TENTATIVAS DE CONTROL DE LA ENFERMEDAD ASOCIADA AL FITOPLASMA CAUSANTE DEL AMARILLAMIENTO DEL PARAISO Melia azedarach (L.)

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1 TENTATIVAS DE CONTROL DE LA ENFERMEDAD ASOCIADA AL FITOPLASMA CAUSANTE DEL AMARILLAMIENTO DEL PARAISO Melia azedarach (L.) Agostini, J.P.; Argüelles, T.; Eskiviski, E.R.; Dummel, D.M.;Callaba, R.E. Facultad de Ciencias Forestales. UNAM Eldorado. Misiones. TEL/Fax: Introduccción El paraíso, Melia azedarach, es una especie ampliamente utilizada en Argentina como ornamental y forestal. La importancia forestal del paraíso radica en la calidad de su madera, semejante a la de los cedros de la flora nativa de Misiones y a su corto turno de aprovechamiento, obteniéndose a los 12 a 14 años material con aptitudes tecnológicas que lo hacen apto para su comercialización(1,2) Se cultiva en Buenos Aires, Mendoza, Salta, Jujuy, Santiago del Estero, Chaco, Formosa, Corrientes y Misiones. Su rápido crecimiento y rusticidad han justificado su utilización(3,4). Entre los variados usos de su madera se menciona la elaboración de terciados, muebles, escritorios, machimbres, trabajos de ebanistería, puertas, ventanas, etc. Actualmente, el cultivo de esta especie presenta inconvenientes ya que se ha registrado una enfermedad denominada amarillamiento o declinamiento del paraíso, caracterizada particularmente por la clorosis internerval y progresiva del follaje, que en los estadios mas avanzados produce la muerte de la planta(5,6). El problema comenzó a manifestarse en Córdoba en 1979, en el paraíso sombrilla (Melia azedarach L. var. Umbraculifera) y se agravó en los años siguientes. Esto llevó a un grupo de investigadores a buscar el posible agente causal del amarillamiento. Como resultado, concluyeron que un organismo del tipo fitoplasma (MLO) está asociado a la enfermedad y que un insecto vector era el encargado de transmitirlo de una planta a otra.(3,7) 1

2 Esta enfermedad está ampliamente distribuida en Misiones y cabe mencionar que una enfermedad similar afecta a paraísos implantados en Paraguay, Brasil y China. En los últimos años, la enfermedad aumentó en nuestro país citándose zonas con hasta un 80% de plantas afectadas y más de un 30% de mortandad de las mismas (8,9,10). Este trabajo tiene como objetivo el control de la enfermedad mediante inyecciones en el tronco de los árboles enfermos con antibióticos del tipo de las tetraciclinas y la búsqueda de un marcador metabólico para el diagnóstico precoz de árboles asintomáticos de la enfermedad y así poder aplicar los antibióticos en una etapa incipiente de la enfermedad. Materiales y métodos Inyecciones en el tronco. Los árboles inyectados son individuos adultos del predio de la Facultad de Ciencias Forestales en Eldorado, y de plantaciones comerciales jóvenes de 2,5 años de edad de la zona de Garuhape ni del departamento de San Martín, ambos en Misiones. Se efectuaron orificios en el tronco de árboles adultos mediante un perforador manual (Fotografía n 2) a 20 cm de la base del tronco, en las que se introdujo el pico de una bomba hidráulica diseñada al efecto. Los detalles de la bomba pueden apreciarse en la fotografía n 3. Los antibióticos oxitetraciclina, agrimicina y roxitromicina se disolvieron en dimetilsulfoxido (DMSO), y a su vez esta solución se disolvió en agua. En cada uno de los árboles se inyectaron en una sola vez 70 ml de una solución compuesta por 2 gr del principio activo disuelto en 20 ml de DMSO y llevado a volumen con agua. Corrida electroforética. Se tomaron muestras de pecíolos de hojas de árboles aparentemente sanos y de. hojas de árboles con síntomas de la enfermedad, Las muestras fueron llevadas al laboratorio en conservadora. En el laboratorio una muestra de 5 gr de pecíolos finamente trozados se molió en mortero frío con 20 ml de buffer fosfato ph 6,5, adicionado de EDTA 5 mm para evitar la acción de las metalopeptidasas y DTT 8 mm, a fin de mantener las proteínas en su estado reducido. Se filtró la muestra por tejido y el filtrado se centrifugó a 5000 x g durante 20 minutos. Se separó el sobrenadante y las proteínas contenidas en él se precipitaron con tres volúmenes de acetona fría para eliminar los pigmentos y 2

3 concéntralas, se redisolvieron en tampón de muestra, y se mantuvieron durante 5 minutos en un baño de agua a 100 C, Veinte µl de esta solución se sembraron en los pocillos del gel de poliacrilamida. El tampón (2X) donde se disolvió la muestra se preparó con 1,51 g de Tris (0,012M); 20,0 ml de glicerol; 4,0 g de SDS; 10,0 ml de 2-mercaptoetanol y 0,002 g de azul de bromofenol ajustando el ph a 6,8 con HCl concentrado y añadiendo agua destilada hasta un volumen final de 100 ml. Se trabajó con un gel de 11% T, en el sistema discontinuo de Laemmly cuya preparación se consigna a continuación: Tampón del gel de resolución: 36,3 g de Tris (3M) en 100 ml de solución, llevado a ph 8,9 con HCl Tampón del gel de empacamiento: 5,98 g de Tris (0,5M) en 100 ml de solución, ajustado a ph 6,7 con HCl. Solución madre del gel de resolución: 28,0 g de acrilamida más 0,74 g de N N metilenbisacrilamida en 100 ml de agua. Solución madre del gel de empacamiento: 10,0 g de acrilamida más 2,5 g de N N metilenbisacrilamida en 100 ml de agua. Se trabajó con un equipo Mini Protean III de Bio Rad. Los geles se moldearon empleando el soporte provisto a tal efecto. Para preparar dos geles del Mini Protean III de 0,75 mm de espesor se tomaron las siguientes cantidades: A. Geles de resolución de 11% T 1,000 ml del tampón del gel de resolución 3,160 ml de la solución madre del gel de resolución 0,800 ml de una solución de sodio dodecil sulfato (SDS) al 1% 0,310 ml de persulfato de amonio al 1,7% 2,710 ml de agua destilada 18,4µL de TEMED B. Geles de empacamiento de 4% T: 0,350 ml del tampón del gel de empacamiento 0,860 ml de la solución madre del gel de empacamiento 0,237 ml de una solución de SDS al 1% 0,158 ml de persulfato de amonio al 1,7% 0,743 ml de agua destilada 3

4 10,85 µl de TEMED La electroforesis se desarrolló, en la cuba del equipo Mini Protean III, de Bio Rad con el tampón de los electrodos consistente en: Tris 50mM, glicina 348 mm, ph 8,3 y SDS 0,1% (p/v), voltaje constante de 110 V, y una duración promedio de corrida de 120 minutos. Terminada la corrida los geles se tiñeron con el colorante Azul Brillante R en solución metabólica. La solución contiene 0,25% (p/v) de Azul Brillante R-250; 40% (v/v) metanol y 7% ácido acético. A temperatura ambiente es necesario teñir durante toda la noche, sin embargo a 50 C el tiempo se acorta a 30 minutos tiñéndose el fondo muy fuertemente. Resultados y Discusión Se efectuó una sola inyección durante el mes de noviembre del Este último verano ha sido muy seco lo que no ha facilitado la observación de una mejoría. Los entrenudos cortos todavía se observan, sin embargo el follaje se mantiene verde, pero el amarillamiento de las hojas ha desaparecido. (Ver fotografía nº 1) Fotografía nº 1. Arbol de paraíso mostrando el síntoma típico de escoba de bruja Aunque las observaciones de los tratamientos por inyección no son concluyentes, la experiencia nos ha servido para ajustar la metodología, sobre todo en lo que se refiere a la 4

5 forma de suministrar los antibióticos. Esta nueva bomba nos permite introducir 120 ml de líquido en los árboles, en un mínimo de tiempo y con la seguridad que todo el líquido suministrado penetra mientras estamos inyectando (fotografías nºs 2 y 3) Fotografía nº 2. Se efectúa un orificio en el árbol para introducir el inyector de la bomba. Fotografía nº 3. Modo de manipulación de la bomba hidráulica para la inyección. En el laboratorio los resultados son. mas concluyentes. La concentración de proteína en los tejidos enfermos medida según el método de Bradford indica una concentración de proteínas tres veces superior en tejidos enfermos que en tejidos sanos. Los perfiles electroforéticos de las proteínas de pecíolos sanos y enfermos han mostrado una diferencia notable en el número y la intensidad de las bandas de proteínas (fotografía nº 4). La existencia de la banda que no aparece en las muestras sanas se ha repetido en todos los ensayos hasta ahora efectuados Si en la próxima primavera se 5

6 repite el mismo patrón proteínico, podremos contar con un marcador bioquímico de la infección. Fotografía nº 4 Calle A : Pecíolos sanos Calle B: Pecíolos enfermos Observar en la parte inferior de las calles, la proteína de pequeño peso molecular abundante en los pecíolos de plantas enfermas, y no existente en las sanas. A B Bibliografía 1. Administración Nacional de Bosques; Dirección de forestación y reforestación Cultivo del paraíso. Hojas de divulgación. Argentina. 2. Larguía, A Paraíso gigante, esencia forestal interesante para la provincia de Misiones. Asociación de Plantadores Forestales de Misiones. Boletín 6: Schwarz, R.E Inyección de micoplasmicidad e insecticidas en las plantas leñosas: posible método de control de las enfermedades asociadas a los micoplasmas y sus vectores. Boletín fitosanitario de la FAO. Volumen 22, nº Rey, L.A.; Asociación de plantadores forestales de Misiones Análisis y cuantificación de algunas variables referidas a las reforestaciones comerciales de paraíso (Melia azedarach L.). Boletín 9: Debona, C.A.R.; Junquera, J El amarillamiento de los paraísos y su causa. CYTA 26: 4 6. Argentina. 6. Vazquez, A. Duchase, D.; Nome S.; Muñoz, J Declinamiento del paraíso (Melia azedarach L.) síntomas y estudios etiológicos de esta nueva enfermedad. Revista de Investigaciones Agropecuarias. INTA. Bs.As. Vol.18 nº 2. 6

7 7. Vazquez, A. Duchase, D.; Nome S Transmisión del agente causal y determinación de dosis terapeúticas para el declinamiento del paraíso (Melia azedarach L.) VI Jornadas Fitosanitarias Argentinas. 8. Dalton, E.G Amarillamiento o declinamiento del paraíso (Melia azedarach L.) Informe INTA. Argentina. 9. Dalton, E.G.; Arroyo, L.; Muñoz, J Amarillamiento del paraíso (Melia azedarach L.) en la provincia de Misiones: estudio etiológico. Gaceta Agronómica. Vol 11, nº 60. INTA. 10. Agostini, J.P..; Artus, G.D Amarillamiento del paraíso: Manejo integrado de plantaciones. Informe FCF. Maestría en Ciencias Forestales. Misiones. 7