MICOLOGIA GUÍA DE PROCESAMIENTO DE MATERIALES CLÍNICOS

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1 1 MICOLOGIA GUÍA DE PROCESAMIENTO DE MATERIALES CLÍNICOS DOCENTES: ALICIA LUQUE MARISA BIASOLI MARÍA ELENA TOSELLO SUSANA AMIGOT SILVANA RAMADÁN LUCÍA BULACIO MAXIMILIANO SORTINO CARLOS GÓMEZ MIRTA TARTABINI HERNÁN DALMASO EDUARDO CODINO VIRGINIA PODESTÁ -AÑO 2015-

2 2 La realización de análisis micológicos comprende la obtención del material clínico y su procesamiento, su observación microscópica (a través de examen directo o coloración según corresponda), la siembra en los medios de cultivo, tiempo y temperaturas adecuados y la identificación del microorganismo (cuando los cultivos son positivos). En este capítulo se detallan los elementos necesarios para la realización de los análisis, las muestras clínicas más frecuentes, las normas de bioseguridad de trabajo en el laboratorio y finalmente la descripción del procesamiento de los distintos materiales. ELEMENTOS NECESARIOS PARA LA REALIZACIÓN DE ANALISIS MICOLÓGICOS Obtención y procesamiento de muestras Hisopos Bisturí Pinza Portaobjetos Tubos con solución fisiológica estéril Gasa Papel de filtro Perlas de vidrio Tubos de centrífuga Jeringa Aguja Manipulación de muestras y cultivos Ansa Gancho Hilo Pinza Líquidos de montaje para exámenes directos Hidróxido de potasio 20% Tinta Parker en KOH 20% Azul de lactofenol (Gueguen) Tinta china diluída al medio con formaldehido Soluciones para realizar coloraciones: May Grünwald Giemsa May Grünwald Agua estabilizada Giemsa Giemsa prologando Metanol Giemsa Agua estabilizada Ziehl Neelsen Fucsina fenicada Alcohol clorhídrico Azul de metileno Kinyoun Carbol fucsina Acido sulfúrico 1%

3 3 Azul de metileno Medios de cultivo Agar Sabouraud Glucosa (ASG) Agar Sabouraud Glucosa Cloromicetina (ASCl) Mycosel Lactrimel Agar Sangre-Cerebro-Corazón con antibiótico (ASCC) Dixon modificado MATERIALES CLÍNICOS La calidad del diagnóstico de las micosis depende de la calidad y cantidad del material recogido del paciente, de las condiciones de envío, conservación, transporte y procesamiento y de la pericia del micólogo. Las muestras deben ser representativas, abundantes, libres de contaminantes, exógenos o endógenos, y de sustancias que inhiban o alteren la viabilidad de los hongos. Según su procedencia los materiales clínicos pueden clasificarse como: Recogidos por el paciente. Orina Esputo Materia fecal Remitidos por médicos. Biopsia Lavado Bronquioalveolar (BAL) Aspirados traqueales Aspirados gástricos Líquidos de punción Líquido Cefalorraquídeo (LCR) Hemocultivo (HC) Médula ósea (MO) Punta de catéter Orina por Punción Suprapúbica (PSP) Obtenidos por bioquímicos Escamas de piel y uñas Flujo Vaginal (FV) Secreción uretral Hisopados de mucosas Suero para serología Escarificaciones Cuando las muestras son recogidas por médicos o pacientes es importante informarles cuales son las condiciones adecuadas de recolección, almacenamiento y transporte.

4 NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO No consumir alimentos ni bebidas. No fumar ni masticar chicle. No aplicarse cosméticos. No manipular lentes de contacto. Utilizar guardapolvos y guantes todo el tiempo. No tocar elementos de uso común con las manos enguantadas. Utilizar barbijos y gafas protectoras cuando se procesen materiales que así lo requieran. Todo material corto-punzante (agujas, bisturíes, etc) deben descartarse en recipientes colocados a tal fin. Las muestras y cultivos desechados se evacuarán en recipientes impermeables en bolsas de color rojo. Los tubos y portaobjetos que estuvieron en contacto con material infeccioso se descartan sumergiéndolos en solución de hipoclorito. Las zonas de trabajo se limpiarán con un desinfectante apropiado después de cada período de trabajo. Todos los procedimientos deben realizarse de forma tal de evitar la generación de aerosoles. Durante las manipulaciones microbiológicas se desprenden partículas y gotas por lo que es aconsejable lavarse las manos con frecuencia y no tocarse la boca ni los ojos. Nunca pipetear con la boca. Utilizar material plástico en lugar de vidrio siempre que sea posible: tubos, pipetas Pasteur, etc Cuando se utilice material de vidrio observar que no esté rajado o agrietado Ante la rotura de recipientes de vidrio conteniendo muestras: agregar hipoclorito y dejar actuar 30 minutos, recoger con algodón evitando los cortes y colocar los fragmentos en recipiente de plástico. En caso de rotura de líquidos patogénicos: se debe absorber con algodón, papel o tela, que será descartado como residuo patogénico. En caso de accidentes corto-punzantes: favorecer el sangrado de la herida y lavar con solución de yodo-povidona al 5% por no menos de 10 minutos. En caso de salpicaduras en mucosas: lavar con abundante agua corriente por no menos de 20 minutos. En caso de salpicaduras en piel: lavar con yodo-povidona al 5% por los menos por 20 minutos. 4

5 5 DESCRIPCIÓN DEL PROCESAMIENTO DE LOS DISTINTOS MATERIALES PIEL: PIEL LISA, PEQUEÑOS Y GRANDES PLIEGUES Y FANERAS (UÑAS Y PELOS) Indicaciones al paciente: Se debe suspender toda medicación antifúngica, tópica o sistémica, entre 15 a 30 días antes de la extracción. Suspender la colocación de pomadas, cremas o talcos medicinales o cosméticos por lo menos un día antes de concurrir al laboratorio. Se debe higienizar por lo menos 3 horas antes de la extracción de muestra con agua y jabón. Cuando el material a estudiar es uña se recomienda no cortarlas la semana anterior a la obtención de la muestra y cepillarlas con frecuencia usando jabón de tocador y concurrir sin esmaltes. Obtención de la muestra: La obtención de la muestra a examinar se realiza de diferente manera según la zona afectada. En general deben prepararse pares de portaobjetos esterilizados a la llama y un bisturí estéril. Después que los portaobjetos están fríos, se coloca uno de ellos, con la cara flameada mirando hacia arriba e inmediatamente por debajo de la lesión. Las escamas obtenidas se juntan en el centro del portaobjetos y se coloca encima la cara flameada del segundo portaobjetos a modo de emparedado. Se los envuelve con un papel en el cual se escribe el nombre del paciente y el lugar de donde fue obtenido el material. Las escamas de lesiones en piel lampiña deben obtenerse del borde de la misma, cuando se sospecha de pitiriasis se recomienda realizar además la técnica de cinta scotch (ver más abajo). La extracción de muestras del cuero cabelludo se efectúa arrancando pelos con la pinza de depilar y luego raspando la superficie cutánea para desprender escamas. En las onicomicosis subungueales debe pasarse el bisturí por el espacio subungueal, donde se acumula la hiperqueratosis; en la onicomicosis blanca superficial se raspa la tabla externa de la uña y en las leuconiquias proximales profundas debe procurarse la obtención de una muestra que abarque el mayor espesor posible de la tabla ungueal. Examen directo: KOH al 20% y calor. Tinta Parker en KOH al 20% y calor. Gueguén Observaciones: si el Examen directo: de uñas resultara negativo, se aconseja dejar el preparado hasta 48 horas en cámara húmeda con una gota de agua glicerinada al 50% por el reborde del cubreobjeto. Cultivos: Medios de cultivo Temperatura Tiempo 2 tubos de Lactrimel 1 tubo de Mycosel 1 tubo de Agar V8 28ºC 2 semanas

6 6 PARA EL DIAGNÓSTICO DE PITIRIASIS: Técnica de cinta scotch Se aplica un fragmento de cinta de 10 cm sobre la lesión y se presiona raspando con el borde lateral de la uña, la superficie de la cinta que cubre la zona afectada para que se adhieran las escamas. La cinta se retira y se aplica sobre una lámina porta-objetos limpia, rebatiendo los extremos hacia abajo para que no se despegue. Es conveniente tomar dos o tres improntas y montarlas individuales. Para la observación microscópica se despega uno de los extremos, se coloca una gota de Gueguen o Azul de Metileno y se vuelve a colocar la cinta. Examen directo de escamas obtenidas por raspado: KOH al 20% y calor Gueguén Tinta Parker en KOH al 20% y calor Cultivos: Medios de cultivo Temperatura Tiempo con el agregado de 2-3 gotas de aceite de oliva estéril 1 tubo de Dixon modificado 32ºC 2 semanas

7 7 FLUJO VAGINAL Indicaciones al paciente: Suspender toda medicación antibiótica y/o antifúngica, local o sistémica, 10 días antes de la extracción. No tener relaciones sexuales por lo menos 3 días antes de la extracción de la muestra. Se debe realizar una higiene de la zona genital la noche anterior a la extracción, preferentemente sin ducha vaginal. Utilizar ropa interior limpia. Obtención de la muestra: Se recolecta con hisopo, previa colocación de espéculo, con el que se debe realizar Frotis sobre portaobjetos 2 suspensiones en solución fisiológica estéril Colocar hisopo en medio de Stuart Estos materiales son utilizados: Para análisis micológico: una suspensión en solución fisiológica Para análisis bacteriológico: frotis, la otra suspensión y el medio de Stuart Examen directo: En fresco Gueguen Cultivos: Medios de cultivo Temperatura Tiempo 1 tubo de ASCl 28ºC 1 semana SECRECIÓN URETRAL Indicaciones al paciente: Higienizarse por lo menos 5 a 7 horas antes de la toma de muestra. No colocarse pomadas ni tomar ningún antifúngico. Obtención de la muestra: Recolección con hisopo en solución fisiológica estéril Examen directo: En fresco Gueguen Cultivos: Medios de cultivo Temperatura Tiempo 1 tubo de ASCl 28ºC 1 semana OTRAS MUCOSAS Y SECRECIONES Obtención de la muestra:

8 8 Recolección con hisopo en solución fisiológica estéril Examen directo: En fresco Gueguen Cultivos: Medios de cultivo Temperatura Tiempo 1 tubo de ASCl 28ºC 1 semana ORINAY ORINA POR PUNCIÓN SUPRAPÚBICA Indicaciones: al paciente: Se recoge la primera orina de la mañana por la técnica del chorro medio Si es una mujer debe higienizarse previamente y colocarse un tapón vaginal. La orina se recoge en un recipiente estéril, de boca ancha, tapa de rosca y de preferencia de plástico Una vez recogida la muestra llevar inmediatamente al laboratorio (de lo contrario conservar en heladera hasta 12 horas). En los pacientes con sonda vesical la muestra debe ser obtenida por punción proximal de la sonda, previa asepsia de la misma con yodo-povidona. También se utiliza en estos casos la punción suprapúbica. En neonatos y lactantes la toma de la muestra se realiza al acecho. 1-Orina: Cultivos : Sembrar 10 µl de orina completa, previamente agitada en placas conteniendo ASG y ASCl. El factor para el recuento es 100. Examen directo: Centrifugar la muestra para realizar el examen directo desde el sedimento: en fresco y con gueguen. 2-Orina por punción suprapúbica: Centrifugar la muestra para realizar el examen directo y cultivos con el sedimento. Examen directo: En fresco Gueguen Cultivos : Medios de cultivo Temperatura Tiempo 1 tubo de ASCl 28ºC 1 semana

9 9 BIOPSIAS, ESPUTO, LAVADO BRONQUIAL, ASPIRADOS TRAQUEALES, ASPIRADOS GÁSTRICOS, LÍQUIDOS DE PUNCIÓN, ULCERAS, ESCARIFICACIÓN DE LESIONES CUTÁNEAS (PÁPULAS, NÓDULOS) Indicaciones: Biopsias y lavado bronquio alveolar Estos materiales los extrae médico. Se deben recoger en recipientes estériles suspendidos en solución fisiológica y nunca en formol. Remitirlo enseguida al laboratorio, en caso contrario guardar en la heladera unas horas. Esputo Debe recogerse de tos profunda, a primera hora de la mañana (poco después de levantarse). La muestra no debe contener saliva. Antes de recoger la muestra, cepillar los dientes sin dentífrico y enjuagar la boca con agua hervida y enfriada, y en lo posible con bicarbonato (una cucharadita de té en un frasco de agua) Utilizar un recipiente estéril, de cierre hermético, y rotulado con nombre y apellido del paciente. Una vez recogido el material enviar inmediatamente al laboratorio (de lo contrario conservar en heladera hasta 2 horas como máximo) Si el estudio es seriado recoger la muestra preferentemente cuando tenga expectoración, para evitar remitir saliva. Obtención de las muestras: Lesiones cutáneas: descartar las capas más superficiales y tomar el material de las zonas más profundas con bisturí descartable realizar extendido. Suspender el material en solución fisiológica estéril y centrifugar. Escarificación: Se obtiene la muestra por raspado de la úlcera hasta sangrado. Con el material obtenido se realizan frotis La siembra se realiza inoculando directamente el material extraído en los medios de cultivos. Este proceso es muy doloroso para el paciente por lo que se puede tratar la zona con anestésicos locales, previo acuerdo con el médico solicitante de la práctica. Úlceras: previo a la extracción limpiar la lesión con hisopo estéril. Utilizar bisturí descartable para tomar la muestra. Realizar extendidos, resuspender el material en solución fisiológica estéril y centrifugar. Fístulas: Previo a la toma de muestra se debe higienizar la zona afectada con solución fisiológica estéril. Comprimir suavemente la zona para favorecer el drenaje del material purulento. Recoger en solución fisiológica estéril o inocularlo directamente en los medios de cultivos. En el caso de escaso o nulo drenaje de material tomar la muestra con hisopo estéril descartando el material superficial y penetrando hacia la zona más profunda para la recolección. Si la recolección es aún dificultosa se debe solicitar la biopsia de la zona fistulosa. Otra opción es colocar en la fístula una mecha de gasa estéril durante 24 hs. Secreciones oculares: Limpiar con solución fisiológica estéril y posteriormente recolectar, por hisopado, en solución fisiológica estéril el material drenado. Las muestras obtenidas por raspado de cornea o por aspiración del humor vitreo, recolectadas por el oftalmólogo, deben ser remitidas inmediatamente al laboratorio para su procesamiento. Secreciones óticas: Limpiar con solución fisiológica estéril. Recolectar con hisopo el material del conducto auditivo externo, lo más profundo posible y sin tocar las paredes del canal auricular, en solución fisiológica.

10 10 Secreciones de senos paranasales: Se recomienda la toma de muestra por aspirado del material de los senos paranasales. En caso de no poder aspirar el material hisopar las fosas nasales. Preparación de las muestras: Líquidos diluidos: se deben concentrar por centrifugación Materiales sólidos o viscosos: triturar o disgregar de la forma más conveniente (con mortero, perlas de vidrio, bisturí, tijeras, etc.) Examen macroscópico de la muestra Examen directo: En fresco o con KOH al 20% (materiales densos) Gueguen Con tinta china (si se sospecha criptococosis, en esputos de HIV) Coloraciones: May Grünwald Giemsa o Giemsa prologando (según el material) Ziehl Neelsen Kinyoun (búsqueda de antinomicetales) Cultivos: Medios de cultivo Temperatura Tiempo 1 tubo de ASCl 1 tubo de Mycosel 28ºC 4 semanas 2 tubos de ASCC 37ºC LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Preparación de la muestra: Recolectar de manera estéril y centrifugar a 1000 rpm por 15 minutos, el análisis micológico se realiza con el sedimento. Reservar el sobrenadante para la prueba de aglutinación de antígeno por partículas de látex. Examen directo: En fresco Gueguen Con tinta china Cultivos: Medios de cultivo Temperatura Tiempo 28ºC 1 tubo de ASCl 2 semanas 37ºC 1 tubos de ASCC

11 11 MATERIA FECAL - con recuento de colonias Indicaciones al paciente: Para realizar este análisis no se debe realizar ninguna dieta previa. Recoger una deposición espontánea de materia fecal en un recipiente estéril, de cierre hermético y rotulado con el nombre y apellido del paciente. Una vez recogida la muestra llevar inmediatamente al laboratorio (de lo contrario conservar en heladera hasta 12 horas). Preparación de la muestra: Hacer una suspensión concentrada de materia fecal en solución fisiológica (tomando por lo menos 10 lugares distintos de la muestra). Filtrar a través de doble capa de gasa y llevar al doble de volumen con ácido cítrico al 10%. Dejar en reposo 24 hs en la heladera. Centrifugar, descartar el sobrenadante y del sedimento sembrar, por agotamiento en superficie, con ansa calibrada, en placa. Ejemplo de siembra por agotamiento en superficie para realizar el recuento de colonias de levaduras de materia fecal. Examen directo: A partir de la muestra o bien a partir del filtrado de la misma. En fresco Gueguen Cultivos: Medios de cultivo Temperatura Tiempo 1 placa de ASG 1 placa de ASCl 28ºC 1 semana Realizar el recuento de colonias y la identificación de las levaduras e informar el número de colonias por gramo de heces (VN: hasta 5000 colonias de levaduras/g de materia fecal) - en neonatos Preparación de la muestra: No se realiza el procedimiento descripto para recuento de colonias Examen directo: En fresco Gueguen Cultivos: Medios de cultivo Temperatura Tiempo 1 tubo de ASCl 28ºC 1 semana

12 12 HEMOCULTIVO Y MÉDULA ÓSEA - Por el método de lisis centrifugación Preparación de la muestra: Recolectar sangre en tubo de centrífuga con anticoagulante (heparina) y saponina e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Centrifugar a 2000 rpm durante 10 min, descartar el sobrenadante y sembrar el sedimento. Cultivos: Medios de cultivo Temperatura Tiempo 28ºC 1 tubo de Mycosel 4 semanas 37ºC 1 tubos de ASCC Observaciones: En pacientes con alimentación parenteral agregar un tubo de Dixon o ASG con dos gotas de aceite de oliva e incubar a 32ºC - En caldo Preparación de la muestra: El volumen de sangre inoculado al frasco debe ser el 10 % del volumen del medio de cultivo. Conservar el frasco de hemocultivo con la sangre a 28 ºC y se realizan repiques a las 48 hs y a la semana de incubación. Previamente observar el aspecto del sobrenadante sin agitar el frasco. Si el paciente es VIH + y/o se sospecha histoplasmosis realizar además un repique a los 15 días. Cultivos: Medios de cultivo Temperatura Tiempo 28ºC 1 tubo de Mycosel 4 semanas 37ºC 1 tubos de ASCC Observaciones: En MO el médico deberá realizar un extendido antes de inocular la muestra de MO en el caldo, que se deberá teñir con MGG. - Hemocultivos automatizados BACTEC Myco/F Lytic Las botellas de hemocultivos automatizadas poseen un caldo con el agregado de saponina, enzima lítica que destruye glóbulos blanco y rojos aumentando la taza de recuperación de hongos intracelulares como Histoplasma capsulatum. En su base poseen una sustancia que la reaccionar con el CO 2 producido por el desarrollo microbiológico origina fluorescencia, la cual es censada por el lector del autoanalizador que construye una curva con los cambios de fluorescencia. Por tal motivo es fundamental que desde el momento en que la botella es inoculada con la sangre del paciente, no pasen más de 18 hs para ser introducida en el autoanalizador, ya que una vez que la fase estacionaria de crecimiento es alcanzada, la fluorescencia

13 13 emitida se vuelve constante lo cual no es interpretado como crecimiento para el instrumento. Pasadas las 18 hs el hemocultivo se procesa como en caldo. El volumen del inoculo figura siempre en la etiqueta del frasco y no debe ser menor a 1 ml de sangre (baja sensibilidad) ni superior a 5 ml (se supera el anticoagulante). Deben ser conservadas siempre a temperatura ambiente hasta ser remitidas al laboratorio. PUNTA DE CATÉTER Preparación de la muestra: Se recoge la punta de catéter en un tubo estéril y se coloca en 1 ml de solución filológica estéril y se agita enérgicamente en un vortex durante 2-3 min. Centrifugar y sembrar el sedimento. Cultivos: Medios de cultivo Temperatura Tiempo 1 tubo de ASCl 28ºC 1 semana

14 14 AGLUTINACIÓN DE PARTÍCULAS DE LÁTEX PARA DETECTAR ANTÍGENO DE CRYPTOCOCCUS Fundamento: Este test de aglutinación es rápido y simple para la detección cualitativa y semicuantitativa del antígeno del polisacárido capsular de Cryptococcus neoformans en LCR o suero. Preparación de la muestra: LCR Recolectar de manera estéril y centrifugar 1000 rpm por 15 minutos. Para la prueba de aglutinación se utiliza el sobrenadante. Si no se procesa inmediatamente, refrigerar a 4ºC o congelar Suero La muestra se recoge sin sobrenadante. Si no se procesa inmediatamente, refrigerar a 4ºC o congelar Procesamiento Según indicaciones del equipo comercial

15 15 SEROLOGÍA. INMUNODIFUSIÓN DE OUTCHERLONY Fundamento Con esta técnica se detectan cualitativa y semicuantitativamente anticuerpos para diagnóstico de Histoplasmosis, Paracoccidioidomicosis, Coccidioidomicosis, Candidiasis y Aspergilosis Preparación de la muestra: Extraer sangre sin anticoagulante El paciente debe estar en ayunas A todos los sueros que se utilizan en las pruebas serológicas se les agrega mertiolate de sodio (1/10.000) o azida sódica (1/1.000) como conservadores. Si no se usan de inmediato pueden guardarse en congelador (-20ºC) hasta el momento de su empleo. Procesamiento Preparación de los portaobjetos: Se diluye 1 ml de agar para inmunodifusión en 7 ml de agua destilada y se coloca en baño de agua a 70 ºC. Se cubren los portaobjetos perfectamente limpios y desengrasados con alcohol con una película de esta preparación, se desparrama con el dedo para que quede rugoso y se deja secar en la estufa de 37 ºC hasta que se forme una capa seca y opaca. Luego se agregan entre 2.5 y 2.8 ml de agar para inmunodifusión sin diluir por portaobjetos. Una vez solidificados se los colocan en cámara húmeda y se conservan en heladera hasta el momento de su uso. Pueden guardarse hasta una semana en estas condiciones. Realización de la prueba: Con un sacabocados de 4 mm, se cortan el agar de acuerdo con un esquema de 6 hoyos periféricos y uno central. Los cilindros de agar se retiran con aguja o espátula. Se deben llenar primero los pocillos correspondientes a sueros y antisueros y después de 30 a 40 minutos de difusión se colocan los antígenos. Todas las cavidades se llenan hasta el borde. Ag 1 Ac 3 Ag 3 Ac 1 Suero paciente Ag 2 Ac 2 Ejemplo de diseño de placa de inmunodifusión para la evaluación de la presencia de tres tipos de anticuerpos diferentes. Se enfrenta al suero del paciente frente a tres antígenos y sus correspondientes antisueros controles. La incubación se hace a temperatura ambiente, en cámara húmeda, durante 72

16 16 horas, pero es conveniente observar diariamente la reacción. Finalizada la incubación, los portaobjetos se cubren con una solución de citrato de sodio (ph 8.2) durante 2 horas con el objeto de hacer desaparecer los halos formados por los sueros que dificultan la observación de las bandas de precipitación y para eliminar las bandas producidas por una proteína llamada sustancia C. Luego de ese lapso se vuelca el tampón y se procede a ver la existencia de bandas de precipitación que indican presencia de anticuerpos precipitantes en el suero estudiado. Es necesario colocar una fuente de iluminación debajo de la placa para la mejor visualización de los resultados. En casos de pruebas positivas se debe realizar una titulación, efectuando diluciones seriadas al doble y repitiendo la prueba. Siempre se debe realizar una coloración final, sobre todo en casos de pruebas negativas (para confirmarlas), y en casos de titulaciones; se observa que bandas muy débiles se observan luego de esta maniobra. Tecnica de coloración de bandas Lavado: Sumergir la placa por 24 horas en solución fisiológica cambiándola frecuentemente. Colocar papel de filtro encima del gel y dejar secar a 37ºC. Sacar el papel. Coloración: Sumergir en colorante de 10 a 20 minutos Decoloración: Sumergir en solución decolorante el tiempo que sea necesario (aproximadamente 10 minutos). Primero con decolorante usado y luego con una parte del nuevo el cual es guardado para el primer paso de la coloración siguiente. Enjuagar con agua y dejar secar.

17 17 Pruebas de sensibilidad a antifúngicos Las pruebas de sensibilidad tienen como objetivo conocer si los microorganismos ensayados son sensibles o resistentes a los antimicrobianos y sirven para elegir de forma óptima el tratamiento antifúngico. Metodologías para la determinación de sensibilidad antifúngica Existen dos procedimientos generales para determinar la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos y estos son: - Dilución en agar o caldo - Difusión en agar Dilución en agar o caldo Se realiza la dilución del antimicrobiano en un medio de cultivo adecuado para el crecimiento del microorganismo que se va a ensayar. Se inocula el microorganismo, se incuba a una temperatura determinada y se determina la concentración del antimicrobiano que produce la inhibición del crecimiento del microorganismo definida como CIM (Concentración Inhibitoria Mínima). - Inoculación - Incubación Diluciones del antifúngico CIM = 16 μg/ml Esta metodología puede realizarse en macroescala, utilizando tubos, o en microescala, usando microplacas de 96 pocillos. La posibilidad de cuantificar la actividad antifúngica a través de la determinación de la CIM es la principal ventaja de los métodos de dilución ya que estos valores cuantitativos se pueden utilizar, junto con la farmacocinética del antimicrobiano, para calcular índices terapéuticos. Difusión en agar con disco Se inocula el microorganismo en la superficie del agar y se deposita un disco con una concentración conocida de antimicrobiano. Después de incubar a una temperatura adecuada, se produce una zona de inhibición del crecimiento del microorganismo alrededor del disco. Dependiendo del tamaño de la zona, se puede determinar si el microorganismo es sensible, intermedio, indeterminado o resistente al antimicrobiano ya que los diámetros tienen una relación inversa con la CIM. La principal ventaja de la difusión con disco es el bajo costo unido a la simplicidad de la técnica y esto incluye desde la realización, la lectura y en la mayoría de las ocasiones, la interpretación.

18 18 incubación Placa con medio de cultivo inoculada Discos conteniendo antifúngicos Halos de inhibición Estándares de Referencia El Instituto de Estándares Clínicos de Laboratorio, CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute), desarrolló Estándares de Referencia que describen detalladamente los parámetros experimentales para la correcta realización de ambos métodos para lograr, de esta forma, una mayor exactitud y reproducibilidad de los resultados. Métodos de dilución Documento M27-A3: Método de referencia para determinar la sensibilidad de las levaduras a los antifúngicos a través del método de dilución en caldo. Introducción El método que describe este estándar está pensado para evaluar levaduras de las especies de Candida y Cryptococcus neoformans. No se aplica para evaluar la fase levaduriforme de los hongos dimórficos como Histoplasma capsulatum. Para algunos hongos filamentosos se puede utilizar el método de dilución descripto en el documento M38-A2. Medio de cultivo El medio recomendado es completamente sintético: RPMI con glutamina, sin bicarbonato y rojo fenol como indicador de ph. Preparación del inóculo Se parte de un cultivo de 24 h en Agar Sabouraud a 35ºC (48 h para Cryptococcus), se tocan cinco colonias y se suspenden en 5 ml de solución fisiológica estéril. El resultado de la suspensión se homogeneiza durante 15 segundos, y su turbidez se ajusta a 0,5 de la escala McFarland (equivalente a 1 x 10 6 a 5 x 10 6 UFC). Para los métodos de dilución, la suspensión se diluye 1:2000 con RPMI 1640 para obtener 0,5 x ,5 x 10 3 UFC/ml. Soluciones de antifúngicos Las soluciones madre de los antifúngicos se preparan a concentraciones de al menos 1280 μg/ml o 10 veces la concentración mayor ensayada en dimetilsulfóxido y luego se diluyen en el medio de cultivo apropiado. El intervalo de concentraciones elegidos para cada antimicrobiano debe incluir los puntos críticos, o sea aquellos que definen si una cepa es sensible o resistente. Basados en estudios previos, se recomiendan las concentraciones de antifúngicos que están recogidas en la siguiente tabla.

19 19 Antifúngico Intervalo (μg/ml) Anfotericina B 16-0,03 5-fluorocitosina 64-0,12 Ketoconazol 16-0,03 Fluconazol 64-0,12 Itraconazol 16-0,03 Voriconazol 16-0,03 Posaconazol 16-0,03 Ravuconazol 16-0,03 Anidulafungina 16-0,03 Caspofungina 16-0,03 Realización de la técnica de microdilución Se utilizan placas de microdilución estériles de 96 pocillos. Se dispensan 100 μl de los antifúngicos a una concentración 2x en las columnas de la 1 a la 10 con una pipeta multicanal. La columna 1 contiene la concentración más alta del antifúngico (64 o 16 μg/ml) y la fila 10 la más baja (0,12 o 0,03 μg/ml). Cada pocillo de la placa se inocula con 100 μl de la suspensión del inóculo. El pocillo 11 control de crecimiento, que solo contiene 100 μl de RPMI 1640, se añaden 100 μl del inóculo. El pocillo 12 es control de esterilidad de la técnica y por tanto debe contener solo RPMI A B C D E F G H A B C D E F G H ,5 0,25 0,12 Control de crecimiento Control de esterilidad ,5 0,25 0,12 0,06 0,03 Control de crecimiento Control de esterilidad Incubación Candida spp. se debe de incubar, sin agitación, en atmósfera normal, a 35ºC durante horas y Cryptococcus neoformans, en las mismas condiciones durante horas. Lectura de los resultados La CIM es la concentración más baja de antifúngico que inhibe sustancialmente el crecimiento del microorganismo detectado visualmente. Se compara el crecimiento en cada concentración de antifúngico con el crecimiento en el tubo control de crecimiento y se califica de la siguiente forma: 0 = ópticamente claro 1 = ligeramente turbio 2 = disminución prominente de la turbidez 3 = ligera disminución de la turbidez 4 = sin disminución de la turbidez La CIM para la anfotericina B, se define como la concentración más baja que tiene una puntuación de 0 (ópticamente claro). Para la 5-fluorocitosina, los azoles y las

20 20 equinocandinas es la concentración más baja que tiene una puntuación de 2 (disminución prominente de la turbidez). Para aquellos aislamientos que producen grumos en el fondo, la dispersión de los mismos pipeteando o agitando puede ayudar a la interpretación de los resultados. Puntos de corte (μg/ml) recomendados por el CLSI. Documento M27-A3 Antifúngico Sensible SDD Intermedio Resistente Anfotericina B > 1 Fluconazol Itraconazol 0,125 0,25-0, fluorocitosina Voriconazol Equinocandinas Control de calidad Los objetivos del programa de control de calidad son evaluar: 1. la precisión y exactitud del procedimiento de ensayo. 2. si los reactivos, las condiciones del ensayo y las instrucciones utilizadas en el procedimiento fueron adecuadas. 3. el personal que realiza las técnicas y lee los resultados. Estos objetivos se alcanzan si se utilizan cepas de control seleccionadas por su estabilidad genética y por su utilidad para controlar el método que se está ensayando. Las cepas de control de calidad son evaluadas de la misma forma y se incluyen siempre que se ensaye un aislado, se utilizan C. parapsilosis ATCC y C. krusei 6258, los resultados obtenidos deben estar dentro del rango recomendado Microorganismo Antifúngico Rango CIM Anfotericina B 0,25 2 Anidulafungina 0,25 2 Caspofungina 0, fluorocitosina 0,06-0,25 C. parapsilosis ATCC Fluconazol 0,5 4 Itraconazol 0,125-0,5 Ketoconazol 0,03-0,25 Posaconazol 0,06-0,25 Ravuconazol 0,016-0,12 Voriconazol Anfotericina B 0,5 2 Anidulafungina Caspofungina C. krusei ATCC fluorocitosina 4 16 Fluconazol 8 64 Itraconazol 0,12 1 Ketoconazol 0,12-1 Posaconazol 0,06-0,5 Ravuconazol 0,06-0,5

21 21 Métodos de difusión Documento M44 A Método de referencia para determinar la sensibilidad de las levaduras a los antifúngicos a través del método de difusión en disco El documento M44-A describe el método de difusión en agar para levaduras del género Candida. Las pruebas en medio sólido y en especial las de difusión son simples de realizar y los resultados se obtienen de forma rápida, y muy fáciles de interpretar. Medio de cultivo Se utiliza Agar Müeller-Hinton con 2% glucosa y 0,5 μg/ml Azul de Metileno. Las placas de Petri deben de tener una profundidad de 4 mm. Es necesario secar la superficie antes de utilizarlas, colocando las placas durante media hora, en la estufa de 37ºC boca abajo y con las tapas ligeramente abiertas para permitir que la humedad se evapore. Preparación del inóculo Se emplea el procedimiento descripto anteriormente utilizándose la suspensión obtenida en solución fisiológica con una concentración de 1 x 10 6 a 5 x 10 6 UFC. Inoculación de las placas Siembra por dispersión con hisopo Se sumerge un hisopo de algodón estéril en el inóculo. El exceso de líquido es eliminado girando el hisopo varias veces contra las paredes interiores del tubo. El inóculo se extiende por toda la superficie de la placa 3 veces seguidas. En cada repetición, se gira la placa 60º, de forma que se asegure la distribución uniforme del inóculo. Siembra por inundación Se realiza una dilución 1/10 del inóculo, se extraen entre 2-4 ml y se vuelcan en la placa de Petri. Se distribuyen homogéneamente por la superficie y el exceso de líquido se retira con una pipeta Pasteur estéril. Se deja secar la superficie durante 15 minutos a temperatura ambiente. Antifúngicos Los antifúngicos pueden colocarse en distintos reservorios: pocillos en el agar, cilindros que contienen el antimicrobiano, tabletas o discos. La aparición del disco de papel de filtro impregnado de antimicrobiano revolucionó esta técnica y en la actualidad es el reservorio de elección para las pruebas de susceptibilidad. Las tabletas son también un método muy utilizado que se encuentra disponible comercialmente. Colocación de los discos de antimicrobiano Los discos de antimicrobianos se deben colocar no más de 15 minutos tras la inoculación de las placas, de esa forma la difusión y el crecimiento ocurren en simultáneo. Se pueden aplicar con la ayuda de un dispensador o con pinza estéril. Para asegurar un completo contacto se aconseja presionar el disco contra la superficie del agar. Se deben de colocar al menos a una distancia de 15 mm del borde de la placa y separados entre sí por una distancia de 24 mm. Esta disposición reduce la posibilidad de superposición de zonas de inhibición, que dificulta la lectura e interpretación. Una vez colocados en el agar, es importante no moverlos ya que la difusión comienza de forma inmediata.

22 22 Incubación de las placas Las placas inoculadas deben ser incubadas a 35 ± 2 ºC durante y hasta 48 horas en una posición invertida. Lectura de las zonas de inhibición El diámetro de cada zona de inhibición se mide con una regla, calibre, plantilla o instrumental electrónico. Interpretación de resultados Los hallazgos se clasifican categorías (sensible, Intermedio, Sensible dependiente de dosis, resistente) basándose en los puntos de corte que se establecieron mediante el método de dilución en caldo, las concentraciones séricas que el antibiótico alcanza en suero y la distribución de las CIMs para la especie estudiada. Antifúngico Concentración Halo de inhibición (mm) R* S-DD* S* Fluconazol 25 μg Anfotericina B 10 μg Itraconazol 8 μg Ketoconazol 15 μg Voriconazol 1 μg *Susceptible: S; *Susceptible-dependiente de dosis: S-DD; *Resistente: R Rangos de diámetros (mm) para las cepas control de calidad Antifúngicos Candida albicans Candida parapsilosis Candida krusei ATCC ATCC ATCC Fluconazol mm mm Anfotericina B mm mm mm Itraconazol mm mm mm Ketoconazol mm mm mm Voriconazol mm mm mm Los rangos de control de calidad de estos aislamientos no han sido establecidos para estos antimicrobianos debido a la extensa variabilidad inter laboratorio. Etest (AB Biodisk) Es una técnica cuantitativa. Consiste en la utilización de una tira de plástico que, en una de sus caras, lleva un gradiente de concentración del antimicrobiano. Tras la incubación, la intersección entre el crecimiento del microorganismo y la zona de inhibición en forma de elipse indican la CIM.

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24 24 APÉNDICE PREPARACIÓN DE LÍQUIDOS DE MONTAJE Gueguen: Acido Láctico mg Sudan III mg Azul Cotton o de Porrier mg Se trituran en mortero Sudan III al que se agrega Acido Láctico, se mezcla y se deja reposar durante 24 hs. Después de ese tiempo se filtra, se agrega el Azul Cotton (previamente triturado) y 70 u 80 gotas de solución de Iodo Alcohólica, se conserva en frascos color caramelo en la heladera.- Hidróxido de potasio: Hidróxido de Potasio g. agua destilada ml Disolver el hidróxido de potasio en agua. Se conserva en frascos goteros. Tinta china: Tinta China... 2 ml. Formaldehido... 2 ml. Mezclar ambos componentes y colocar en frascos goteros. Tinta parker: Solución KOH al 10%... 3 ml. Tinta Parker ml. Mezclar ambos componentes y colocar en frascos goteros. Lugol Iodo metaloide..20 g Ioduro de potasio..40 g Agua destilada ml Se mezcla en un mortero el Iodo metaloide con el Ioduro de potasio hasta la total disolución, luego se agrega de a poco el agua destilada. Se conserva en frascos color caramelo. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Agar sangre: Agar Infusión Cerebro Corazón... 52g. Agua destilada ml. Cloranfenicol ml. Estreptomicina gotas Sangre... 6 a 10 ml. Disolver el Agar Infusión Cerebro Corazón con el agua destilada. Una vez disuelto agregar: el Cloranfenicol y la Estreptomicina. Luego distribuir en frascos de 100 ml., se taponan y se precintan. Esterilizar 20.

25 25 Cuando los frascos se enfrían hasta 50º se agrega la sangre a cada frasco repartir en tubos de ensayo estériles, estirar en pico de flauta. Dixon modificado: Agar g. Agua destilada Extracto de Malta g. Peptona... 6 g. Bilis de Buey g, Tween ml. Glicerol... 2 ml Cicloheximida... 0,8 g. Aceite de Oliva... 1 %. Disolver el Agar con el agua destilada. Agregar los demás componentes, distribuir y esterilizar 20. Estirar en pico de flauta. Lactrimel: Harina común g. Leche descremada ml. Leche descremada... 21,3 g. Agua destilada ml. Agar g. Miel... 8 g. Cloromicetina... 0,200 g, Mezclar la harina común, con 600 ml de agua destilada. Se deja en la heladera 24 hs. Luego de ese tiempo se filtra el preparado con papel de filtro y se lleva a volúmen de 600 ml. Una vez filtrado se deja y por otro lado se mide la leche descremada, filtrándola con un cono de papel de filtro, un embudo y un colador. Disolver el Agar con 300 ml. de agua destilada. Una vez disuelto se agrega el agua de harina. Por otro lado pesar en un vaso de precipitado la miel con una pequeña cantidad del preparado anterior, se mide el ph que tiene que ser de 6,9. Se agregan la leche descremada y la miel al preparado de Agar. Por último disolver la Cloromicetina en un vaso de precipitado con una pequeña cantidad del preparado, una vez disuelto se agrega al preparado de Agar y se deja todo a baño de maría. Cuando el preparado está bien disuelto se reparte en tubos de ensayo, se taponan, se esteriliza 15 y se estira en pico de flauta. Mycosel: Preparación tradicional Glucosa g. Neopeptona... 5 g. Agar g. Cloranfenicol mg. + 5 ml. alcohol 95º Cicloheximida mg. + 5 ml. acetona

26 26 Agua destilada ml. ph 6,9. Disolver el Agar con 300 ml. de agua destilada a baño de maría. Disolver en el agua destilada restante, la Glucosa, la Neopeptona, tomar el ph que tiene que ser de 6,9 y después agregar el Cloranfenicol + 5 ml. de Alcohol de 95º y la Cicloheximida + 5 ml. de Acetona. Se agrega todo al preparado de Agar. Ditribuir, esterilizar 20 y estirar en pico de flauta. A partir de droga comercial Mycobiotic Agar... 35,6 g. Agua destilada ml. Disolver el Mycobiotic Agar con el agua destilada. Distribuir. Esterilizar 20. Estirar en pico de flauta. Sabouraud cloromicetina: Sabouraud Glucosa g. Solución de Cloranfenicol ml. Agua destilada ml. Solución de Cloranfenicol: Cloromicetina... 1 g. Alcohol ml. Mezclar los componentes. Conservar en frasco color caramelo. Disolver el Sabouraud Glucosa en el Agua destilada. Agregar la solución de Cloranfenicol. Distribuir en tubos de ensayo, taponar, esterilizar 20 y estirar en pico de flauta. Sabouraud glucosa: Preparación tradicional Agar g. Peptona de Carne g. Glucosa g. Agua destilada ml. Disolver el Agar en 700 ml. de agua destilada. En los 300 ml. restantes de agua destilada disolver la Peptona de Carne y la Glucosa. Mezclar todos los componentes, distribuir en tubos de ensayo, taponar, esterilizar 20, estirar en pico de flauta. Luego se mezclan los dos componentes y se distribuye en tubos de ensayo, se taponan y se autoclavan 20.- Se estiran en pico de flauta.- A partir de droga comercial Sabouraud Glucosa g. Agua destilada ml. Disolver el Sabouraud Glucosa en el Agua destilada. Distribuir en tubos de ensayo,

27 27 taponar, esterilizar 20 y estirar en pico de flauta. Agar Mueller-Hinton modificado Mueller Hinton agar.37 g Glucosa 20 g Solución stock de azul de metileno. 100µl Agua destilada c.s.p ml Solución stock de azul de metileno: Azul de metileno..0,1 g Agua destilada.20 ml Disolver el Mueller Hinton con el agua destilada, se agrega los demás componentes. Se esteriliza 15 minutos en autoclave. Se plaquea. TECNICAS DE COLORACIÓN May Grünwald Giemsa 1. Cubrir con May Grunwald 3 minutos 2. Agregar 20 gotas (1 ml) de H 2 O estabilizada ( 1 ml de estabilizador en 50 ml de H 2 O destilada) y dejar reposar 1 minuto. 3. Volcar bien el contenido 4. Cubrir con Giemsa diluido al 10% 15 a 20 minutos. 5. Lavar con H 2 O. 6. Dejar secar en posición vertical 7. Observar con aceite. Nota: en materiales donde se imponga diagnóstico diferencial con Leishmania conviene usar May Grunwald diluido ½ con agua de canilla en el momento, dejar actuar por 5 minutos. Omitir paso 2 Zhiel Neelsen Para esta coloración se debe usar siempre portaobjetos nuevos, bien desengrasados, realizando sobre ellos frotis finos que dejen leer un escrito con cierta dificultad, pero que pueda ser leído en forma borrosa 1. Cubrir el preparado indicado con un papel de filtro del tamaño el portaobjetos. 2. Cubrir con Fuscina fenicada. Calentar con antorcha por debajo del porta objeto hasta desprender vapores (no debe hervir el colorante). 3. Repetir el paso anterior incorporando más colorante para evitar que se seque, se repite el paso por 3 veces en 5 minutos. 4. Lavar con H 2 O. 5. Decolorar con alcohol clorhídrico por un tiempo de 1 minuto y no más de dos veces. 6. Lavar con H 2 O. 7. Cubrir con agua y sobre ella incorporar Azul de Metileno 1 minuto. 8. Lavar con H 2 O. 9. Dejar secar en posición vertical. 10. Observar con aceite Kinyoun

28 28 Para esta coloración al igual que ZN, se debe usar siempre portaobjetos nuevos, bien desengrasados, realizando sobre ellos frotis finos que dejen leer un escrito con cierta dificultad, pero que pueda ser leído en forma borrosa 1. Cubrir con Fuscina fenicada 3 minutos. 2. Lavar con H 2 O. 3. Decolorar con H 2 SO 4 al 1%. 4. Lavar con H 2 O. 5. Cubrir con Azul de Metileno 30 segundos. 6. Lavar con H 2 O. 7. Dejar secar en posición vertical. 8. Observar con aceite Giemsa prolongado (para materiales con sangre, como biopsias, esputos sanguinolentos, etc) 1. Cubrir con Giemsa diluido 2 AL 5 %, por 10 minutos. 2. Volcar suavemente el contenido. 3. Cubrir nuevamente con Giemsa diluido 10 minutos. 4. Volcar suavemente el contenido. 5. Cubrir con Giemsa diluido 1 hora. 6. Lavar con H 2 O. 7. Dejar secar en posición vertical. 8. Observar con aceite Variante Giemsa solo Fijar el preparado con metanol por 5 minutos, dejar secar totalmente en posición viertical Cubrir con Giemsa diluido según tiempo de coloración destinado Gram Nicolle 1. Cubrir con Violeta de Genciana 1 minuto. 2. Lavar con H 2 O. 3. Cubrir con Lugol 1 minuto. 4. Lavar con H 2 O. 5. Decolorar con alcohol-acetona 10 segundos. 6. Lavar con H 2 O. 7. Cubrir con Fuscina fenicada 30 segundos. 8. Lavar con H 2 O. 9. Dejar secar en posición vertical. 10. Observar con aceite Técnica de Tinción Azul de Toluidina Preparación de reactivos Reactivo de Sulfatación Acido Acético Glacial 45 ml Acido Sulfúrico 15 ml Reactivo Azul de Toluidina Azul de Toluidina 0.16 gr. Agua Destilada 60 ml Acido Clorhídrico 2 ml Alcohol Etílico Absoluto 140 ml

29 29 Preparación de la muestra a procesar: Lavado broncoalveolar: centrifugar a rpm 5 min. Y realizar con el sedimento al menos tres frotis Esputo ó secreción bronquial: Agregar perlas de vidrio y dos o tres gotas de hidróxido de sodio al 10 %. Realizar al menos 6 frotis. Técnica de coloración 1. Reactivo de Sulfatación 10 minutos 2. Agua corriente bajo la canilla (lado opuesto al preparado) 1 minuto 3. Reactivo azul de toluidina 5 minutos o 10 minutos o mas según la antigüedad del reactivo 4. Alcohol etílico al 95 % 10 segundos 5. Alcohol etílico puro 10 segundos 6. Alcohol etílico puro 10 segundos 7. Xilol (no es indispensable) 10 segundos SEROLOGÍA Gel de agar: Agar Noble o bacto (Difco) o agar Oxoid Nº gr Polietilénglicol 6000 (Carbowax 6000) (PEG)... 1 gr Cloruro de sodio gr Fenol ml Buffer de fosfatos... 1 ml Agua destilada... csp 100 ml Buffer de fosfatos (ph 7.4). M/15 Na 2 HPO ml M/15 NaH 2 PO ml Se prepara primero la solución salina fenolada. Se agregan simultáneamente el agar y el PEG y se mezclan durante 5 minutos. Se lleva a baño de agua de 100ºC para su disolución completa y por último se distribuye en tubos de ensayo a razón de 4 a 5 ml, una vez solidificado el gel se los tapa y se los conserva a 4 ºC. Buffer de citrato de sodio (ph 8.2): Citrato de sodio... 5 mg Solución fisiológica ml Colorante: Coomassie brillant blue R (Sigma R-250) 0.30 gr Solución decolorante ml Solvente: Alcohol etílico ml Ácido acético glacial ml Agua destilada ml Al preparar el colorante, se debe disolver primero en el alcohol el Coomassie brillant blue R, luego se agregan el acético y el agua juntos. Dejar madurar por lo menos una noche con buena agitación. Guardar en frasco bien cerrado.