas y se espera 30 minutos observando el comportamiento de los animales. Este proceso puede repetirse una vez más antes de transferir las semillas a su nuevo ambiente. Cuando los parámetros difieren, es recomendable equilibrar el agua de transporte con agua del cubo a razón de 1 C o 0.5 unidad de ph o 2ppt de salinidad cada 30 minutos observando el comportamiento de los animales. La operación se repite hasta equilibrio. Se recomienda vigilar la concentración de oxígeno disuelto durante el proceso de aclimatación. En caso de diferencias importantes entre las aguas del laboratorio y del ambiente receptor, se recomienda iniciar el proceso de aclimatación en el laboratorio. Fig. 30: Ciclo de producción en laboratorio de la concha prieta

25 22 Conclusión La concha prieta (Anadara tuberculosa) es una especie que tiene un tradicional uso económico y un mercado desarrollado en Ecuador. Hoy en día esta especie sostiene la economía familiar de miles de familias asociadas a su extracción y comercio y ocupa un espacio importante en la cultura gastronómica del País. El importante decrecimiento de las poblaciones silvestres resultado del aumento de la presión extractiva y de la reducción del hábitat natural por actividades antropogénicas es alarmante. El presente manual tiene como objetivo facilitar el desarrollo de la actividad de cría de concha prieta para operaciones de repoblamiento y de cultivo comercial a partir de semillas de A. tuberculosa producidas en laboratorio. Para que esta actividad se torne sostenible, la producción de semillas de concha prieta debe apoyarse de los resultados de las investigaciones en genética y en patología realizados en paralelo al presente manual. Por una parte, las recomendaciones de cruces controlados para evitar endogamia y pérdida de diversidad genética basada en las evaluaciones genéticas de la concha prieta ecuatoriana permitirán realizar operaciones de repoblamiento que preserven el pool genético nacional. Por otra parte, el diagnóstico molecular de los principales patógenos vigilados por la OIE en los reproductores antes del desove o para monitorear eventuales eventos de mortalidades prevendrá la aparición y dispersión de estas enfermedades. La aplicación temprana de estas herramientas evitará los errores cometidos en otras especies de importancia acuícola que enfrentan actualmente las consecuencias de no haber considerado en sus programas la prevención de enfermedades y la genética. Los próximos pasos para fortalecer estas actividades corresponden a: 1) cerrar el ciclo de vida de esta especie y mejorar las producciones mediante la selección de individuos cada vez más adaptados al cultivo; 2) Mejorar el conocimiento en eco fisiología de esta especie (interacción medio-especie); 3) A partir de estos datos, afinar los protocolos de engorde de las semillas obtenidas hasta la talla comercial; 4) Estudiar y evaluar las tasas de sobrevivencia de las semillas utilizadas en las operaciones de repoblamiento. En conjunto estas actividades permitirán establecer una estrategia sostenible e integrada para la conservación de un recurso de interés nacional por su importancia social, económica y ambiental. Agradecimientos El presente programa de producción de semillas de concha prieta Anadara tuberculosa pudo ser realizado en primer lugar gracias a la importante colaboración de las comunidades de extractores de concha prieta en particular a las asociaciones de concheros de Costa Rica (Puerto Hualtaco, El Oro), Campo Alegre (Isla Puna Guayas) y Punta Miguel (San Lorenzo, Esmeraldas). Se debe resaltar también el apoyo brindado por la empresa OCEANFARM SA. (Manta, Manabí) al facilitar sus instalaciones en Manta, Manabí, para las actividades de reproducción y cultivo larvario. Finalmente es importante resaltar la colaboración de la empresa peruana Incabiotec SAC, aliado estratégico de Concepto Azul, que participó activamente en el desarrollo del presente proyecto por compartir su experiencia y conocimientos en producción de semilla de concha prieta en laboratorio, trabajos de diagnóstico molecular de enfermedades y de evaluación de la diversidad genética desarrolladas en Perú (Proyecto FINCyT P )(CEBAP/Tumbes Silvestres/HIVOS-Puerto Pizarro). Referencias bibliográficas CRUZ, R.A. Algunos aspectos de la reproducción en Anadara tuberculosa (Pelecypoda: Arcidae) de Punta Morales, Puntarenas, Costa Rica. Revista de Biología Tropical. 1984, vol 32, p

26 23 DIRINGER, B.; VASQUEZ, R.; MORENO, V.; PRETELL, K.; SAHUQUET, M. "Peru project studies blood cockles for stock enhancement, aquaculture production". Global Alliance Aquaculture. 2012, vol 07-08, p GALDAMEZ-CASTILLO, A.M.; PACHECO-REYES,S.P.; PEREZ GARCIA,I.M.; KINO,S. Guía para la Producción de Anadara spp Produccion artificial de semillas, cultivo intermedio y cultivo de Anadara tuberculosa y A. grandis. Centro de Desarrollo de la Pesca y Acuicultura (CENDEPESCA), Ministerio de Agricultura y Ganadería, San Salvador, Republica de El Salvador p. HELM, M. M.; BOURNE, N.; LOVATELLI, A. Cultivo de bivalvos en criadero: Un manual práctico. Italy, Roma: Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO Documento Técnico de Pesca, N 471, 182 p. MACKENZIE, C. L. "The fisheries for mangrove cockles, Anadara spp., from Mexico to Peru, with descriptions of their habitats and biology, the fishermen's lives, and the effects of shrimp farming". Marine Fisheries Review. 2001, vol 63, núm. 1, p MALCA, C.; POMA, C.; LIP, G. Estimación poblacional de crustáceos y moluscos de importancia económica en el ecosistema manglar de Tumbes. Proyecto Manglares: Manejo y uso integral de los manglares de la costa norte del Perú. Universidad Nacional de Tumbes, Dirección Subregional de Pesquería, ProNaturaleza. 1996, 34 pp. MENDOZA, O.; PERALTA, T. "Biología reproductiva de Anadara tuberculosa". Rev.Manglar. 2007, vol 5, núm. 1, p MORA, E.; MORENO, J. "La pesquería del recurso concha (Anadara tuberculosa y A. similis) en la costa ecuatoriana durante el 2004". Boletín Científico y Técnico. 2009, vol 20, núm. 1, p MORA, E.; MORENO, J.; FLORES, L.; GILBERT, G. "La pesquería de la concha prieta (Anadara tuberculosa y Anadara similis) en los principales puertos de desembarque de Ecuador en el 2011". Boletín Científico y Técnico. 2012, vol 22, núm. 3, p ROBLES-MUNGARAY, M.; REYNOSO-GRANADOS, T.; MONSALVO-SPENCER, P. Cultivo larvario de pata de mula Anadara tuberculosa en Baja California Sur, México. En: resúmenes del VII Congreso de la AIMAC y Ier Simposio Internacional sobre el Mar de Cortés de Mayo; Hermosillo, Sonora, México SUBSECRETARIA DE ACUACULTURA. MAGAP siembra ostra del Pacífico en Santa Elena. [En línea] Boletín N 038/VAP. Subsecretaria de Acuacultura, Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca, República del Ecuador. [Ref. de 06 de Diciembre 2014]. Disponible en Web: < VASQUEZ, H. E.; PACHECO-REYES, S. P.; PEREZ-GARCIA, I. M.; CORNEJO-HERNANDEZ, N. E.; CORDOVA- NAVAS, M. F.; KAN, K. Producción artificial de semilla y cultivo de engorde de moluscos bivalvos. Centro de Desarrollo de la Pesca y la Acuicultura (CENDEPESCA), Republica de El Salvador y Agencia de Cooperación Internacional del Japón (JICA), 2009, 25 p.