Identificación de componentes claves en la tolerancia al estrés biótico y abiótico en soja: una aproximación experimental basada en genómica funcional

Transcripción

1 Identificación de componentes claves en la tolerancia al estrés biótico y abiótico en soja: una aproximación experimental basada en genómica funcional Omar Borsani Depto. Biología Vegetal Laboratorio de Bioquímica y Fisiología Vegetal Facultad de Agronomía Universidad de la República

2 Qué es el estrés abiótico y que factores ambientales lo genera? Estrés abiótico: alteración en el metabolismo celular, inducido por factores abióticos, con efecto sobre la fisiología y desarrollo de las plantas. Factores abióticos ambientales: Luz (exceso o falta) Temperatura extremas (altas o bajas) Agua (falta o exceso) Altas concentraciones de iones metálicos Al +3, Pb +2 no metálicos Na + Contaminantes atmosféricos O 3, NO, N 2 O, CO

3 Estrés ambiental abiótico Respuesta al estrés Tolerancia Susceptibilidad Evasión Aclimatación Senescencia Sobrevivencia Crecimiento Muerte Sobrevivencia

4 sobrevive severidad Órgano o tejido afectado Estrés ambiental duración Estado de desarrollo combinación Genotipo muere

5 Eventos críticos en la tolerancia al estrés abiótico Evitar el daño en niveles reparables Mantener la integridad celular durante el estrés Inducir mecanismos de reparación luego de pasado el estrés

6 Luz Temp. extremas Respuestas comunes Percepción del estrés Transducción de la señal Anegamiento Sequía Cambios fisiológicos y de desarrollo Exceso iones Alteración del metabolismo celular

7 Tipos de estreses ambientales mas relevantes Temperaturas extremas Anegamiento Déficit hídrico Estrés oxidativo

8 Estrés por frío induce deshidratación y daño en membranas Bajas temperaturas Temperaturas congelamiento Pared celular Memb. Plasmática Formación de hielo en la pared

9 Adaptación al frío involucra: Acumulación de solutos (amino acidos y azúcares) Ayudan a estabilizar membranas y proteínas Ayudan a retener el agua Cambios en la composición lipídica de las membranas Inducción de proteínas de protección

10 Proteínas anticongelamiento impiden el crecimiento del cristal de hielo Proteinas anticongelamiento

11 Efectos de la hipoxia y la anoxia inducidas por anegamiento Hipoxia estimulación de síntesis de etileno Anoxia interrupción de la respiración aerobia y síntesis de ATP mitocondrial

12 Glucosa Glicolisis Respiración Todas las respuestas a estrés oxidativo Piruvato Piruvato descarboxilasa Etanal Lactato deshidrogenasa alcohol deshidrogenasa Lactato Dismunución de ph ETANOL

13 MAíZ ARROZ endodermis aire exodermis Hipoxia (72 h) aerénquima aire sumergida

14 Respuestas de tolerancia al anegamiento en arroz T S T S Características asociadas con tolerancia Mantenimiento energético Protección Bloqueo C 2H 2 Control Elongación mínima Niveles de azúcares en tallo Optima fermentación Fotosíntesis subacuática T S Baja síntesis de etileno o poca sensibilidad Fuente: IRRI

15 Factores de respuesta a etileno controlan la respuestas de tolerancia al anegamiento en arroz Fukao and Bailey-Serres, 2008 PNAS

16 La sequía principal factor ambiental de estrés abiótico

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18 Escenarios agrícolas de futuro? Alimentos Caída de rendimientos de cultivos en varias regiones incluido el MERCOSUR Agua Disminución significativa de la disponibilidad de agua en varias regiones

19 Procesos metabólicos afectados por el potencial hídrico celular Inhibición (-) promoción (+) Elongación celular (-) Síntesis de pared celular (-) Síntesis de proteínas (-) Síntesis de clorofila (-) Sintésis metabolitos (+) Germinación de semillas (-) Apertura estomática (-) Asimilación de CO 2 (-) Respiracion (-) Acumulación de prolina (+) MPa

20 Estrés osmótico Ajuste osmótico Sin ajuste osmótico

21 La regulación de la apertura estomática como principal factor de regulación de la eficiencia del uso del agua control ABA/sequía CO 2 H 2 O

22 Principales efectos fisiológicos de la acumulación de ABA y sus consecuencias para la productividad agua no limitante agua limitante Thompson, A. J., et al. Plant Physiol. 2007;143: Copyright 2007 American Society of Plant Biologists

23 GENÉTICA CLÁSICA VS GENÓMICA Bajo número de datos Buena cantidad de información Análisis de proceso específico Alto número de datos Poco detalle Análsis de sistemas globales

24 GENÓMICA Aproximación experimental aplicada al genoma completo GENES ÚNICOS TODO EL GENOMA GENÓMICA ESTRUCTURAL GENÓMICA FUNCIONAL ESTUDIO GLOBAL DE TODO LOS GENES (GENOMA) ESTUDIO GLOBAL DE GENES CON FUNCIÓN

25 Fenotipificación Bioinformática Selección de germplasma Genotipificación

26 Parámetros de estrés en suelo y planta CC suelo (%) CC suelo Ψ (MPa) CRA (%) 100 a 80 a ab a a a ab b b b c CRA CE d Conductancia estomática (mmol H 2 O m -1 s -1 ) t (días) b b T (días) Acumulación de prolina Prolina (µmol g-1 PS) a ab a ab hoja raíz CRA b b b c b b d CRA (%) a a a a a a a a a a t (días) 20 0

27 Genotipos contrastantes N7001 (tolerante; fenotipo slow wilting) TJ 2049 (susceptible)

28 Identificación de genes específicos de respuesta a sequía en el genotipo tolerante N7001 Expresión de genes tempranos MPa -1.2 MPa Inicial Final Expresión de genes tardíos

29 Obtención de una colección de cdna de soja diferencialmente expresados en condiciones de défict hídrico Genotipo tolerate Estrés temprano Genotipo susceptible Estrés tardío Genes con funciones relevantes en la respuesta a déficit hídrico

30 P I1 I2 E1 E2 E3 Contienen fragmentos de ADN genómico o cromosomíco de un organismo y por tanto estan representados todos los genes Genotecas genómicas Genotecas de cdna ORF AAAAAA Representan la población ARNm presente en un determinado tipo celular, tejido, condición fisiológica y/o fase del desarrollo.

31 SÍNTESIS DE cdna

32 GENOTECAS DE cdna Escrutinio convencional Búsqueda de un gen en concreto en esa población de mrna. Limitaciones: abundancia relativa del mrna de interés. Búsqueda de genes desconocidos en un determinado proceso de interés. Escrutinio diferencial Hibridación diferencial de genotecas convencionales. Hibridación sustractiva Sondas Genotecas

33 HIBRIDACIÓN SUSTRACTIVA: SONDAS Y GENOTECAS SUSTRACTIVAS Método muy poderoso para aislar genes que se expresan en una población celular pero no en otra Se basa en enriquecer la población de mrna en aquellos en los que estamos interesados (bien por estar en un tipo celular, estadio de crecimiento o desarrollo o en respuesta a un determinado agente ambiental o patogénico)

34 HIBRIDACIÓN SUSTRACTIVA VENTAJAS E INCONVENIENTES -ENRIQUECIMIENTO EN GENES DE INTERÉS -EL TAMAÑO DE LA GENOTECA SE REDUCE -EL PROCEDIMIENTO DE ESCRUTINIO SE REDUCE -ES UN PROCESO MUY LABORIOSO -GENES INDUCIDOS CON HOMOLOGÍA A GENES CONSTITUTIVOS ESTARAN POCO REPRESENTADOS -GENES MUY POCO INDUCIDOS ESTARAN POCO REPRESENTADOS

35 mrna tracer (Estres) Unión de oligo(dt)-adaptador Síntesis de cdna-ss EcoRI NotI GAATTCACGCGGCCGCA EcoRI NotI GAATTCACGCGGCCGCA Hidrólisis del RNAm Creación de cola-dg EcoRI NotI cdna-cs GGGGGG EcoRI NotI mrna driver (Control) HIBRIDACIÓN Hibridación con exceso de RNAm driver SUSTRACCIÓN CCCCCC GGGGGG SONDA DNAc-ss específicos estrés GENOTECA

36 Colección genes inducidos por déficit hídrico ARN de hojas de plantas sometidas a sequía ARN de hojas de plantas control Transcripción Reversa cdna cdna cantidad Genes específicos de déficit hídrico

37 Resultados de Biblioteca SSH Se obtuvieron 830 clones Se analizaron los clones con insertos

38 Secuenciación masiva de clones 768 clones secuenciados y analizados en phytozome

39 Elaboración de base de datos

40 Agrupación funcional de las 768 secuencias génicas específicas de déficit hídrico Función no asignada Respuesta sequía EUA 4 % Degradación 11 % Metabolismo 18 % Estres oxidativo y detoxificación 10%

41 Selección de 288 clones en base al análisis de sus secuencias Utilización de los clones seleccionados para la confección de macroarreglos: 54 Efectores + 40 de Degradación 96 secuencias de genes Reguladores 18 Detox + 17 Fotosintesis + 29 Desconocidas

42 40-No apical meristem (NAM) protein 85-Helix-turn-helix 208-Eukaryotic initiation factor 5A hypusine, DNA-binding OB fold 288-Leucine Rich Repeat 298-BTB/POZ domain 374-GRAS family transcription factor 651-MA3 domain 707-C1-like domain 21=4-dehydrin, putative, expressed m02563 LOC_Os11g t m Glutathione peroxidase

43 Cuáles elegimos para continuar una caracterización funcional? Qué genes pueden ser claves en la tolerancia a sequía en soja?

44 Características fenotípicas asociados con tolerancia a sequía en soja Menor uso de agua Hojas pubescentes Baja conductancia epidérmica Cierre estomático parcial Alta eficiencia de transpiración Ajuste osmótico ABA, destoxificación Vigor temprano /cobertura suelo Raíces laterales fibrosas Raíz principal profunda (temprana)

45 Análisis de la expresión genotipo-dependiente de algunos genes aislados de la genoteca diferencial Hojas Raíces N7001 TJ2049 N7001 TJ2049 C EI C EF C EI C EF C EI C EF C EI C EF

46 Hojas Raíces N7001 TJ2049 N7001 TJ2049 C EI C EF C EI C EF C EI C EF C EI C EF 785 MIP (acuporina) xilema transporte simplástico de agua

47 Hojas Raíces N7001 TJ2049 N7001 TJ2049 C EI C EF C EI C EF C EI C EF C EI C EF

48 Distribución de los genes identificados a partir de SSH según su función Genes expresados diferencialmente biblioteca A 9% 13% 16% 6% 2% Transcricpión Crec. y mant celular 25% Desconocida Señalamiento Defensa Energía 8% 5% 16% Otros Metabolismo Oxidación Biblioteca A (6, 12 y 24 hpi)

49 Genes expresados diferencialmente biblioteca B 15% 9% 4% 5% 5% 13% 2% 23% 24% Transcricpión Crec. y mant celular Desconocida Señalamiento Defensa Energía Otros Metabolismo Oxidación Biblioteca B (72 hpi).

50 Secuencias identificadas en las bibliotecas relacionados con la defensa vegetal Gen Función Chalcona Sintasa PAL Quitinasa PR-1 PR-10 O-metiltransferasa Proteínas ricas en Glicina Proteínas ricas en Prolina Heat Shock Protein Proteína de Stress Universal Rpp4 Proteína de tipo Dirigente Tioredoxina Catalasa GST SOD AP2 WRKY Lipoxigenasas Serin-treonina Quinasa Proteínas con LRR Síntesis de Flavonoides Síntesis de Fenilpropanoides Digestón de quitina Actividad antifúngica Asociada a resistencia Síntesis de antibióticos Reforzamiento de pared celular Reforzamiento de pared celular Varias Varias Gen de resistencia Síntesis de lignina y lignanos Estrés Oxidativo Estrés Oxidativo Estrés Oxidativo Estrés Oxidativo Factor de transcripción Factor de transcripción Síntesis de oxilipinas y JA Transducción de señales Interacción proteína-proteína

51 Grupos de Uruguay participantes de la actividad Universidad de la República Facultad de Agronomía Laboratorio de Bioquímica Omar Borsani Pedro Díaz Jorge Monza Esteban Casaretto Facultad de Ciencias Laboratorio de Biol. Mol. Veg. Sabina Vidal Juan Pablo Gallino Ana Paula Mulet Laboratorio de Fisiología Vegetal, CIN Marcos Montesano IIBCE Departamento de Biología Molecular Ines Ponce de León Alfonso Alvarez Mauricio Calviño INIA Secciòn Biotecnologìa Victoria Bonecarrere

52 GRACIAS!!!