Proyecto Genoma Humano

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José Miguel Castro Ortíz
hace 6 años
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1 Proyecto Genoma Humano 1 Génesis y desarrollo del proyecto 2 Estrategias de secuenciación del genoma: secuenciación aleatoria y jerárquica 3 Contenido en CG 4 Islas CpG 5 Tasas de recombinación 6 Elementos transponibles 7 Contenido en genes 8 El Proyecto ENCODE Referencias: Brown 2007, págs y Lander et al. 2001, Nature 409: El Proyecto Genoma Humano 1. Consorcio de 20 laboratorios públicos pertenecientes a 6 países. Liderado por F. S. Collins y E. Lander. 2. Discusión y debate en la comunidad científica Iniciativa: Departament of Energy y National Institutes of Health (US). Comienzo del proyecto: Borrador: Oct Publicación: Feb Finalización: Octubre Secuenciación aleatoria jerárquica (Hierarchical Shotgun Sequencing) o secuenciación clon a clon. 4. Material: DNA obtenido de donantes anónimos. La identidad de los donantes no es conocida (ni siquiera por ellos mismos). 5. Los datos se han hecho públicos a través de los bancos públicos de datos sin ninguna restricción a medida que se progresaba en el proyecto. 6. Publicación: Nature 409: (15 febrero 2001); Nature 431: (21 Octubre 2004). 1

Celera Sequencing Project 1. Celera Genomics. Empresa privada de biotecnología que dirige J. Craig Venter y cotiza en bolsa. 2.

Ensamblaje del borrador: 1 Oct 2000. 3. Estrategia: Secuenciación aleatoria del genoma (Wholegenome shotgun sequencing). 4.

De ellos se seleccionaron 5 sujetos (dos hombres y tres mujeres): 2 caucásicos, un afroamericano, un asiático (chino) y un hispano (mejicano). 5. Condiciones para el acceso a los datos mediante acuerdo entre Science y Celera Genomics.

2 Celera Sequencing Project 1. Celera Genomics. Empresa privada de biotecnología que dirige J. Craig Venter y cotiza en bolsa. 2. Anuncio del proyecto: Comienzo de la secuenciación: 8 Sep Finalización de la secuenciación: 17 Jun Ensamblaje del borrador: 1 Oct Estrategia: Secuenciación aleatoria del genoma (Wholegenome shotgun sequencing). 4. Material: Se reclutaron 21 donantes voluntarios. De ellos se seleccionaron 5 sujetos (dos hombres y tres mujeres): 2 caucásicos, un afroamericano, un asiático (chino) y un hispano (mejicano). 5. Condiciones para el acceso a los datos mediante acuerdo entre Science y Celera Genomics. Los datos está a disposición de los investigadores a partir de la fecha de publicación a través de la Web de Celera y con ciertas restricciones. 6. Publicación: Science 291: (16 febrero 2001). Eric Lander Francis Collins 2

3 Graig Venter Hierarchical Shotgun Sequencing 3

4 Whole-genome shotgun sequencing Características de una genoteca genómica Número de clones (N). Tamaño promedio (a) y varianza del inserto. Redundancia teórica (R = Na/b). Aleatoriedad (randomness): representación de secuencias genómicas diana. Completa (completeness): si todas las secuencias diana en el genoma está representadas en la genoteca. Fidelidad (fidelity): medida en que los insertos de los clones son copias fieles de las secuencias del genoma. 4

5 P = 1 - (1 a/b) N 1 e -Na/b = 1 e -R N = ln (1 P)/ln (1 a/b) R - ln (1 P) donde N = número de clones; a = tamaño promedio del inserto; b = tamaño del genoma; R = redundancia teórica (Na/b); P = probabilidad de que una región dada esté incluida en la genoteca. RPCI = Roswell Park Cancer Institute, Buffalo (NY) Caltech = California Institute of Technology, Pasadena (California) 5

6 Dos métodos de cartografía física para detectar solapamiento entre clones genómicos Ensamblaje de clones mediante fingerprinting 6

7 Secuenciación de un clon kb Fase 1. Secuenciación aleatoria Construcción de una genoteca aleatoria en plásmido -> colección de clones 1-2 kb de tamaño promedio. Secuenciación de uno o ambos extremos de un cierto número de clones -> colección de lecturas ( reads ). Ensamblaje de las lecturas -> un cierto número de contigs con huecos ( gaps ) entre ellos. Fase 2. Finalización (corrección de errores y rellenado de huecos mediante secuenciación dirigida) Calidad de una secuencia (PHRAP score) P = Probabilidad de error de cada base Q = Calidad de una base Q = - 10 log10 P Al iniciar un proyecto de secuenciación es conveniente fijar cual es el objetivo: la calidad de la secuencia final a obtener. De ella depende la redundancia necesaria. Q = 20, 30 y 40 corresponden a P = 1%, 0,1% y 0,01%. 7

8 Secuenciación de un clon kb Base-calling. PHRED permite obtener la probabilidad de error de cada base. Ensamblaje. PHRAP permite ensamblar las lecturas en contigs. Edición. CONSED permite visualizar el ensamblaje y la secuencia consenso así como calcular la probabilidad de error de cada base en la secuencia consenso. Finalización. AUTOFINISH permite dirigir toda la operación de finalización basándose en la calidad de cada base. Borrador 7 Octubre 2000 Cartografía. Ensamblaje de los clones BAC (por fingerprinting) en 1246 contigs. Secuenciación y ensamblaje de clones que representan un total de 4,26 Gb de secuencia. Las secuencias brutas subyacentes suponen un total de 23 Gb (promedio 7.5x). 8

9 Fingerprint Sequenced- Gaps between clone contigs clone contigs sequence contigs El borrador del genoma humano ( ) representa el 88% de todo el genoma y un 93% de la eucromatina 9

10 Range: 31-65% (20-kb windows) Mean: 41% SD: 5.2% 10

11 Mapa genético humano: microsatélites (Broman et al. 1998) El Centre d Études du Polymorphisme Humaine (CEPH) mantiene una colección de lineas celulares en cultivo de familias numerosas (3 generaciones) 11

12 DNA repetitivo en el genoma humano i. Repeticiones derivadas de elementos transponibles (repeticiones dispersas) ii. iii. iv. Pseudogenes procesados (copias inactivas de genes celulares producto de retrotranscripción) Microsatélites o repeticiones de secuencia simple como (A)n, (CA)n o (CGG)n Duplicaciones segmentales ( kb) v. Grandes bloques de secuencias altamente repetidas en tándem (centrómeros y telómeros) 12

13 Elementos transponibles en el genoma humano bp bp 13

14 Contribución de los elementos transponibles al genoma de diversas especies Elementos H. sapiens D. melanogaster C. elegans A. thaliana LINE/SINE 33.40% 0.70% 0.40% 0.50% LTR 8.10% 1.50% 0.00% 4.80% DNA 2.80% 0.70% 5.30% 5.10% Total 44.40% 3.10% 6.50% 10.50% 14

15 Mutaciones causadas por la inserción de elementos transponibles En Drosophila, ~50% de las mutaciones morfológicas clásicas (por ejemplo, white) están causadas por la inserción de elementos transponibles. En el raton, 10% de las mutaciones espóntáneas están causadas por transposiciones. En humanos, 1/600 de las mutaciones espontáneas están causadas por la inserción de elementos transponibles. Genes que cifran RNA no codificante en el genoma humano. Genes de RNA Número esperado Número Observado Genes relacionados (pseudogenes, fragmentos, parálogos) trna S rrna S rrna S rrna S rrna snorna snrna (U1-U12)?? SL RNA

Características de los genes humanos que codifican proteínas (10.272 mrnas en la base de datos RefSeq alineados con el borrador del genoma, Lander et al.

16 Características de los genes humanos que codifican proteínas ( mrnas en la base de datos RefSeq alineados con el borrador del genoma, Lander et al. 2001) Característica Mediana Promedio Tamaño muestra Tamaño exones 122 bp 145 bp Número exones Tamaño intrones bp bp UTR 400 bp 770 bp 689 (crom. 22) 5 UTR (crom. 22) Secuencia codificadora bp bp (CDS) 367 aa 447 aa Extensión genómica 14 kb 27 kb Comparación de los genes humanos con los de Caenorhabditis y Drosophila 16

Correlación entre la densidad génica y el contenido en CG Estrategias para la identificación n de genes Programas informáticos diseñados para la predicción ab initio de

17 Correlación entre la densidad génica y el contenido en CG Estrategias para la identificación n de genes Programas informáticos diseñados para la predicción ab initio de exones e intrones. Similaridad de la secuencia (del DNA o de la proteína) con genes previamente conocidos. Evidencia directa de transcripción proporcionada por mrnas o ESTs. 17

18 Genes detectados por el Proyecto Genoma Humano (IGI/IPI ver 1) Método Número de genes Longitud promedio (aa) Genes conocidos (RefSeq/SwissProt/TrEMBL) Ensembl (Genscan + similaridad con prot, EST y mrna de cualquier organismo) + Genie Ensembl Total Evaluación de IGI/IPI IGI contains 19/31 (61%) novel genes in the human genome. Fragmentation rate = % of mouse cdnas showed similarity to the human genome seq whereas only 69% showed similarity to IGI suggesting a sensitivity 69/81 = 85%. 477 IGI gene predictions were compared to 539 confirmed genes and 133 pseudogenes on chr (9%) hit 34 pseudogenes (fragmentation rate = 1.2). 63 (13%) did not overlap any current annotation. Assuming a rate of overprediction of 20% and a rate of fragmentation of 1.4, the IGI would be estimated to contain actual human genes. Assuming that the gene predictions contains only 60% of previously unknown human genes, the total number of genes in the human genome would be

19 Estimas del número n de genes existentes en el genoma humano (2001) Método Estima Autores Cinética de reasociación Lewin 1980 Tamaño del genoma/tamaño del gen W. Gilbert (Lewin 1990) Número de islas CpG Antequera and Bird Número de EST Ewing and Green 2000; Liang et al Asociación de EST e islas CpG Dickson 1999 Comparación del genoma humano Roest Crollius et al con el de Tetraodon nigroviridis Extrapolación de los cromosomas Dunham 2000 y Análisis inicial del genoma humano Lander et al Análisis inicial del genoma humano Venter et al Genoma Humano (versión 21-Oct-2004) Se han conseguido secuenciar Mb (99% de la eucromatina). La tasa de error es 1/ bases (Q = 50). Se ha reducido el número de gaps (huecos) de ~ a sólo 341. De ellos, 33 (total ~198 Mb) en la heterocromatina y 308 (total ~28 Mb) en la eucromatina. Tamaño total: = Mb. Número de genes: ( genes conocidos predicciones). Pseudogenes: ~

20 Segmental duplications comprise ~5.3% of the euchromatic genome El proyecto ENCODE El proyecto ENCODE (Encyclopedia od DNA elements) pretende identificar TODOS los elementos funcionales de la secuencia del genoma humano. Fase piloto. Análisis detallado de 44 regiones discretas repartidas por todo el genoma que suman ~30 Mb (~1%). Fase de desarrollo tecnológico. Fase de producción. Aplicación de las técnicas desarrolladas en la fase anterior al restante 99% del genoma. 20

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