Grado en Química. 1 er Curso BIOLOGIA. Manual de Prácticas

Transcripción

1 Grado en Química 1 er Curso BIOLOGIA Manual de Prácticas

2 - NORMAS DE SEGURIDAD Antes de realizar las prácticas de laboratorio, todos los alumnos deben de leer el documento "NORMAS XERAIS DE SEGURIDADE NOS LABORATORIOS DE PRÁCTICAS" elaborado por el Servicio de Prevención de Riscos de la USC y que puede encontrarse en la siguiente dirección web del "taboleiro" del Grado en Química: scargas/20_normas_xerais_de_seguridade_nos_laboratorios _de_prxcticas.pdf 2

3 PRACTICA 1: Biomoléculas en 3D Objetivos: Mediante el desarrollo de esta práctica pretendemos que el alumno adquiera una mejor apreciación de las características estrucuturales básicas de proteínas y polinucleótidos, lo que ayudará enormemente a la comprensión del resto de la asignatura. Introducción: En ordenadores del aula de informática manejaremos un programa de gestión de archivos PDB (Protein DataBank) que nos permitirá observar macromoléculas en 3D, rotarlas en el espacio y variar los ángulos de giro de sus enlaces, etc. Procedimiento experimental: Utilizaremos el programa "Swiss-PdbViewer DeepView" con el que, a partir de archivos de texto, construiremos fragmentos de proteínas a las que dotaremos de características de hélice alfa, o bien de cadena beta. Al rotarlas en el espacio observaremos las diferencias que existen entre ambos tipos de estructuras. Se explorarán también las diferentes formas de representación de proteínas: cartoons, trazas del C-alfa, o añadiendo volumen molecular. Mediante estas representaciones determinaremos la importancia que tiene la estructura primaria de una proteína sobre la forma final de una proteína, así como sobre la distribución superficial de cargas. A continuación accederemos a la página web del Protein Databank, depósito de los archivos PDB con las coordenadas de todas aquellas macromoléculas cuya estructura tridimensional ha sido resuelta. Desde allí descargaremos archivos con los datos que nos permitirán reproducir las siguientes moléculas: - La proteína GFP: Nos servirá para comprender la complejidad real de la estructura de una proteína. - Un fragmento de DNA: observaremos la disposición de los monómeros, los enlaces entre ellos, etc. - Un trna: nos servirá de ejemplo de molécula de RNA. Observaremos cómo la ausencia de una segunda cadena provoca su plegamiento en solución dictado por su secuencia de bases. Material necesario para realizar la práctica: Esta práctica se realizará en los ordenadores de las aulas de informática. Los alumnos deben llevar algún dispositivo de almacenamiento de información (Pendrive o similar) para almacenar las imágenes generadas durante la práctica. Cuestionario final: Con las imágenes obtenidas, los alumnos elaborarán una memoria que deberán entregar al profesor en formato digital, dos semanas después de haber realizado la práctica. La memoria debe incluir los siguientes datos: - Localización de los extremos N y C-terminal de la proteína creada - Localización de enlace peptídico - Imágenes de estructuras de cadena beta y hélice alfa - Comparación de estructuras de las 2 proteínas problema con idéntica composición pero diferente secuencia aminoacídica: comparar superficie molecular y distribución de cargas - Imágenes de las diferentes macromoléculas descargadas del Protein Databank. 3

4 PRACTICA 2: Células Procariotas: Lisis celular y Análisis de DNA Objetivos: - Aprender las técnicas básicas del manejo y cultivo de bacterias en el laboratorio. - Conocer técnicas básicas de análisis de DNA. Introducción: Las bacterias son organismos procariotas de pequeño tamaño y de rápido crecimiento que, por lo general, no tienen muchos requerimientos para su cultivo. Los medios de cultivo bacterianos son muy simples y baratos. Para trabajar con cultivos bacterianos, basta el ambiente estéril generado por un mechero de alcohol. Procedimiento experimental: TODO EL MATERIAL QUE ENTRE EN CONTACTO CON LOS CULTIVOS BACTERIANOS, DEBERÁ TIRARSE A UN CONTENEDOR ESPECIAL Lisis de células bacterianas En primer lugar, romperemos las células bacterianas para liberar su contenido. Al poseer pared celular, es necesario usar un tampón de lisis fuerte, con un ph alto y un detergente iónico. 1. Introducir un palillo y mezclar para resuspender el cultivo bacteriano. 2. Añadir 250 μl de Tampón B con la micropipeta de 1 ml para lisar las bacterias. Cerrar la tapa y mezclar por inversión. Abrir la tapa y comprobar la consistencia con un palillo. Hay alguna diferencia entre los tubos? A qué se debe? 3. Con la micropipeta de 200 ul pasar 50 ul a un tubo eppendorf limpio y etiquetado con el nombre del grupo: esta muestra se analizará mediante electroforesis. Al resto del lisado, añadir 250 μl de acetato potásico 3M ph 5.5. Cerrar el tubo y mezclar por inversión. Qué sucede? Ha cambiado la consistencia del sobrenadante? A qué crees que se debe? 2.2 Electroforesis de DNA en geles de agarosa. Para separar las moléculas de DNA se pueden utilizar geles de agarosa. La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se mantiene líquido. De esta manera se puede preparar una matriz disolviéndolo en un tampón adecuado y dejándolo solidificar en un molde. En unos pocillos del gel se introducirá la muestra mezclada con tampón de carga, una solución densa y coloreada que ayuda a que la muestra vaya al fondo del pocillo y permite ver el progreso de la separación gracias a sus colorantes. Al hacer pasar una corriente a través del gel, los ácidos nucleicos, que tienen carga negativa por los grupos fosfato, se verán atraídos hacia el polo positivo (ánodo). En función del tamaño atravesarán con mayor o menor facilidad la malla formada por la agarosa y de esa manera se pueden separar por su tamaño. Para detectar el DNA, al gel se le ha añadido bromuro de etidio ( tóxico!), una molécula que se intercala en el DNA y emite fluorescencia al exponerlo a la luz UV. 4

5 1. Añadir al tubo eppendorf que contiene la muestra de DNA, 10 μl de tampón de carga 6x. Mezclar con el vórtex y microfugar brevemente. 2. Cargar las muestras en los pocillos del gel de agarosa (ya preparado). 3. Poner la tapa de la cubeta y conectarlo a la fuente de alimentación. Dejarlo 20 minutos a 120 V. 4. Desconectar la fuente de alimentación. Llevar al transiluminador. 2.3 Aislamiento de colonias bacterianas En ocasiones es necesario separar bacterias individuales de un cultivo. Esto se realiza cuando tenemos una muestra que contiene varios tipos de bacterias (como ocurre con muestras ambientales, o de fluidos corporales) y queremos separarlas para su identificación, o cuando queremos separar clones concretos de células para algún experimento (obtener plásmidos, etc.). El método que usaremos se denomina siembra en estría por agotamiento, que nos permite obtener colonias individuales. Una colonia es una agrupación de bacterias visible a simple vista que se origina por la división de una sola bacteria inicial. 1. Esterilizar el asa de sembrar calentándola en la llama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar unos segundos o tocar la superficie del agar para enfriarla, e introducir en el cultivo de E. coli previamente agitado. 2. Deslizar el asa por la placa siguiendo un patrón similar al que se indica en la figura, intentando no romper el agar. Entre cada paso del asa por la placa hay que esterilizar de nuevo el asa calentándola en la llama. De esta manera nos aseguramos de no llevar demasiadas bacterias a la siguiente estría. 3. Dejar las placas en el incubador a 37º durante horas, hasta que se vean las colonias. Se guardarán a 4ºC hasta el seminario de cada grupo. 5

6 Material necesario para realizar la práctica: Los alumnos deben acudir al laboratorio de prácticas con bata y gafas protectoras. Material adicional: Un tubo de eppendorf con un cultivo líquido de E. coli - Tampón B: 0.2N NaOH, 1% SDS. - Acetato Potásico 3M ph Micropipetas automáticas de 1 ml y de 200 ul - Palillos - Guantes de látex - Placas de LB-agar - Etanol al 70% Gel de agarosa - Cubeta de electroforesis - Fuente de alimentación - Transiluminador - Tampón TAE - Tampón de carga 6x - Micropipetas automáticas de 20 μl 2.3: - Cultivo de E. coli - Placas de LB-agar - Asas de siembra - Mecheros Cuestionario final: 1- Compara la consistencia entre las bacterias sin lisar y después de lisar. Qué diferencia hay? A qué se debe? 2- Tras añadir el acetato, qué ocurre? ha cambiado la viscosidad del sobrenadante? por qué? 6

7 2.3 Haz un dibujo del crecimiento bacteriano de tu placa. Conseguiste aislar alguna colonia bacteriana? Señala alguna de ellas Para qué se usa el tampón de carga en la electroforesis de geles de agarosa? 7

8 PRACTICA 3: Microscopio y mitosis Objetivos: - Aprender el manejo del microscopio óptico. - Identificar las estructuras básicas de las células y diferenciar distintos tipos celulares. - Identificar las fases de la mitosis. Introducción: 1- El microscopio óptico compuesto PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO Sistema óptico o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo. o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta. o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. Sistema mecánico o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación. o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular. o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto. MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. 2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición). 4. Para realizar el enfoque: 1. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el 8

9 objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. 2. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión. 6. Empleo del objetivo de inmersión: NO SE UTILIZARÁ EN ESTA PRÁCTICA Bajar totalmente la platina. a. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. b. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40. c. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. d. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. e. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. f. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. g. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3. h. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. i. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica. 3. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio. 4. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador). 5. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular. 9

10 Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. 2- Estudio de la división nuclear Cuando una célula se divide, su núcleo se divide asimismo en dos, según distintas modalidades que varían según los diversos organismos; la división más frecuente tiene lugar mediante un proceso muy preciso denominado cariocinesis o mitosis. En esta práctica se pretende confeccionar preparaciones temporales de tejidos vegetales en los que se encuentren células en división, así como su observación e interpretación al microscopio. Para poder observar las distintas fases mitóticas conviene utilizar un material en crecimiento, en el cual habrá muchas células en división y se podrá observar alguna en cada una de las fases de la mitosis. De ahí que sean especialmente indicados por su facilidad de manejo y observación los meristemos terminales de las raíces en crecimiento. En esta práctica se utilizarán raíces de bulbos de cebolla puestas a brotar en agua con 4 ó 5 días de antelación. Procedimiento experimental: 1. Con ayuda de un bisturí, cortar una porción de 3-4 mm del extremo apical de la raíz y depositarla en el vidrio de reloj. Es importante coger una raíz que no haya sido cortada previamente. 2. Añadir sobre la porción de raíz unas 3-4 gotas de la solución de orceína y dejar actuar durante 10 minutos. Es importante que la raíz no se quede seca durante el proceso. 3. Tomar el vidrio de reloj por los bordes, con ayuda de la pinza de madera y calentarlo suavemente a la llama del mechero, evitando la ebullición. (Pasándolo 5-6 veces por la llama es suficiente.) 4. Una vez que la preparación se ha enfriado, colocar la raíz sobre un portaobjetos, y cortarla por la mitad a lo largo. 5. Colocar el cubre-objetos y encima una almohadilla hecha con papel de filtro sobre la que se ejerce presión con el dedo pulgar, primero suave, después más intensa, para aplastar la muestra, técnica conocida como squash. Hay que procurar que la superficie de la mesa sobre la que se realiza la operación sea lisa con el fin de no romper la preparación. 6. Aspirar con el papel de filtro el exceso de colorante. Observación La preparación presenta el aspecto de una dispersión de células por todo el campo que abarca el microscopio. Se observarán células en distintas fases o estados de división celular. Con esta técnica de tinción se ven los cromosomas impregnados por la orceína en color morado. El aspecto reticulado, así como el mayor tamaño de algunos núcleos, corresponde a las células que se encontraban en los procesos iniciales de la división mitótica. Enfocar en primer lugar con el objetivo de menor aumento con el que se observan tres tipos de células: A) Células pequeñas generalmente dispuestas en filas y coloreadas de rosa, conteniendo un citoplasma denso y un núcleo relativamente voluminoso. Son células meristemáticas (no diferenciadas) que se dividen de forma activa. B) Células más alargadas con núcleo bien teñido y en reposo. Son células ya diferenciadas. C) Células de forma ovoide cuyo núcleo está asismismo fuertemente coloreado y en reposo. Son las células de la cofia (extremo de la raíz). Centrar la preparación sobre las células meristemáticas y pasar al objetivo de mayor aumento para poder diferenciar las fases de la mitosis. 10

11 La mitosis comprende cuatro fases principales: profase, (pro)metafase, anafase y telofase. La célula en estado de reposo (interfase) presenta un núcleo en el que la cromatina es poco coloreable y se encuentra en estado casi difuso. Material necesario para realizar la práctica: Microscopio Porta y cubre-objetos Vidrio de reloj Pinzas finas Cuchilla de afeitar Tiras de papel de filtro un bulbo de cebolla Pinzas de madera Mechero Orceína acética clorhídrica : Orceína...2 g Ácido acético...45,8 ml HCl 1 mol/l...8,3 ml Agua...45,8 ml Cuestionario final: 1. Haz un dibujo de los tipos celulares (meristemáticas, alargadas, ovoides) que se observan en la preparación y explica las diferencias entre ellos. 2. Dibuja células que estén en las distintas fases: interfase, profase, (pro)metafase, anafase y telofase, señalando en el dibujo cuáles son las características de cada una de ellas. 11