GUÍA BÁSICA PARA LA CAPTURA SEMIAUTOMÁTICA DE REGIONES DE INTERÉS (VIRTUAL SLICE) EN EL MICROSCOPIO CONFOCAL DE DISCO GIRATORIO OLYMPUS BX-51WI

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1 GUÍA BÁSICA PARA LA CAPTURA SEMIAUTOMÁTICA DE REGIONES DE INTERÉS (VIRTUAL SLICE) EN EL MICROSCOPIO CONFOCAL DE DISCO GIRATORIO OLYMPUS BX-51WI Miguel Tapia R. Unidad de Microscopía Instituto de Investigaciones Biomédicas Universidad Nacional Autónoma de México Fecha de elaboración: Noviembre de 2011

2 Esta guía describe la operación básica del microscopio Olympus BX51WI equipado con el módulo confocal de disco giratorio (Disk Scanning Unit; DSU) para observación y captura semiautomática de imágenes de alta calidad de células montadas en portaobjetos, cortes histológicos o estructuras, tanto en campo claro como con marcaje de hasta cuatro fluorocromos simultáneos. Este manual pretende iniciar al usuario en los principios básicos del uso del DSU así como del módulo de captura de imágenes Virtual Slice del software StereoInvestigator 9. Sin embargo, es recomendable que el usuario revise previamente literatura relacionada con el software StereoInvestigator. De igual manera, si se requiere información más precisa que no se incluya en la guía, se podrá solicitar asistencia a los responsables técnico y académico de la Unidad para recibir asesoría individual. Contactos: Responsable Técnico: Miguel Tapia Rodríguez Cubículo C003, Planta Baja, Torre C. Sede Circuito Exterior. Tel. +(52) (55) mtapia@biomedicas.unam.mx Responsable Académico: Dra. Angélica Zepeda R. Cubículo C211, 2º piso, Torre C. Sede Circuito Exterior. Tel. +(52) (55) ext azepeda@biomedicas.unam.mx

3 SOFTWARE El software StereoInvestigator controla, -una vez encendidos los instrumentos- (ver sección correspondiente) la caja de mando de la platina motorizada (movimiento en X, Y y Z), las cámaras delantera o trasera, el revólver de filtros traseros así como el módulo DSU del microscopio. El software StereoInvestigator NO controla los revólveres ni de objetivos ni de filtros delanteros por lo que cuando su movimiento sea requerido será de forma manual. El software se puede operar empleando el mouse y el teclado de la computadora y esencialmente se utiliza de la misma manera en la que opera cualquier programa compatible con el ambiente Windows. MICROSCOPIO El microscopio DSU funciona utilizando una lámpara de mercurio; cuenta con 2 juegos de filtros, uno trasero y uno delantero para observar las muestras y tiene la platina y el revólver trasero motorizados. Además, tiene una cámara digital a color de alta resolución en la parte delantera y una cámara CCD de alta velocidad de captura en la parte trasera. Es importante recalcar en este punto que el módulo DSU funciona únicamente con el juego de filtros y cámara traseros, por lo que la confocalidad en este microscopio solo es posible si se utiliza dicha combinación. Camara delantera: MBF CX9000 cámara digital a color, resolución espacial de 1600 (H) x 1200 (V). Cámara trasera: Hamamatsu C9100 cámara EM-CCD, resolución temporal de 32 frames / seg., resolución espacial de 1024 (H) x 1024 (V). Filtros Delanteros: 1) Posición DSU. Permite el paso de la luz filtrada por el revolver de filtros traseros así como por el disco giratorio. 2) Filtro U-MWU2 (DAPI) Pase de banda de excitación: nm Espejo Dicróico: 400 Emisión: 420 nm 3) Filtro U-MGFPHQ (GFP, egfp) Pase de banda de excitación: nm Espejo Dicróico: 485 Emisión: nm 4) Filtro U-MRFPHQ (Rodamina, Alexa 555) Pase de banda de excitación: nm Espejo Dicroico: 565

4 Emisión: nm 5) Filtro U-N41008 (Cy5, Alexa 647) Pase de banda de excitación: nm Espejo Dicroico: 660 Emisión: nm Filtros Traseros: 1) Filtro 31000v2 (DAPI/Hoechst/AMCA) Pase de banda de excitación: 350/50 nm Espejo Dicroico: 400dclp Emisión: 460/50 nm 2) Filtro (FITC/Bodipy/Fluo3/DiO) Pase de banda de excitación: 480/40 nm Espejo Dicroico: Q505lp Emisión: 535/50 nm 3) Filtro (Texas Red) Pase de banda de excitación: 560/55 nm Espejo Dicroico: Q595lp Emisión: 645/75 nm 4) Filtro (Cy5, Alexa 647) Pase de banda de excitación: 620/60 nm Espejo Dicroico: Q660lp Emisión: 700/75 nm

5 ENCENDIDO DEL EQUIPO 1. Encender la estación de trabajo (conformada por el CPU y los dos monitores). 2. Encender el módulo IX2-UCB del microscopio (caja vertical blanca). 3. Encender la caja de control de la platina motorizada Lep (caja vertical gris claro). 4. Encender la cámara trasera (Hamamatsu, caja horizontal gris con crema) o la cámara delantera (MF CX9000, caja horizontal negra pequeña), dependiendo cual cámara vaya a ser utilizada. 5. Encender la lámpara de fluorescencia (ubicada encima del módulo IX2-UCB). 6. Revisar que el revólver de cubos frontales del microscopio esté situado en la posición 1, que los objetivos de 4X o 10X estén al frente del revólver y que el shutter de fluorescencia esté desbloqueado. En los monitores aparecerá la siguiente ventana: Como User name teclear Unidad. Como Password teclear dsu.123. Esto permitirá el ingreso al sistema operativo, así como la conexión automática a las unidades de red compartidas del Instituto (X para la Sede de Circuito Escolar; W para la Sede de Circuito Exterior). Es altamente recomendable el uso de las unidades de red para el traslado de los archivos capturados en la estación de trabajo del microscopio DSU. Si tuviera alguna duda de cómo ingresar en su laboratorio a dichas unidades, favor de contactar a la Unidad de Cómputo del Instituto.

6 Vista del Monitor 1 7. Haga doble click en el ícono Stereo Investigator para iniciar el software que opera el DSU. Aparecerá la siguiente ventana: 8. Si requiere realizar capturas en campo claro o de fluorescencia con confocalidad, seleccionar como Profile Confocal Back Camera y luego dar click en OK. Si requiere capturas de tinciones histológicas en campo claro o marcajes con un solo fluorocromo, puede seleccionar como Profile Front Camera o Confocal Back Camera Esta acción abrirá la ventana principal del programa. En la presente guía se mostrarán imágenes en campo claro capturadas con el perfil Confocal Back Camera.

7 Aumento seleccionado Device Command Sequence Barra de marcadores Monitor 1 Image Organizer Serial Section Manager Tool Panel 1 Macro View Herramienta Z Monitor 2

8 9. El primer paso es observar directamente en el microscopio el espécimen a una magnificación óptica que nos permita trazar el contorno de la región de interés. Para esto, revisar en cualquier posición del revolver delantero de filtros (con excepción de la posición 1, DSU) y usar el joystick que controla la platina motorizada para llegar al corte o región de interés en el portaobjetos. Comúnmente se recomienda usar 10X pero si la región de interés se puede observar a 4X se podrá realizar el trazado a esa magnificación. En el software, activar la opción de Live Image y cambiar el aumento a 4X o a 10X, según se seleccionó en el microscopio. La imagen comenzará a observarse en pantalla. Live Image activado Monitor 1. Corte de bulbo olfatorio visto en campo claro. Si hay que hacer ajuste de imagen, utilizar las herramientas del Tool Panel 1 A continuación se describe brevemente cada herramienta. Si requiere información técnica más detallada, favor de referirse al manual de StereoInvestigator disponible para consulta en las instalaciones de la unidad.

9 Image Adquisition. En este panel se puede activar la imagen en vivo en el monitor, así como la adquisición de una imagen de lo que se observa en la pantalla, de acuerdo con lo que está activado en el panel Multichannel Control. Camera Settings. En este panel se pueden ajustar de manera manual los parámetros de exposición y de sensibilidad de la cámara. No se recomienda que se deje que la cámara detecte de manera automática el nivel de exposición Multichannel Control.. Este panel es similar a la ventana del Device Command Sequence ; se puede seleccionar cualquier fluorocromo de la lista y el revolver trasero de cubos de fluorescencia se moverá automáticamente a dicho filtro. Brightfield permitirá el paso de luz blanca a la cámara y Close shutter impedirá el paso de la fluorescencia al espécimen. Video Histogram. Para la mayoría de los casos, Optimize ajusta de manera autómatica el histograma de video a niveles aceptables; si se requiere una mayor definición se puede utilizar la opción de Clip Detect para realizar el ajuste de imagen de modo manual.

10 10. Una vez optimizada la imagen, lo siguiente es establecer lo que se conoce como Punto de Referencia. Para esto, se requiere únicamente dar un click izquierdo sobre alguna región o elemento estratégico de la región de interés. De manera automática, aparecerá en pantalla un rectángulo blanco que delimitará la zona de Automove y el joystick perderá el libre movimiento. Zona de Automove Punto de Referencia 11. Seleccionar los contornos a utilizar. Diversos contornos pueden ser trazados con líneas de diferente color para delimitar regiones distintas. Para realizar el trazado, seleccionar el color que se desee utilizar para delimitar el contorno de la región de interés en el menú de contornos, posicionandose en el color de elección y dando click izquierdo. Con el mouse, posicionarse en el borde de la región de interés y dar click izquierdo. Seguir dando click izquierdo cada cierta distancia para ir generando un trazo. Dando click fuera de la región de Automove la platina motorizada se moverá automáticamente hacia el siguiente campo visual adyacente. Continuar trazando con el mouse todo el borde de la región de interés. Cuando esté por finalizar el contorno, dar click izquierdo en el icono Close contour localizado en la barra de herramientas, o click derecho en cualquier región y seleccionar Close contour de las opciones disponibles; esto finalizará el trazado de la región de interés. Para generar varios contornos, seleccionar un color diferente para cada región de interés como se explicó arriba.

11 Ejemplo de un contorno trazado en color turquesa de un corte coronal de bulbo olfatorio. Contorno trazado

12 12. Seleccionar una magnificación conveniente para realizar la captura automática, tanto en el microscopio como en el software. A mayor aumento, mayor resolución, sin embargo, la captura tomará más tiempo. En el ejemplo siguiente se realizó la captura a 20X. Cambiar a la magnificación a la cual se hará la captura

13 13. En el menú Acquisition, seleccionar Acquire Virtual Slice Acquire Virtual Slice aparecerá el siguiente menú: Acquisition Options. Por default dejar activado Closed Contour Meander Scan (1). En este panel además se puede activar una captura multicanal si se cuenta con 2 o mas fluorocromos en la muestra (2). De igual manera se puede configurar el tiempo de retardo entre dos capturas consecutivas (3) y el sobrelape en pixeles entre imágenes adyacentes (4). Tanto Image Acquisition Delay como Pixel Trim from each image realizan cambios sutiles en la adquisición, por lo que se recomienda dejar sus valores sin modificación.. Create Virtual Slice File (5) crea un archivo separado para la generación de la imagen panorámica y que solo puede leer StereoInvestigator, por lo que se recomienda que esté inactivo. 6 Estas opciones permiten realizar empalme por tonos (6) o crear difuminación en los bordes de imágenes 7 adyacentes (7); de igual manera, existe la opción de ajustar el foco de la imagen a capturar de manera manual (8), para cada sitio de captura o por intervalos. En la práctica, se recomienda que Seam Alignement y Seam Blending estén 8 inactivos, y sólo se recomienda ajustar el foco de manera manual a intervalos de 1 o 3 sitios adyacentes (dependiendo del grosor del corte) cuando se realicen capturas de 20X y 40X.

14 14. Una vez seleccionadas las opciones deseadas dar click izquierdo en OK. Enseguida aparecerá el contorno trazado con una gradilla que indica los campos de captura automática: 15. Dar click derecho en cualquier parte de la gradilla. Aparecerá el siguiente menú: seleccionar Start Virtual Slice Scan at the Current Z. Esto iniciará la captura automática de todo lo que esté dentro del contorno. En el caso de muestras con dos o más fluorocromos, la captura la realizará alternando los canales para cada campo.

15 16. Una vez finalizada la captura, el programa mostrará el resultado de la misma: Display Images and Image Stacks se activará De igual manera, se puede utilizar el Macro View (ver inciso 8, Fig. Monitor 2) para navegar por la captura (click derecho sobre el trazo, seleccionar Go To y dar click izquierdo sobre la región de interés.

16 En el panel Image Organizer, aparecerá una miniatura de la captura realizada, y nos indicará que no ha sido guardada aún. Botón Save, para guardar la captura. 17. Para guardar la imagen recién capturada, dar click izquierdo en el ícono de diskette ubicado en la parte inferior del panel Image Organizer.

17 18. A continuación aparecerá el siguiente menú, donde se tendrá que indicar la carpeta donde se quiere guardar la captura realizada. En el tipo de imagen, seleccionar Tiff file (*.tif,*.tiff) para que no se pierda resolución de la captura y pueda ser abierta posteriormente en cualquier programa de edición de imágenes. De igual manera, indicar el nombre con el que se desea guardar la captura realizada.

18 19. Si se desea capturar una nueva Virtual Slice, se requerirá repetir los pasos anteriores. Para iniciar un nuevo trazo, dar click izquierdo en New, situado en la parte superior izquierda de la barra de menú. Botón New aparecerá el siguiente mensaje: Dar click en No. Automáticamente el joystick quedará libre y se podrá realizar la búsqueda de la siguiente región de interés. Repetir los pasos 9 al 18 de la presente guía. 19. Si se han capturado todas las regiones de interés deseadas y se han salvado todas las imágenes, se puede cerrar el programa. Apagar los distintos componentes de la estación de trabajo, comenzado por la lámpara de fluorescencia (si fue utilizada), el módulo IX2- UCB, la caja de control de la platina motorizada, la cámara que fue utilizada, y la estación de trabajo.