CARACTERIZACIÓN DE CULTIVOS INICIADORES EN

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1 CARACTERIZACIÓN DE CULTIVOS INICIADORES EN PRODUCTOS CÁRNICOS. PARTE 2 Tatiana Beldarraín*, Yamira Cepero, Aster Bruselas, Ramón Santos, Magdalena Ramos, Yamilé Moya, Margarita Núñez y Norma Vergara Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia Carretera al Guatao, km 3½, C.P , La Habana, Cuba tatiana@iiia.edu.cu RESUMEN Se evaluaron las propiedades tecnológicas de 5 cultivos iniciadores en carne de cerdo. Para ello, se prepararon concentrados de cada cultivo iniciador a 1 y a 2 %. Cada concentrado celular se inoculó a 800 g de carne de cerdo con aditivos. Se empleó un diseño experimental con 2 variables independientes: cultivo iniciador y concentración y se prepararon 11 variantes: var. 1, mezcla de -Leuconostoc pentosus a 1 %; var. 2 mezcla de -Pediococcus pentasaceus al 1 %, var. 3 mezcla de Staphylococcus carnosus-lactobacillus plantarum a 1 %; var. 4 Lactobacillus casei a 1 %, var. 5 Lactobacillus acidophillus a 1 %; var. 6 mezcla de - Leuconostoc pentosus al 2 %, mezcla de Staphylococcus carnosus-pediococcus pentasaceus a 2 %; var. 7, mezcla de -Lactobacillus plantarum a 2 %; var. 9, Lactobacillus casei a 2 %; var. 10, Lactobacillus acidophillus a 2 % y var. 11, carne sin inóculo. Las mezclas se incubaron a 16 ± 2 ºC y se midió la viabilidad del cultivo, el ph, y el conteo de enterobacterias a 0, 24, 48, 72, 96 y 120 h. Las var. 7, 8, 9 y 10 produjeron la mayor disminución del ph y del número de enterobacterias presentes. Palabras clave: cultivo iniciador, bacteria ácido-láctica, caracterización. ABSTRACT Meat products starters characterization. Part II Technological properties of 5 starters in pork meat were evaluated. 2 concentrations of each starter were prepared: 1 and 2%. Each cellular concentrate was inoculated at 800 g of pork meat and additives. An experimental design was applied with 2 independent variables: starters and different concentrations: 1 and 2 % and 11 variants were studied: var. 1, 1% of -Leuconostoc pentosus mixture; var. 2, 1% of mezcla de St carnosus-pediococcus pentasaceus mixture; var. 3, 1% of St. carnosus-lactobacillus plantarum mixture, var. 4, 1% of Lactobacillus casei var. 5, 1% of Lactobacillus acidophillus, var. 6, 2% of St. carnosus- Leuconostoc pentosus mixture; var. 7, 2% of St carnosus- Pediococcus pentasaceus mixture; var. 8, 2% of St. carnosus- Lactobacillus plantarum; var. 9, 2% of Lactobacillus casei; var. 10, 2% of Lactobacillus acidophillus and var. 11, pork meat without inoculum. They were incubated 16 ± 2 ºC and 0, 24, 48, 72, 96 and 120 h after formulation were sampled. Starter viability, ph and Enterobacteriaceae counts were determined. Var. 7, 8, 9 and 10 produced bigger decrease of the ph and Enterobacteriaceae counts in the pork meat. Key words: starters, lactic acid bacteria, characterization. INTRODUCCIÓN *Tatiana Beldarraín Iznaga: Licenciada en Microbiología (U.H., 1996). Especialista en Carne y Productos Cárnicos (IIIA, 1999). Máster en Ciencia y Tecnología de los Alimentos (IFAL, 2006). Investigador Agregado del grupo de Ciencias de la Vicedirección de Carne. Labora en la Calidad Microbiológica de Productos Cárnicos e Higiene de Plantas Procesadoras de Alimentos. Los cultivos iniciadores son microorganismos que se presentan en estado puro o mixto, seleccionados de acuerdo con sus propiedades específicas y que se agregan a los alimentos con objeto de mejorar su aspecto, aroma y sabor (1). Ellos se instauran como flora predominante y excluyen la indeseable, por lo cual poseen efecto conservador frente a microorganismos patógenos y deteriorantes. Aunque el mecanismo de inhibición no se conoce exactamente, probablemente es debido a la Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 3,

2 acción simultánea de varios factores como son el bajo ph, la producción de ácidos orgánicos y peróxido de hidrógeno, la excreción de antibióticos y bacteriocinas al medio y la competencia por los nutrientes (2). Un buen microorganismo iniciador para un producto cárnico, es aquel que agregado directamente a la masa cárnica mejore la vida útil del producto y aumente la aceptabilidad de este (3). La mayoría de los microorganismos adicionados como iniciadores en productos cárnicos tienen un doble objetivo: modificar las características sensoriales de la carne y eliminar otros microorganismos indeseables actuando como cultivos protectores (4). A la hora de elegir una cepa como cultivo iniciador es determinante que posea una rápida producción de ácido láctico, que se desarrolle a diversas temperaturas y que sea homofermentadora, puesto que la producción de gas y otros productos diferentes al ácido láctico, como consecuencia de la fermentación, contribuyen a la formación de aromas desagradables y otros defectos de textura y color. Además, deben persistir durante todo el proceso y tener actividad antagónica contra patógenos y otros microorganismos tecnológicamente indeseables, entre otros beneficios (5). MATERIALES Y MÉTODOS La Tabla 1 presenta cultivos que se utilizaron para este trabajo, los cuales se recibieron en medio agar leche, se reactivaron mediante siembra en caldo APT (6) para lograr una buena población celular, se incubaron a 30 ºC durante 16 a 18 h y se conservaron en refrigeración entre resiembras consecutivas. Además, para garantizar el control de la composición de los cultivos, se realizaron exámenes microscópicos mediante tinción simple en azul de metileno. Para la elaboración de los cultivos industriales a 400 ml de caldo APT se le adicionaron individualmente 2 concentraciones de cada cultivo. Las concentraciones empleadas fueron 1 y 2 %, tomando en consideración los resultados informados por investigadores acerca de este tema (5, 7, 8). Los frascos Enlermeyer se incubaron durante 16 h a 30 ºC. Al cabo de este tiempo se centrifugó a 5000 rev/min durante 15 min, empleando una centrífuga marca MSE, se decantó el sobrenadante y la biomasa se suspendió en 24 ml de suero fisiológico (9) y al concentrado celular se le determinó la viabilidad. En el banco de cepas del IIIA se recibieron varios cultivos bacterianos para la producción de embutidos fermentados siendo de interés su caracterización para aplicarlos en la elaboración de estos productos. El objetivo del presente trabajo fue evaluar las propiedades tecnológicas de cultivos iniciadores en carne de cerdo. Tabla 1. Composición microbiológica de los cultivos empleados Código Composición Procedencia 1 Leuconostoc pentosus 2 Pediococcus pentasaceus 3 Lactobacillus plantarum 4 Lactobacillus casei 5 Lactobacillus acidophillus 36 Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 3, 2008

3 Con el objetivo de evaluar el comportamiento de los cultivos industriales en carne de cerdo, cada concentrado celular se le inoculó a 800 g de carne cerdo molida a la cual se le adicionó 1,8 % de sal común, 1 % de glucosa y 0,25 % de sal de cura (9). Se empleó un diseño experimental con 2 variables independientes: cultivo iniciador y concentración y se prepararon 11 variantes: var. 1, mezcla de - Leuconostoc pentosus a 1 %; var. 2, mezcla de -Pediococcus pentasaceus a 1 %; var. 3, mezcla de - Lactobacillus plantarum a 1 %; var. 4, Lactobacillus casei a 1 %; var. 5, Lactobacillus acidophillus a 1 %; var. 6, mezcla de - Leuconostoc pentosus al 2 %; var. 7, mezcla de -Pediococcus pentasaceus a 2 %; var. 8, mezcla de - Lactobacillus plantarum a 2 %; var. 9, Lactobacillus casei a 2 %; var. 10, Lactobacillus acidophillus a 2 % y var. 11, carne sin inóculo. Las variantes se incubaron a 16 ±2 ºC que es el rango recomendado para la aplicación tecnológica de estos cultivos (9). El proceso de fermentación de la carne con diferentes cultivos se evaluó mediante determinaciones de ph, viabilidad del cultivo y conteo de enterobacterias (CE) (agar violeta rojo bilis, 37 ºC, 16 a 24 ºC), realizando mediciones a tiempo 0, 24, 48, 72, 96 y 120 h. Paralelamente se evaluó la carne sin inocular. Se realizaron 4 réplicas experimentales de cada prueba. Los resultados se procesaron empleando un análisis de varianza de clasificación doble y prueba de comparación de rangos múltiples de Duncan, ambos para p < 0,05. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La Tabla 2 presenta las características microscópicas de los cultivos, así como las viabilidades alcanzadas. Se corrobora que todos los cultivos presentaron características propias de las cepas que los componen y en ninguno de los casos se observó presencia de células ajenas. Todos los cultivos alcanzaron viabilidades de entre 7 y 8 unidades logarítmicas, lo que es importante pues deben competir con la flora presente en la carne y por lo tanto esta es una especificación imprescindible. Luego de la centrifugación, el concentrado tenía 10 unidades log lo que demostró la eficacia del método y permitió alcanzar niveles en la carne entre 7 y 8 unidades log, población que garantiza un proceso de fermentación adecuado (9). Tabla 2. Características microscópicas, viabilidades y población celular de los cultivos en carne Viabilidad cultivo en carne (Log 10 Viabilidad concentrado (Log 10 Cultivo iniciador Morfología celular Viabilidad cultivo puro (Log10 7,94 (0,36) 10,71 (1,12) 7,56 (0,26) Bacilos cortos y cocobacilos, agrupados en duplas abundantes y cocos en racimos. Mezcla destaphylococcus carnosus-pediococcus 8,49 (0,42) 10,35 (0,48) 8,12 (0,15) Cocos en parejas y tétradas y cocos en racimos. 8,46 (0,28) 10,54 (0,82) 8,28 (0,34) Mezcla de bacilos largos y cortos y cocos en racimos. pentasaceus Mezcla de Leuconostoc pentosus- Mezcla de Staphylococcus carnosus-lactobacillus plantarum 8,34 (0,41) 10,48 (0,73) 7,95 (0,48) L. casei Bacilos alargados, típicos de bacterias ácido lácticas aislados. 8,40 (0,56) 10,22 (0,74) 8,16 (0,52) Lactobacillus acidophillus Bacilos alargados y filamentosos, típicos de bacterias ácidolácticas. Desviación estándar entre paréntesis. Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 3,

4 La Fig. 1 muestra el comportamiento del conteo de enterobacterias de las mezclas cárnicas con los cultivos en sus diferentes dosis. Como se puede observar, conforme pasa el tiempo, hay una disminución del conteo de enterobacterias, con independencia del tipo de cultivo. Esta disminución es mucho más marcada en todos los cultivos con dosis de 2 %. A las 120 h se encontró presencia de enterobacterias en las variantes 1, 2, 3, 4, 5, o sea, en las que los porcentajes de adición eran de 1 %, así como en la var. 6, que es una mezcla de -Leuconostoc pentosus en dosis de 2 % y en la materia prima cárnica sin inóculo. No se encontró presencia de enterobacterias en las variantes 7, 8, 9 y 10, lo que se corresponde con los cultivos empleados en sus dosis superiores. La Tabla 3 presenta los valores del efecto del tipo de cultivo y sus dosis sobre el contenido de enterobacterias en la carne de cerdo y se encontró que para la diferencia entre t = 0 y t = 96 h existen diferencias significativas a p <0,05 con el tipo de cultivo, la concentración así como la interacción de ambos. La prueba de rangos múltiples de Duncan mostró diferencias significativas (p <0,05) entre las dosis estudiadas independientemente del tipo de cultivo. De igual forma, entre las variantes 1, 2 y 4 existen diferencias significativas (p <0,05) pero no hay diferencias significativas (p <0,05) al emplear las variantes 7, 8, 9 y 10. Recuentos de enterobacterias (log 10 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 var 1 var 2 var 3 var 4 var 5 var 6 var 7 var 8 var 9 var 10 var 11 0, Tiempo (h) Fig. 1. Valores medios de los recuentos de enterobacterias a diferentes tiempos. Tabla 3. Efecto del tipo de cultivo y sus dosis sobre el contenido de enterobacterias en la carne de cerdo(log 10 (Diferencias logarítmicas) variantes Dosis (%) CE (t=0 h) CE (t=120 h) Diferencia logarítmica 1 1 4,18 (0,16) 2,25 (0,21) 1,92 a 2 1 4,18 (0,16) 1,24 (0,28) 2,93 cd 3 1 4,18 (0,16) 1,51 (0,07) 2,66 c 4 1 4,18 (0,16) 1,92 (0,24) 2,26 b 5 1 4,18 (0,16) 1,27 (0,21) 2,90 cd 6 2 4,18 (0,16) 1,85 (0,22) 2,33 b 7 2 4,18 (0,16) 1 3,17 d 8 2 4,18 (0,16) 1 3,17 d 9 2 4,18 (0,16) 1,05 (0,10) 3,12 d ,18 (0,16) 1 3,17 d n = 4. Desviación estándar entre paréntesis. Letras diferentes indican diferencias significativas para p<0, Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 3, 2008

5 La Fig. 2 muestra que con respecto a los valores de ph alcanzados en las mezclas (se encontraron diferencias significativas (para p < 0,05) con la dosis, el tipo de cultivo y la interacción entre ambos. La prueba de rangos múltiples de Duncan mostró diferencias significativas en el comportamiento del ph entre los cultivos 1 y 4 a 1 %, respecto a 3, 2 y 5 que, en la misma dosis, produjeron una mayor variación del ph en la mezcla cárnica. Mediante esta fermentación se pudo comprobar que los cultivos 2, 3, 4 y 5 en dosis de 2 % son los que producen mayor disminución del ph y del número de enterobacterias presentes en la materia prima. CONCLUSIONES Mediante la fermentación de mezclas cárnicas se pudo comprobar que los cultivos - Pediococcus pentasaceus, St carnosus- Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei y Lactobacillus acidophillus, empleados a concentraciones de 2 % son los que producen mayor disminución del ph y del número de enterobacterias presentes en la materia prima, lo que los avala para su empleo como cultivo iniciador en productos cárnicos. Valores medios de ph 7,00 6,80 6,60 6,40 6,20 6,00 5,80 5,60 5,40 var 1 var 2 var 3 var 4 var 5 var 6 var 7 var 8 var 9 var 10 var 11 5,20 5, Tiempo (h) Fig. 2. Valores medios del ph en las mezclas cárnicas a diferentes tiempos. REFERENCIAS 1. Leistner, L. y Echardt, C. Fleischwirtschaft 59, , Gaya, D.; Medina, M.; Bautista, L. y Núñez, M. Int. J. Food Microbiol. 6: , Silla, M. Rev. Agroquím. Technol. Aliment., 29: 1-14, Rovira, J. Profiles on Biotechnology, 50: , Morales, J. Elaboración de un embutido fermentado utilizando carne de cerdo, de ave y texturizado de soya. (tesis de Doctorado en Ciencias de los Alimentos. Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de la Habana. Cuba) 2004, 146 pp. 6. Anón. Catálogo de medios de cultivo. Ed Centro Nacional de Biopreparados, La Habana, 2006, 45 pp. 7. Mata, C.; Ferreira, J.; Fernández-Salguero, J.; Gómez, R. Eurocarne 97: 1, Katikou, P.; Ambrosiadis, I.; Georgantelis, D.; Koidis, P.; Georgakis, S.A. J. of Applied Microbiol. 99: 1303, Fernández, M.; Valladares, C.; Herrera, H.; Fernández, C.; Ramos, R. Monografía. Centro de Documentación e Información. Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia, La Habana, Vignolo, G.; Pesce, A. y Oliver, G. J. Food Prot. 51 (6): 481, Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 3,