MEMORIAS XXXVII Congreso Nacional de Control Biológico Mérida, Yucatán, México, 6-7 de Noviembre de 2014

Transcripción

1 PROTOCOLO PARA LA EVALUACIÓN Y EL REFORZAMIENTO DEL PIE DE CRÍA DE Tamarixia radiata (WATERSTON): COMPARACIÓN DE PARÁMETROS BIOLÓGICOS ENTRE POBLACIONES SILVESTRES DEL ESTADO DE JALISCO Y LA COLONIA BAJO CRÍA MASIVA DEL CNRCB Nora I. Vizcarra-Valdez, Jorge A. Sánchez-González, Jaime González-Cabrera, Gabriel Moreno-Carrillo, Hugo C. Arredondo Bernal. Centro Nacional de Referencia de Control Biológico, SENASICA-DGSV-CNRF. Km 1.5 Carretera Tecomán-Estación FFCC, 28110, Tecomán, Colima, México. j_asg2@hotmail.com Resumen. El pie de cría del parasitoide Tamarixia radiata del CNRCB utilizado para reproducir masivamente y liberar en áreas específicas para el control de Diaphorina citri se ha mantenido como una población genéticamente cerrada, es decir no se han realizado cruzas con individuos silvestres. Se sabe que colonias de insectos que son mantenidas como poblaciones cerradas pueden sufrir endogamia y por consecuencia se pueden perder variantes de genes que impactan en sus aptitudes biológicas, ante esto, se ha considerado evaluar los principales parámetros biológicos de la colonia en reproducción masiva para determinar si es necesario renovarla o reforzarla con genes de colonias silvestres. Este estudio evalúa los parámetros de fecundidad, longevidad del adulto, proporción sexual y tamaño del adulto entre poblaciones silvestres del estado de Jalisco y la colonia de Reproducción Masiva de T. radiata del Centro Nacional de Referencia de Control Biológico, como primera etapa en el desarrollo del protocolo para la evaluación y reforzamiento del pie de cría. Introducción Desde finales de 2009 a la fecha, el Laboratorio de Generación de Tecnología y Reproducción masiva del parasitoide Tamarixia radiata del Centro Nacional de Referencia de Control Biológico ubicado en Tecomán, Colima ha venido reproduciendo masivamente al insecto Tamarixia radiata (Waterston) (Hymenoptera: Eulophidae), principal parasitoide de Diaphorina citri (Kuwayama) (Hemiptera: Psyllidae), vector de la bacteria Candidatus Liberibacter spp., causante del Huanglongbing (HLB). La colonia de este parasitoide en el CNRCB se ha mantenido como una población genéticamente cerrada, es decir no se han realizado cruzas con individuos silvestres. Colonias de insectos que son mantenidas como poblaciones cerradas pueden sufrir endogamia (i.e., perdida de vigor en el organismo) (Van Lenteren 1991; Cohen 2004, Schneider 2009). La endogamia es ocasionada por la acumulación de alelos recesivos o por el constante apareamiento entre individuos de la misma colonia, esto último reduce la diversidad genética del organismo (Mitton 1993, Halliburton 2004, Charlesworth and Willis 2009) y por consecuencia se pueden perder variantes de genes que impactan en sus aptitudes biológicas (Oldroyd y Fewell 2007, Kellermann et al. 2009). En insectarios las colonias se mantienen en óptimas condiciones por lo que individuos endogámicos pueden pasar desapercibidos; sin embargo si estos insectos se liberan en campo no son eficaces para combatir la plaga agrícola para la cual fueron liberados (King et al. 1985, Suh et al. 2000, Lundgren and Heimpel 2002, Ulrichs and Mewis 2004, Vejar-Cota et al. 2005). Dentro de las etapas del proceso de producción 149

2 de T. radiata se miden parámetros de calidad para de esta manera garantizar la eficiencia de los parasitoides producidos (Vizcarra-Valdez et al., 2012). Aun cuando dentro de la colonia producida en el CNRCB no se ha detectado reducción en sus aptidudes biológicas, se ha considerado evaluar sus principales parámetros biológicos para determinar si es necesario renovar o reforzar la colonia producida en el CNRCB aumentando su vigor genético a través de colonias silvestres, por lo cual el presente estudio tiene el objetivo de evaluar parámetros biológicos entre poblaciones silvestres del estado de Jalisco y la colonia de Reproducción Masiva de T. radiata del Centro Nacional de Referencia de Control Biológico, así como también de la cruza resultante de ambas poblaciones como primera etapa en el desarrollo del protocolo para la evaluación y en su caso reforzamiento de la colonia en producción y con esto mejorar sus parámetros biológicos. Materiales y métodos Colecta de material de campo. Para la obtención del material biológico silvestre se recolectaron muestras de ninfas parasitadas (con meconio, coloración oscura y sin movimiento) de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae) en seis sitios sin registro de liberaciones previas del parasitoide T. radiata en cinco localidades del estado de Jalisco, México. Los brotes colectados en zonas con condiciones climáticas similares se juntaron y se consideraron como una sola muestra, de tal forma que para esta evaluación se conformaron tres muestras, como se indica en el cuadro 1. De cada muestra se registro el cultivo, coordenadas geográficas, municipio y nombre del sitio de colecta, así como la fecha de colecta; las muestras fueron transportadas en una hielera con geles refrigerantes al Laboratorio del Departamento de Insectos Entomófagos del CNRCB en Tecomán, Colima para esperar la emergencia de parasitoides. Cuadro 1. Datos geográficos de sitios de colecta para la obtención de colonias silvestres en el estado de Jalisco. Municipio Localidad Coordenadas Muestra Atotonilco el Alto El Charcón N O Atotonilco el Alto El Charcón N O JAL 1 Ameca San Antonio N O San Martin Hidalgo El Tepehuaje N O JAL 2 Autlán Zacalapa N O El Limón El Limon N O JAL 3 Reproducción y mantenimiento de colonias de silvestres. Los primeros adultos de cada colonia de T. radiata colectados de campo se colocaron en una planta de Murraya paniculata L. infestada exclusivamente con ninfas de tercer, cuarto y quinto ínstar de D. citri cubierta con tela de organza. Las ninfas se dejaron expuestas al parasitoide durante 8-10 días hasta que se observo la presencia de meconio, posteriormente los brotes con ninfas parasitadas fueron cortados y trasferidos a recipientes de plástico adaptados para la emergencia de parasitoides. Al obtener la primera generación criada en laboratorio con adultos de cada colonia, una planta de M. paniculata infestada con ninfas de D. citri fue sometida a 150

3 parasitación; todas las plantas se cubrieron con tela de organza para evitar fugas de los parasitoides, siguiendo este proceso se mantuvo la cría de cada colonia colectada en campo. Se trabajó en un área de segura y aislada a 30 C ± 2 y 70% HR, equipada con trampas amarillas para captura de insectos y trampas de luz para la captura de cualquier parasitoide que pudiera escapar durante el manejo, los recipientes con las muestras así como las plantas de M. paniculata se mantuvieron en anaqueles seccionados cubiertos con tela de organza y trampas amarillas como segunda barrera de seguridad al escape de parasitoides. Para asegurar la sanidad y evitar contaminación, todas las plantas infestadas con ninfas de D. citri utilizadas en este trabajo previo a las evaluaciones, se mantuvieron en una cámara de desarrollo de plantas marca BINDER modelo KBWF 720 (E5.2) de condiciones controladas a una temperatura de 28 C con 65% de humedad relativa y una intensidad luminosa de 5000 lux en promedio. Evaluación de colonias silvestres contra colonia en reproducción masiva del CNRCB. Los parasitoides de las diferentes colonias silvestres fueron comparados con la colonia reproducida en el CNRCB, se midieron los parámetros fecundidad, longevidad del adulto, proporción sexual y tamaño del adulto. La evaluación de la fecundidad se llevó a cabo de la siguiente manera: de la segunda generación de la colonia silvestre criada en laboratorio y de la colonia del CNRCB se colectó una hembra y un macho vírgenes para asegurar parasitoides con la característica de virginidad se colocó una ninfa parasitada dentro de un tubo vial hasta la emergencia del parasitoide adulto colectados los parasitoides se formaron parejas de cada colonia y se dejaron copular dentro de un tubo vial durante una hora, posteriormente la pareja de parasitoides fue colocada en una planta de M. paniculata cubierta con tela de organza e infestada con ninfas de D. citri del tercer al quinto ínstar, las plantas se colocaron dentro de cubos de cría empleados para la reproducción masiva del parasitoide en el Laboratorio de Generación de Tecnología y Reproducción Masiva de T. radiata del CNRCB a una temperatura promedio de 32 C ± 2 y 70% ± 10 de humedad relativa. Las ninfas se dejaron expuestas a la pareja de parasitoides por 10 días, transcurrido este tiempo las plantas se trasportaron al laboratorio, se cortaron los brotes con ninfas y se contabilizo el número de huevos depositados o larvas en desarrollo de T. radiata, posteriormente estos brotes se colocaron dentro de recipientes de plástico para dejar emerger a los parasitoides. Para medir la longevidad de los parasitoides se utilizaron los adultos emergidos de la prueba de capacidad de parasitación, de cada colonia silvestre y de la colonia de CNRCB se colecto una muestra de 10 individuos al azar en tubos viales de 25 ml con pequeñas gotas de miel pura como alimento, las muestras se mantuvieron en un cuarto frio a 20 C ± 2 y 60% ± 10 de humedad relativa, diariamente se registró el número y sexo de los parasitoides muertos. La evaluación de la proporción sexual y tamaño del adulto se determinaron con los parasitoides muertos de la prueba anterior. Para determinar la proporción sexual de los parasitoides se observaron bajo microscopio estereoscópico las características de las antenas, tamaño y pigmentación del abdomen, así como presencia del ovipositor en el caso de las hembras. Para la medición del tamaño del adulto se tomaron diez hembras y se les midió la longitud de la tibia del tercer par de patas posterior utilizando una regla graduada, montada en el ocular 10X de un microscopio compuesto Leica 151

4 DM300. Para cada uno de los parámetros evaluados se realizaron cuatro repeticiones por tratamiento, el testigo consistió en los parasitoides de la colonia producida en el CNRCB. Cada prueba se repitió dos veces. Cruza de colonias silvestres con colonia en reproducción masiva del CNRCB. Para producir una cruza entre los parasitoides producidos en el CNRCB y los parasitoides de cada colonia silvestre se aparearon hembras silvestres con machos de la colonia del CNRCB y machos silvestres con hembras de la colonia del CNRCB, se hicieron dos repeticiones por cruza. Para garantizar el apareamiento entre los parasitoides se utilizaron hembras vírgenes y cada pareja se coloco dentro de un tubo vial de 25 ml durante una hora, posteriormente cada pareja se coloco dentro de una planta de M. paniculata infestada con ninfas de D. citri de tercer al quinto ínstar cubierta con tela de organza; las plantas se colocaron dentro de cubos de cría del Laboratorio de Reproducción del CNRCB durante el tiempo y bajo las condiciones antes descritas. Los parasitoides obtenidos de las cruzas de las colonias silvestres y la colonia del CNRCB se compararon con la colonia bajo cría masiva. Los parasitoides fueron sometidos a las mismas pruebas y repeticiones realizadas a las colonias silvestres antes descritas (fecundidad, longevidad, proporción sexual y tamaño de los adultos). Análisis estadísticos La fecundidad, longevidad, proporción sexual y tamaño del adulto de las colonias silvestres y la cruza de estas con la colonia del CNRCB se estimó a través de un análisis de varianza (Andeva) y prueba de comparaciones múltiple de Tukey. La duración de la longevidad (días) de las hembras se determinó a través de un análisis de vida, configuración linear y con ajuste a través de Bonferroni. Todos los datos de este estudio se analizaron con el paquete estadístico SAS V.9.2 (2011) y p Resultados y discusión El análisis de los datos obtenidos para cada uno de los parámetros evaluados en las colonias silvestres y la colonia del CNRCB nos muestra que en los parámetros de longevidad (pruebas de sobrevivencia, gl=4, p= 56.69, x2= ) y proporción sexual (Andeva, gl= 4, f= 0.72, p= ) no se muestran diferencias significativas entre las colonias silvestres y la colonia del CNRCB, es decir los parasitoides de la colonia del CNRCB viven en promedio la misma cantidad de días y su relación hembra macho es similar a la de las tres colonias silvestres evaluadas. El parámetro de tamaño del adulto si presento diferencias significativas (Andeva, gl= 4, f= 8.72 y p= <.0001), las hembras adultas de la colonia Jal 3 son más pequeñas en comparación con los otros tratamientos. En el parámetro de fecundidad se registró que la colonia del CNRCB presenta mayor fecundidad comparada con las tres colonias silvestres evaluadas (Andeva, gl= 4, f= 6.72, p= ) (figura 1), posiblemente a causa de la domesticación, sin embargo también en campo la colonia del CNRCB es eficiente ya que producen un buen nivel de control (de 59.67% hasta 152

5 79.61% de parasitismo en áreas urbanas) (Moreno-Carrillo et al. 2013), lo que hace pensar que también el desempeño del parasitoide en campo es aceptable. En otros parasitoides que al igual que a T. radiata practican reproducción sexual entre la misma progenie se ha observado que disminuyen su longevidad y fecundidad, por ejemplo los parasitoides Trichogramma spp. colectados en campo tienen mayor longevidad (Mansfield y Mills, 2002) y fecundidad (Ashley et al., 1973; Lundgren y Heimpel, 2002; Vejar-Cota et al, 2005) que los parasitoides producidos masivamente. Los resultados para las cruzas realizadas entre las colonias silvestres y la colonia del CNRCB nos indican que no se registran diferencias significativas en los parámetros de fecundidad (Andeva, gl= 4, f= 0.70, p= ) y longevidad (pruebas de sobrevivencia, gl=4, p= 5.50, x2= ); mientras que en el tamaño de las hembras si se registran diferencias significativas (gl= 4, f= 4.42, p= ). Las hembras de la colonia del CNRCB son mayores en tamaño que las hembras de las colonias silvestres. Con respecto a la proporción sexual también se presentaron diferencias significativas en la relación hembra-macho (Andeva, gl= 4, f= 3.67, p= ), los individuos resultantes de la cruza entre parasitoides JAL2 y parasitoides del CNRCB (JAL2/CNRCB) presentaron una proporción sexual mayor de hembras en comparación con los otros tratamientos (Figura 1); aun cuando esta cruza presentó mayor relación hembra macho y pudiera ser candidata para aumentar la proporción sexual de la colonia del CNRCB no se recomienda introducir sus genes dentro de la colonia del CNRCB puesto que los otros parámetros evaluados son menores a los registrados para la colonia del CNRCB. Las hembras de T. radiata dependiendo de la abundancia y tamaño del huésped deciden por si mismas producir un macho (huevo sin fertilizar) o una hembra (huevo fertilizado) (Chu y Chien, 1991), es decir la proporción sexual no es un rasgo fisiológico que este determinado por el vigor físico del individuo; sin embargo la preferencia para producir mayor cantidad de hembras si es un rasgo genético y por lo tanto es heredable. La endogamia (William y Pollak 1985, Stalder y Saxton 2004, Charlesworth y Willis 2009) o una baja diversidad genética (Oldroyd and Fewell 2007, Kellermann et al. 2009) se hubieran detectado si las líneas resultantes de las cruzas realizadas hubieran resultado con mayor vigor que los individuos de la colonia del CNRCB. 153

6 A B C D E F G H Colonias silvestres Cruzas entre las colonias silvestres y CNRCB Figura 1. Fecundidad (A-B), longevidad (C-D), proporción sexual (E-F) y tamaño del adulto (G-H) de las colonias silvestres y cruzas de colonias silvestres con CNRCB. Medias y errores estándares seguidas por la misma letra no son estadísticamente diferentes. Pruebas de ANDEVA y análisis de vida, ajustadas con Tukey y Bonferroni, respectivamente, y p

7 Dentro de las perspectivas que se tienen en el desarrollo de este protocolo para la evaluación y el reforzamiento de pie de cría de T. radiata del CNRCB se tiene contemplado evaluar y comparar esta colonia con poblaciones silvestres de otros estados del país y a su vez iniciar la selección de individuos con características sobresalientes para introducir genes a la colonia en reproducción masiva que mejoren el desempeño en parámetros de interés para el programa de control biológico del psílido asiático en México, como longevidad y fecundidad. Conclusiones Con los datos obtenidos se concluye que la colonia en reproducción masiva del CNRCB y originaria a partir de un solo pie de cría después de cuatro años en los parámetros fecundidad, longevidad del adulto, proporción sexual y tamaño del adulto comparada con colonias silvestres del estado de Jalisco no se ha degradado y continua teniendo el mismo vigor, incluso su fecundidad es estadísticamente mayor que las colonias silvestres evaluadas. Literatura citada Ashley, T. R., Gonzalez, D., Leigh, T. F., Reduction in effectiveness of laboratory-reared Trichogramma. Environmental Entomology. 2(6): Charlesworth, D., Willis, J. H., The genetics of inbreeding depression. Nature Reviews Genetics. 10, Chu, Y. I., Chien, C. C., Utilization of natural enemies to control psyllid vectors transmitting citrus greening. Integrated control of plant virus diseases. Food and fertilizer technology center for the Asian and Pacific region, Taipei, Taiwan, pp Cohen, A. C., Insect diets: science and technology. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA. Halliburton, R., Introduction to population genetics. Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. USA Kellermann, V., Heerwaarden, B. V., Sgro, C. M., Hoffmann, A. A., Fundamental evolutionary limits in ecological traits drive Drosophila species distributions. Science. 325, King, E. G., Coleman, R. J., Phillips, J. R., Dickerson, W. A., Heliothis spp. and selected natural enemy populations in cotton: a comparison of three insect control programs in Arkansas ( ) and North Carolina (1983). Southwestern Entomologist. 8: Lundgren, J. G., Heimpel, G. E., Augmentation of Trichogramma brassicae for control of cruciferous lepidoptera. Proceedings of the 1st international symposium on biological control of arthropods. Honolulu, Hawaii, USA. Mansfield, S., Mills, N. J., Direct estimation of the survival time of commercially produced adult Trichogramma platneri Nagarkatti (Hymenoptera: Trichogrammatidae) under field conditions. Biological Control. 25(1): Mitton, J. B., Theory and data pertinent to the relationship between heterozygosity and fitness. In: Thornhill, N.W. (ed). The natural history of inbreeding and outbreeding. University of Chicago Press, Chicago, pp Moreno-Carillo. G., Sánchez G. J. A. y Arredondo B. H. C. 2013, Avances en la Evaluación de Tamarixia radiata (Waterston) (Hymenoptera: Eulophidae) en Áreas Urbanas de la Región Pacifico Centro de México, XXXVI Congreso Nacional de Control Biológico, Oaxaca de Juárez, Oaxaca, México, pp Oldroyd, B. P., Fewell, J. H., Genetic diversity promotes homeostasis in insect colonies. Trends in Ecology & Evolution. 22, SAS, I. I., SAS/STAT 9.2. User s guide. Cary, NC. Schneider, J. C., Principles and procedures for rearing high quality insects. Mississipi State University, MS, USA. 155

8 Stalder, K. J., Saxton, A. M., More estimation of genetic parameters. In: Saxton, A. M. (ed.). Genetic analysis of complex traits using SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, pp: Suh, C. P. C., Orr, D. B., Van Duyn, J. W., Trichogramma releases in North Carolina cotton: Why releases fail to suppress heliothine pests. Journal of Economic Entomology. 93, Ulrichs, C., Mewis, I., Evaluation of the efficacy of Trichogramma evanescens Westwood (Hym., Trichogrammatidae) inundative releases for the control of Maruca vitrata F. (Lep., Pyralidae). Journal of Applied Entomology. 128(6): Van Lenteren, J. C. V., Quality control of natural enemies: hope or illusion. In: Bigler F. (ed.), Proceedings of the fifth workshop of the IOBC global working group 'quality control of mass reared arthropods'. Wageningen, Netherland, pp Vejar-Cota, G., Caro, A., Rodriguez-del-Bosque, L. A., Sahagun, D., Inundative releases of hymenopterous parasitoids against Diatraea considerata (Lepidoptera: Crambidae) on sugarcane in Northwestern Mexico. Journal of Entomological Science. 40(2): Vizcarra-Valdez, N. I., Sánchez-González, J. A., González-Hernández, A., Arredondo-Bernal, H. C., Parámetros biológicos en el control de calidad en la producción masiva del parasitoide Tamarixia radiata (Waterston) (Hymenoptera: Eulophidae. Vedalia 14 (1): William, R. L., Pollak, E., Theory of heterosis. J. Dairy Sci. 68,