Conjunto de células homogéneas o agregados celulares, suspendidas en medio líquido que constituyen una línea celular

Transcripción

1 Cultivos Sumergidos

2 Cultivos de líneas celulares en suspensión: Conjunto de células homogéneas o agregados celulares, suspendidas en medio líquido que constituyen una línea celular Cultivo de clones en suspensión : Cuando la línea celular se establece a partir de una sola célula

3 Obtención Disgregación mecánica de callos friables Para obtener células finamente suspendidas son necesarios varios repiques ygeneraciones celulares Tamiz (300 a 500 mm) Callo friable 1 st repique 2 nd Repique

4 Las células en suspensión son generalmente similares a células de tipo parenquimáticas: presentan grandes vacuolas poco citoplasma están rodeadas de una pared celular fina Gran tamaño (10-100mM) Tienden ala formación de agregados Presentancrecimiento lento Presentan baja demanda de oxígeno pero no pueden vivir en anaerobiosis

5 A filamentous cell of a shoot cell suspension of Erythrina A filamentous septated cell dividing actively at one end to form an aggregate A giant filamentous cell (G) Note the difference in the size between the giant cell, the smaller generally occurring filamentious cells and the isodiametric cell. A giant (G) and normal (N) isodiametric cell in a shoot cell suspension culture of Erythrina.

6 Los agregados de cientos de células son el resultado de la no dehiscencia luego de la división celular. Se pueden presentar inconvenientes como la generación de gradientes en el suministro de nutrientes. A typical aggregate of small, viable, isodiametric cells of a shoot cell suspension culture of Erythrina which occurs in the the exponential and linear growth phases

7 Agitación entre 70 y150 rpm asegurar la aireación evitar la ruptura de las paredes celulares rígidas debido al alto porcentaje de celulosa yal gran tamaño de las células vegetales (de 10 a 100mm).

8 formas de cultivar suspensiones Cultivos en Batch Se utiliza un volumen de medio finito durante cada ciclo de cultivo que se preolonga hasta que algun nutriente se convierta en limitante (frecuentemente la fuente de C) Cultivos continuos o semicontinuos El medio de cultivo es rellenado o reeemplazado durante el ciclo

9 Agitadores orbitales

10 Orbital shaker rpm

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13 Parámetros para expresar la tasa de crecimiento: Peso Seco: Consiste en filtrar el volumen de suspensión tomado como muestra, secarlo, con vacío, a 50 C hasta peso constante. La desventaja que presenta este método es que se destruye el material vegetal. Peso Fresco: En este caso se filtra el material vegetal y se pesa. La desventaja es que este dato puede ser falso, si el aumento de peso se debe a aumento de volumen celular y no a un aumento irreversible de masa celular. Volumen de empaquetamiento (VPC): Relación de volumen de células referido al volumen de suspensión. Se basa en centrifugar en tubo graduado a 3000 r.p.m. durante 5 minutos una fracción de suspensión celular. VPC = volumen de células volumen de suspensión

14 Comparación entre peso fresco y peso seco

15 Las células en suspensión presentan Tiempos de duplicaciónde h superiores índices de crecimiento que los callos Posibilidadde perder la totipotencia Habituaciónhormonal Cambios en niveles de ploidía Baja resistencia al stress mecánico

16 Cultivos contínuos

17 Cultivos contínuos Cultivos contínuos cerrados: Se remueve parte del medio metabolizado y se reemplaza con medio fresco en forma contínua o periódica. Al finalizar el ciclo se cosechan células y medio. Cultivos contínuos abiertos Se remueve medio de cultivo pero también células se mantiene la densidad celular a niveles óptimos.

18 Cultivos contínuos cerrados: Presentan fases exponencial, lineal y estacionaria muy extendida Se mantiene la viabilidad celular en fase estacionaria Cultivos contínuos abiertos: El cultivo puede ser sostenido en cualquier fase de crecimiento por años

19 Cultivo contínuo cerrado Crecimiento Cultivo en batch Tiempo (días)

20 Cultivos en suspensión Embriogenesis Biotransformaciones Protoplastos Metabolitos secundarios Semillasartificiales Modificación celular Transferenciade genes Fusión

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