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1 Observaciones previas: Con carácter general, los formatos de los productos deberán estar orientados para su difusión a través de internet y, específicamente deberán incluir mensajes susceptibles de difusión a través de mensajes tipo SMS. Algunos de los elementos de funcionalidad y/o diseño a tener en cuenta son: * Adaptación y cumplimiento de lo indicado al respecto de Identidad Corporativa de IFAPA. * Adaptación y cumplimiento de lo indicado al respecto de la información y publicidad de fondos Europeos en Andalucía. * Uso de logos identificativos del Instituto y entidades colaboradoras y financiadoras. * Uso de colores identificativos del Instituto y/o la colección. * Inclusión de fecha de publicación o actualización y de pérdida de vigencia. * Inclusión de la zona de influencia o efectividad del producto ofertado (georreferenciación de áreas, no puntos). * Inclusión de enlaces hacia el portal web IFAPA y/o Consejería a la que esté adscrito el Instituto; así como a webs de reconocido prestigio sobre la temática (preferiblemente públicas). * Identificación de autoría, individual o colectiva, para la favorecer la retroalimentación con el usuario. * Identificación de Fondos Europeos financiadores * Uso de una redacción simple y concreta, adaptada a los destinatarios. * Uso y predominio del carácter visual (imágenes, gráfico, ilustraciones). * Identificación del tipo de licencia de uso libre (Creative Commons,...). Nota: Este documento es un ejemplo o plantilla que intenta facilitar y orientar el trabajo de generación de productos al personal técnico e investigador. No es posible presentar todas las causticas, como por ejemplo en cuestión de logos, denominación, orden y prioridad de entidades participantes, financiadoras, etc) Es responsabilidad del autor y los sucesivos supervisores del producto cumplir con las normas que así se exijan en cada momento, entre otras las indicadas anteriormente.

2 LA IMPORTANCIA DEL USO DE MATERIAL VEGETAL CERTIFICADO EN VITIVINICULTURA 1. Introducción 2. Legislación sanitaria de la vid 3. Impacto de las virosis 4. Por qué es conveniente el empleo de material certificado? 5. Conclusiones 6. Referencias 7. Agradecimientos

3 LA IMPORTANCIA DEL USO DE MATERIAL VEGETAL CERTIFICADO EN VITIVINICULTURA. / [Leonardo Velasco Arjona, Enrico Cretazzo, María J. Alcalá Ramírez]. Málaga. Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural, Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera, p. Formato digital (e-book) - (Protección de Cultivos) Vid - Sanidad Vegetal - Certificación Virus Velasco Arjona, Leonardo Cretazzo, Enrico Alcalá Ramírez, María J. Este documento está bajo Licencia Creative Commons. Reconocimiento-No comercial-sin obra derivada Edita JUNTA DE ANDALUCÍA. Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera. Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural. Málaga, Noviembre de Autoría: Leonardo Velasco Arjona Enrico Cretazzo 1 María J. Alcalá Ramírez IFAPA, Centro de Churriana

4 1. Introducción 2. Legislación 1. Introducción. La vid es un cultivo particularmente regulado. En concreto el estado sanitario del material vegetal está sujeto a una normativa europea que a su vez se ve reflejada en normativa nacional y autonómica. Esta abundante normativa tiene fundamentos técnicos y científicos. No obstante, se ha dejado al criterio de los países comunitarios extender o no la exigencia en cuanto a los organismos incluídos. El incremento en la calidad de la producción vitícola de los últimos años tiene su fundamento -entre otros factores- en la calidad del material vegetal, procedente de selecciones de los clones con mejor aptitud, que son los que se multiplican y en general están disponibles para los productores. Si bien esto ha repercutido en el mejor control de la producción y en la mayor estabilidad de la calidad y cantidad de la producción ha tenido como consecuencia no deseada la pérdida de diversidad de las variedades de vid disponibles. Afortunadamente, en los últimos años se han multiplicado las iniciativas para recuperar variedades locales que aportarán tipicidad y distinción a los productos de determinadas zonas. IFAPA tiene una actividad continúa en la recuperación de variedades minoritarias andaluzas y participa como agente indispensable en las iniciativas de productores, Denominaciones de Origen, y otros agentes en las solicitudes de autorización del cultivo de estas variedades. 2. Legislación sanitaria de la vid en relación a la presencia de patógenos en el material vegetal El material vegetal en especies leñosas está muy regulado en cuanto al control de enfermedades. En el caso particular de la vid las normas que lo regulan son las siguientes: Directiva 68/193/CEE del Consejo, de 9 de abril de 1968, referente a la comercialización de los materiales de multiplicación vegetativa de la vid. Directiva 2005/43/CE de la Comisión de 23 de junio de 2005, que modifica la anterior Directiva. Ley 30/2006, de 26 de julio, de semillas y plantas de vivero y de recursos fitogenéticos.

5 Real Decreto 208/2003, de 21 de febrero, por el que se aprueba el Reglamento técnico de control y certificación de plantas de vivero de vid. Orden APA/2474/2006, de 27 de julio, por la que se modifican determinados anexos del Reglamento Técnico. Real Decreto 170/2011, de 11 de Febrero de 2011 por el que se aprueba el Reglamento General del registro de variedades comerciales y se modifica el Reglamento General técnico de control y certificación de semillas y plantas de vivero. 2. Legislación Real Decreto 740/2015, de 31 de julio de 2015, por el que se regula el potencial de producción vitícola, y se modifica el Real Decreto 1079/2014, de 19 de diciembre, para la aplicación de las medidas del programa de apoyo al sector vitivinícola. Qué dice el Reglamento? 1. Las cepas madre de material de multiplicación certificado tendrán comprobado mediante inspección oficial: a) Que se han constituido directamente con material de multiplicación base. b) Que corresponden a la variedad. c) Que se encuentran libres de organismos nocivos. Respecto de los organismos GFLV, GLRaV-1 y GLRaV-3 del anexo III, la inspección se basará en los resultados de análisis fitosanitarios realizados mediante muestreo. d) Que mantienen su estado sanitario. Para ello se confirmarán los resultados de los análisis antes citados mediante los resultados de análisis fitosanitarios realizados mediante muestreo cada diez años respecto de los organismos GFLV, GLRaV-1 y GLRaV-3 del anexo III. 2. Las plantas infectadas deberán eliminarse. La proporción de faltas debidas a los organismos nocivos GFLV, GLRaV-1 y GLRaV-3 del anexo III no podrá sobrepasar el 5%.

6 3. Los motivos de las faltas de plantas, ya sean atribuibles a los organismos nocivos citados 3. Impacto de las virosis anteriormente o a otros factores, deberán constar en el expediente en el que se archive la documentación relativa a las cepas madre. 4. Las cepas madre de certificada deberán mantenerse en condiciones de asegurar su aislamiento de organismos nocivos, estarán aisladas al menos treinta metros de cualquier viñedo o vivero vitícola. Patógenos sancionados en el material vegetal de la vid según la legislación vigente Nematodos: Xiphinema sp.; Longidorus sp. Ácaros: Phillocoptes vitis, etc. Cochinillas: Pseudococcus citri y Quadraspidiotus perniciosus Podredumbres: Armillariella mellea Excoriosis: Phomosis sp. Eutiopiosis: Eutypa armeniaca Yesca: Estereum sp. Bacteriosis: Xanthomonas ampelina Virosis: Entrenudo corto (GFLV) Enrollado, razas (especies) 1 y 3 (GLRaV-1, GLRaV-3) Jaspeado (GFkV) (sólo en el caso de patrones)

7 3. Por qué esta regulación? Impacto de las virosis de la vid en 3. Impacto de las virosis viticultura Se han descrito muchas especies de virus y viroides de la vid (para una descripción reciente y completa ver Martelli, 2014), pero sólo algunas son consideradas de importancia económica. Los consideradas más graves son las siguientes: nepovirus (GFLV), enrollados (GLR), jaspeado (GFkV) y virus del complejo de la madera rugosa (RW). Entre las enfermedades y plagas que afectan a la vid los virus quedan muchas veces olvidados. Sin embargo sus efectos son peores de lo que se considera habitualmente. Y sobre todo no se pueden curar ni tratar una vez la planta se infecta. a) ENTRENUDO CORTO INFECCIOSO (GFLV) El entrenudo corto infeccioso o degeneración infecciosa es la enfermedad vírica de la vid más extendida mundialmente junto con el enrollado. Dos tipos de síndromes se pueden distinguir dependiendo de la raza del virus: Malformaciones en hojas (denticulaciones, moteados cloróticos, asimetrías, etc.), tallos (entrenudos más cortos, ramas anormales, dobles nudos, fasciaciones) y racimos (menores y en menor número, maduración irregular de los granos). Mosaicos amarillos, causados por las razas cromogénicas. Son decoloraciones de color amarillo brillante que afectan a todas las partes vegetativas. Los racimos igualmente se ven afectados en tamaño y número

8 3. Impacto de las virosis Fig. 1. Síntomas de GFLV en plantas de vid b) ENROLLADO DE LA VID (GLR) Los principales efectos observados son: Reducción en producción unitaria. Maduración irregular. Alteración en contenido de polifenoles. Reducción en acumulación de azúcares en baya. Alteraciones en el color de las bayas (antocianos).

9 3. Impacto de las virosis Fig. 2. Síntomas de GLR (enrollado) en plantas de vid tintas. Son todos los virus del enrollado igual de importantes? Desde el punto de vista legal no: La legislación europea sólo obliga a un mínimo para el material base de multiplicación: GLRaV-1 y GLRaV-3. En España sólo se considera el mínimo impuesto en la UE: GLRaV-1 y GLRaV-3. Otros países como Italia también incluyen a GLRaV-2. En Australia (p.e.) son mucho más exigentes: no se distingue ente los virus causantes del enrollado. Desde el punto de vista sanitario sí: Aparentemente todos los virus causantes del enrollado causan daños semejantes, pero epidemiológicamente el clade I de los Ampelovirus (GLRaV-1 y GLRaV-3) está mucho más distribuida.

10 Las diferencias en incidencia de las distintas especies de virus causantes del enrollado probablemente se deben a la eficiencia de la transmisión natural y a la capacidad multiplicativa del virus (Velasco et al., 2014). c) VIRUS DEL JASPEADO (GFkV) No existe una sintomatología específica excepto en Vitis rupestris. Las hojas pueden presentar encorvamientos hacia el haz y decoloraciones puntuales entre los nervios de 3º y 4º orden. El 3. Impacto de las virosis sistema radicular suele ser más escaso. GFkV está latente en muchas variedades y patrones en España y otros países. En nuestra experiencia su incidencia es muy alta en las distintas zonas vitivinícolas. Sus efectos más importantes son las incompatibilidades patrón-injerto que provoca. No se conocen vectores naturales de GFkV, aunque se sospechan ciertos insectos sin que haya una demostración fehaciente. Fig. 3. Síntomas de GLR (enrollado) en plantas de vid.

11 d) VIRUS DEL COMPLEJO DE LA MADERA RIZADA (RW) serie de indicadores (Vitis rupestris, LN 33 y Kober 4B) y está constituido por distintas especies de virus (GVA, GVB, GVD, GLRaSV, ), todos con la capacidad de inducir daños similares. 3. Impacto de las virosis El complejo RW consiste en cuatro síndromes diferentes que se distinguen empleando una Los síntomas característicos son acanaladuras y hendiduras en los tallos y ramas, acorchamiento de la corteza. Suele estar latente en vides sin injertar, pero se manifiesta en las cepas injertadas (incluso en autoinjertos), causando incompatibilidad del injerto, disminución drástica de la producción y eventualmente muerte de la planta. Las fuentes de transmisión son el material clonal por los propios viticultores y los viveristas, pues esta enfermedad no está contemplada por la ley. En campo la transmisión es por cochinillas algodonosas (Planococcus, Pseudococcus). Fig. 4. Acanaladuras e incompatibilidades de injerto causadas por virus del complejo RW.

12 Cómo se hace el diagnóstico de los virus de la vid? La inspección visual es poco fiable: es frecuente que las plantas no muestren síntomas, y si lo hacen suele ser en épocas particulares: envero, época de maduración e incluso después. Lo más indicado, por tanto, es realizar un diagnóstico específico mediante análisis ELISA y/o tests moleculares (PCR, qpcr) (Fig. 5).

13 3. Impacto de las virosis Fig. 5. Resultado de un diagnóstico de GLRaV-3 en muestras de vid mediante test ELISA (izda) y de qpcr (dcha). Para la Certificación Oficial de un clon concreto de una variedad, la norma admitida actualmente exige que el análisis sanitario se realice por dos vías: a) Indexaje (injerto) sobre plantas indicadoras que manifestarán los síntomas por los virus portados por la variedad que se está analizando. Este indexaje se realiza en un campo experimental y se desarrolla a lo largo de tres años, período durante el cual se evalúan los síntomas en las indicadoras. El inconveniente de este método es que es muy lento y exije un personal adecuadamente entrenado y experimentado. b) Análisis mediante ELISA, PCR, qpcr. Este diagnóstico es analítico, más específico, y aunque es rápido tiene el inconveniente de que n o es exhaustivo: pueden existir variantes de un determinado virus que no se puedan detectar, cosa que en principio no ocurre con el indexaje. Este proceso es necesario tanto para la autorización oficial de multiplicación de un clon concreto de una variedad ya autorizada, como de solicitar la autorización de una variedad nueva en una Comunidad Autónoma determinada.

14 El futuro del diagnóstico de los virus de la vid para certificación Como se ha señalado, la certificación de un clon de una variedad (o autorización de una nueva variedad) es un proceso muy prolongado en el tiempo por la exigencia de la inspección de síntomas en plantas indicadoras a lo largo de tres años. El sector vitivinícola tanto español, como en otras partes del mundo entiende que este período es muy prolongado y merma la capacidad de adaptarse a las demandas del mercado cuando se pretende introducir una nueva variedad en una zona. Actualmente se está considerando una alternativa 3. Impacto de las virosis tecnológica para acelerar el proceso de certificación de los clones de la vid (y de otras leñosas en general). 4. Por qué la certificación? Esta tecnología se basa en la secuenciación masiva del RNA de las muestras y su análisis bioinformático mediante lo que se ha dado en llamar Next Generation Sequencing (NGS). El resultado de este tipo de análisis daría la lista completa de los patógenos presentes en una muestra concreta. Aunque el coste de este tipo de análisis es elevado, los resultados estarían disponibles en unos tres meses desde que se recibe la muestra en el laboratorio, lo que reduciría enormemente el tiempo necesario para certificar el material. Esta tecnología está aún en fase de investigación y está dando resultados extraordinarios. Es cuestión de tiempo que se admita como método oficial para la certificación de leñosas. En nuestro laboratorio hemos puesto a punto esta metodología para el análisis y caracterización de patógenos (virus y viroides) en la vid (Velasco et al., 2015). 4. Por qué es necesario utilizar material certificado? La autorización de nuevas plantaciones, de acuerdo con el Real Decreto 740/2015, de 31 de julio de 2015, por el que se regula el potencial de producción vitícola, requiere que el material vegetal sea de variedades autorizadas. De hecho, está estrictamente prohibida la plantación de variedades no autorizadas (inscritas en la clasificación del anexo XIX del mencionado RD en su versión más reciente). Las variedades autorizadas lo son en tanto en cuanto hay clones certificados disponibles.

15 Evitamos sorpresas: el material no es el que se supone (variedad distinta). Evitamos problemas de incompatibilidad en cambios de variedad por sobreinjerto: virus como GLRaV-2, GfkV. Evitamos problemas de enfermedades virus, hongos de madera, bacteriosis. La utilización de material certificado es escasa en las regiones españolas 4. Por qué la certificación? Bien porque no existe material certificado de una variedad (si está autorizada debe existir alguno) No se distribuyen o comercializan, a pesar de existir clones certificados Bien porque no se considera importante y nos ahorramos el costo del material certificado Sin descartar malas prácticas por parte de los viveristas Un ejemplo doloso: pérdida de cultivo por incompatibilidad de injerto debidos a uno de los miembros del complejo RW (Grapevine virus B, GVB) Los viticultores no están prevenidos frente a este tipo de enfermedades, puesto que además no están contempladas por la legislación y no están instruidos en reconocer los síntomas ni las consecuencias de la misma.durante 2004 y 2005 prospectamos virosis en parrales de uva de mesa en Murcia. En una de las parcelas en las que detectamos previamente GVB, ante el bajo rendimiento de las parras el viticultor decidió talarlas y las injertó con otra variedad resultando tal y como nos manifestó en un índice muy alto de injertos fallidos, consecuencia probable de la enfermedad. Descontrol del material vegetal de vid: GLRaV-3 en Galicia Otro ejemplo de cómo el movimiento descontrolado de material vegetal sin certificar lo tenemos en Galicia. En esta región se cultivan variedades de vid propias (Albariño, Brancellao, Tinta Femia) y otras procedentes de otras regiones de España (Tempranillo, Mencía) y además tiene dos ambientes

16 claramente diferenciados: la costa, con clima suave y el interior con un clima frío continental. Esta diferencia bioclimática influye drásticamente en la incidencia diferencial de los vectores del virus del enrollado GLRaV-3, de manera que en la costa se encuentran ocasionalmente mientras que en el interior no se observan, al no poder establecerse poblaciones en invierno. A pesar de la nula presencia de vectores de GLRaV-3 en zonas interiores de Galicia observamos incidencias similares de este virus. 4. Por qué la certificación? Fig. 6. Ingresos acumulados por hectárea de Albariño en Galicia. E1: Sin virus; E2: 25% de infección; E3: 100% de infección. Se usan dos escalas de precios: (A) con acuerdo de compra (B) considerando las penalizaciones o bonus en la cooperativa [Fuente: Cabaleiro et al., 2013]. El análisis genético nos indicó que no hay diferencias poblacionales entre los aislados del virus de la costa y del interior, u otras consideraciones (variedad, procedencia, etc.). Por tanto, la difusión de GLRaV-3 en Galicia no se debe tanto a los vectores naturales de este virus, sino al intercambio y propagación de material vegetal infectado con virus (Pesqueira et al., 2015). Esto tiene graves repercusiones económicas pues tal y como se ha demostrado en Galicia el enrollado provoca déficit en el contenido de azúcar en la bayas lo que penaliza al productor en el precio que obtiene por sus uvas (Cabaleiro et al., 2013) (Fig. 6).

17 5. Conclusiones La disponibilidad de material certificado es una garantía de calidad de partida en una plantación de vid. Se evita partir de una plantación inicial con problemas que no van a poder ser eliminados, a menos que se proceda al arranque de la parcela y nueva plantación. Un reinjerto no resolvería el problema, puesto que las enfermedades seguiría ahí. E incluso podrían agravarlo al ponerse de manifiesto incompatibilidades de injerto. Actualmente la limitación estriba en la ausencia de clones certificados para todas las variedades. Están disponibles de aquéllas mayoritarias en la mayor parte 5. Conclusiones de los viveros. Para variedades minoritarias lo habitual es el material estándar que no cumple los 6. Referencias IFAPA tiene en marcha una línea de obtención de clones sanos de variedades minoritarias andaluzas mínimos de criterios de estado sanitario. con objeto, por un lado, permitir la autorización oficial de estas variedades que se están recuperando, y por otro de poner a disposición de los viticultores de clones sanos y certificados de esas variedades. 6. Referencias Cabaleiro, C., A. Segura, A., García-Berrios, J. J Effects of Grapevine leafroll-associated virus 3 on the physiology and must of Vitis vinifera L. cv. Albariño following contamination in the field. Am. J. Enol. Vitic : Cabaleiro, C., Pesqueira, A. M., Barrasa, M., Garcia-Berrios, J. J Analysis of the losses due to grapevine leafroll disease in Albariño vineyards in Rías Baixas (Spain). Ciência e Técnica Vitivinícola. 28: Martelli, G. P Directory of virus and virus-like diseases of the grapevine and their agents. J. Plant Pathology, 96: Pesqueira, A. M., Cabaleiro, C., Velasco, L Genetic analysis of grapevine leafroll-associated virus 3 population from Galicia, Spain. Plant Pathology, DOI: /ppa Velasco, L., Bota, J., Montero, R., Cretazzo, E Differences of three ampeloviruses multiplication in plant may explain their incidences in vineyards. Plant Disease, 98:

18 Velasco, L., Cretazzo E., Padilla C.V., Janssen D Grapevine leafroll associated virus 4 strain 9 complete genome and quantitative analysis of virus-derived small interfering RNA populations. J. Plant Pathology, 97: Agradecimientos Parte de los resultados presentados han sido obtenidos en el marco del proyecto Transforma Vid y Vino 6. Referencias 7. Agradecimientos y AVA del Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera (IFAPA) confinanciado al 80% por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER ).

19 Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera Avenida de Grecia s/n Sevilla (Sevilla) España Teléfonos: Fax: webmaster.ifapa@juntadeandalucia.es

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