ENZIMAS. Enzima Requerimientos Actividad Ejemplos. Endonucleasa de. dsdna. ATP dependiente ATP. La misma proteína BSA
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- César Revuelta Valdéz
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1 Endnucleasas Tip I ENZIMAS Enzima Requerimients Actividad Ejempls Endnucleasa ds. AT pendiente AT La misma prteína BSA tiene actividad Incubación a metilasa La enzima crta el y queda unida al mism. Sitis recncimient palindrómics n Endnucleasas Tip II Endnucleasas Tip III Sistemas pendientes mrr Sistemas pendientes mcra Sistemas BSA Incubación a AT BSA Incubación a BSA Incubación a BSA Incubación a Endnucleasa ds N sn AT pendientes La actividad clivaje y metilasa están separadas Sitis recncimient 4-6 pb palindrómics Dejan extrems rms, 5 extendids, extendids. Endnucleasa ds. AT pendiente La misma prteína tiene actividad metilasa La enzima crta el y n queda unida al mism Sitis recncimient palindrómics n Recnce y digiere ds sitis cnteniend metilación en la m6 psición A. Recnce y digiere ds sitis cnteniend metilación en la m5 psición CG. 1
2 pendientes mcrb Hming Endnucleasas dam dcm mecri Exnucleasa I Exnucleasa III BSA Incubación a BSA Incubación a KCl, DTT, EDTA) BSA S-ansilmetinina Incubación a KCl, DTT, EDTA) BSA S-ansilmetinina Incubación a KCl, DTT, EDTA) BSA S-ansilmetinina Incubación a (Glicina-KOH, MgClB2B, β-mercaptetanl) (Tris-HCl, MgClB2B,) Recnce y digiere ds sitis cnteniend metilación en la m5 psición u C Endnucleasa ds. Sitis recncimient largs (12-40 pb), asimétrics. Secuencias cdificantes ntr intrnes (llevan prefij I-) inteínas (llevan el prefij I-). Intrduce grups metil en ds en 6 la psición N la Anina si encuentra la secuencia GATC. Inhibe el crte endnucleasas que recncen ese siti. Intrduce grups metil en ds en 5 la psición C la Citcina interna si encuentra la secuencia CCAGG CCTGG. Cataliza la transferencia un grup Metil una s-ansilmetinina (sam) a una las aninas la secuencia recncimient EcRI (GAA TTC) Cataliza la remción nucleótids ss en la dirección a 5. Cataliza la remción nucleótids un hidrxil terminal un ds. Dirección a 5. Digestión y mape genmas grans. Blquea y prtege la acción algunas enzimas. restricción que recncen GATC, Ej: MbI (GATC) es sensible, sin embarg Sau3AI (GATC) n es sensible a dam metilación. Blquea y prtege la acción algunas enzimas. restricción que recncen CCAGG CCTGG. Blquea el siti recncimient EcRI Estudi regines pr lecines cntrladas. 2
3 Exnucleasa Lambda Exnucleasa T7 Ls sustrats acuads sn ds cn extrems rms 5 extendids. La enzima n es activa en ds cn extrems extendids. Cataliza la remción mnnucleótids 5 un ds Dirección 5 a. Ls sustrats (Glicina-KOH, MgClB2B,) BSA (KAc,Tris-Ac, MgAc, DTT) acuads sn ds 5 fsfrilads, aunque grada a menr tasa ss y sustrats n fdfrilads. N inicia digestión en nicks gaps. Cataliza la remción mnnucleótids 5 un ds. Dirección 5 a. Degrada tant extrems 5 fsfrilads cm n fsfrilads. También grada RNA y un híbrid RNA/, per n actúa sbre dsrna y ssrna. Inicia digestión en nicks gaps. Exnucleasa VII Nucleasa Mung Bean Nucleasa 31 BAL- (Kfsfat, EDTA, β- mercaptetanl) (NaAc, NaCl, ZnSOB4B) Incubación a 30ºC (CaClB2B, NaCl, MgClB2B, Tris-HCl, EDTA) Incubación a 30ºC Degrada sd tant un extrem cm 5. Es activa en presencia EDTA. Degrada extrems simple hebra mléculas ds, dsrna /RNA, jándls rms Dirección a 5. Degrada extrems y 5 un ds Es activa en nicks, gaps y regines simple hebra un duplex RNA. Reparación extrems extendids Mape estructuras secundarias Mape siti restricción en 3
4 Nucleasa SI Dnasa I Dnasa RQ1 Ribnucleasa H Ribnucleasa T1 Ribnucleasa T2 Ribnucleasa A (NaCl, ZnClB2B, Tris-HCl) (NaAc, MgClB2B, Tris-HCl, KCl) Incubación a 25ºC (HEES, KCl, CaClB2B, MgClB2B) (HEES-KOH, KCl, DTT) (Tris-HCl, EDTA) (NaAc, EDTA) (sin mayres requerimients) Degrada ss y ssrna en frma endnucleasa generand prducts cn extrems 5 fsfrilads. ds, dsrna y /RNA sn resistentes a la enzima, salv a cncentracines extremadamente altas ésta. Degrada ds y ss a ligxiribnucleó tids. A bajas cncentracines enzima y tiemps reacción crts, intrduce nicks en ds. Degrada sd y ds generand ligs cn OH-. Se suministra libre Rnasas Endrribnucleasa que hidrliza ls enlaces fsfdiester un RNA hibridad a un, generand prducts cn OH y -5. N grada SSRNA, ds dsrna Endrribnucleasa que hidrliza ssrna en la psición residus G. Endrribnucleasa n específica que hidrliza ssrna, en preferencia en la psición residus A. De rigen pancreática, cataliza la splimerización ssrna, hidrlizand específicamente en la psición una pirimidina (U C). N hidrliza Reparación extrems Analizar estructura hibrids :RNA Remción l lp generad durante la síntesis segunda acna c Nick translatin sa Ftprinting Generación c, utilizada lueg la extracción l RNA Generación c Generación c Rnasa rtección Generación c Rnasa rtección Degradación RNA en extracción y purificación ADN 4
5 Rnasin Fsfatasa Alcalina Bacteriana (HEES-KOH, KCl, DTT) (Tris-HCl) γ-32- AT Incubación a 65ºC Inhibe RNAsas eucaritas (A, B, C) y RNAsa placentaria N inhibe RNAsa H, Nucleasa SI, RNA plimerasas (T7, Sp6, T3), transcriptasas reversas (AMV, M- MLV) Se suministra libre sas y RNAsas. Remueve fsfats y 5 y RNA. Utilizad enla generación c Bajar el backgrund previniend la religación (mayr actividad y mas estable) Fsfatasa Alcalina Intestinal T4 linucleótid Quinasa pl I - hlenzima (E.cli) Klenw l T4 l (dietanlamina, 4- nitrfenil fsfat, MgClB2B) Incubación a 65ºC Mg Mn ph óptim 7.4 Agente reductr Cm sustrat ss ssrna (OH-libre) sbre hebra Mg Mn ph óptim 7.4 (buffer fsfat) Agente reductr Cm sustrat ss ssrna (OH-libre) sbre hebra Mg ph óptim 8-9 Agente reductr Remueve fsfats y 5 y RNA (Tris-HCl, KCl, MgClB2B, β-mercaptetanl) γ-32- AT Cataliza la transferencia l γ- fsfat l extrem 5 un RNA a un AD, incrprand un nuev fsfat sacad un AT. Utilizada para marcar fragments ácids nucleics γ-32- cn AT plimerasa 5 - Ex 5 - (ds) Ex - 5 (ss, ds) RNAsa H plimerasa 5 - Ex - 5 (ss, ds) plimerasa 5 - Ex - 5 (ss, Bajar el backgrund previniend la religación Marcad extrems para snda para secuenciación. Fsfrilar linkers sintétics que carecen l fsfat 5 Nick Translatin Marcad mleculas cn extrems extendids rimers extensin Generación extrems rms Marcad extrems recesivs Generación sndas Generación sndas pr nicktranslatin 5
6 T7 pl (sequenace) Taq pl RNA pendiente pl ( transcriptasa reversa) MMLV AMV pendiente RNA pl (S6, T3, T7) Transferasa Terminal Ligasa T4 Cm sustrat ss (OH-libre) sbre hebra Mg Mn ph óptim Agente reductr Cm sustrat ss (OH-libre) sbre hebra Mg Mn ph óptim 8.3 a temp ambiente. Actividad óptima a C Cm sustrat ss (OH-libre) sbre hebra Mg ph óptim 7.6 (MMLV) ph óptim 8.3 (AMV) Agente reductr Cm sustrat ss ssrna (OH-libre) sbre hebra RNA Mg rnt Secuncia prmtra Sutrat: ds Mg Mn dnt Sustrat: ss cn extrem OH- libre. ds cn extrems blunt recesivs sirven cm sustrat en presencia C cm cfactr Mg AT (cfactr) Substart: ds cn extrems cmpatibles Blunt. Un ls extrems be ser OH- y el tr 5 - ds) Generación c cn primers al azar plimerasa 5 - plimerasa 5 - plimerasa 5 - RNAsa H RNA plimerasa 5 - limerización ss a partir un extrem OH-libre Cataliza la frmación un enlace fsfdiester entre -OH y un 5 - en ls extrems nicks Secuenciación Amplificación un fragment ara generar plasmids acuads para prducts CR Generar c Transcripción in vitr Run ff Sndas Rna Utilizadas en sistemas expresión Determinación extrems Rna. ara generar plasmids acuads para prducts CR Generar extrems cmpatibles Unir fragments dble cana. Ejempl: lasmid /gen Reparar nicks 6
7 Ligasa E. cli RNA Ligasa T4 Mg AT (cfactr) Substart: ds cn extrems cmpatibles. Un ls extrems be ser OH- y el tr 5 - AT ( cfactr) Sustrat: ss ssrna Cataliza la frmación un enlace fsfdiester entre -OH y un 5 - en ls extrems nicks Cataliza la unión cvalente un 5 - ss ssrna cn un -OH ss ssrna Unir fragments dble cana (menr eficiencia en extrems blunt) Ejempl: lasmid /gen Reparar nicks Circularizar Mlecula RNa. Ligación Adapters Determinar extrems RNa. 7
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