Annex 1 del document Validació de sistemes de mesura basats en la cromatografia líquida d alta eficàcia

Transcripción

1 Annex 1 del document Validació de sistemes de mesura basats en la cromatografia líquida d alta eficàcia EXEMPLE DE PREPARACIÓ DE MATERIALS DE CALIBRATGE I MATERIALS DE CONTROL Es vol validar un sistema de mesura basat en l HPLC-MS/MS per al mesurament de la concentració de massa de massa de l antibiòtic -lactàmic meropenem en el plasma. Es volen preparar set materials de calibratge en una matriu plasmàtica (en heparina de liti) a unes concentracions de massa de meropenem de 0, 1, 10, 25, 50, 75, 100 i 150 mg/l, i tres materials de control a una concentració de 3, 30 i 90 mg/l. Es disposa del material de referència primari de la Farmacopea Europea (European Pharmacopeia) amb una puresa del 97 %. 1) Preparació del material de blanc Es prepara el material de blanc a partir d una barreja de 40 mostres de pacients que no hagin ingerit ni se ls hi hagi subministrat el fàrmac en estudi (meropenem), seguint el següent procediment: - Se seleccionen 40 tubs d heparina de liti corresponents a mostres de pacients que no siguin ictèriques ni lipèmiques i que tampoc estiguin hemolitzades. - Es comprova, mitjançant la utilització de la informació clínica que es disposi, que cada pacient seleccionat no hagi ingerit el fàrmac en estudi. - Se centrifuguen les mostres a la mateixa velocitat de centrifugació i durant el mateix temps que s utilitzarà per a les mostres de pacients en estudi (a les quals es mesurarà la concentració de meropenem en el plasma). - En un vas de precipitats net i sec de 100 ml, s afegeixen aproximadament 1,5 ml de plasma de cada una de les mostres de pacients (volum total aproximat de 60 ml). - S agita la solució amb l ajuda d un agitador magnètic durant uns 15 minuts. - Es filtra la solució emprant un filtre de paper, per tal d eliminar els possibles artefactes que s hagin pogut generar durant la preparació de la solució. - Es processa una alíquota en el sistema cromatogràfic i es comprova que no s observa cap pic cromatogràfic corresponent al component en estudi (meropenem). 1

2 2) Preparació de solucions primàries del material de calibratge i de control Preparació de 50 ml d una solució primària aquosa de 1500 mg/l de meropenem per als materials de calibratge i 50 ml d una solució primària aquosa de 900 mg/l de meropenem per als materials de control - Es pesen en una balança analítica degudament calibrada, per una banda, 72,8 mg de meropenem per a la solució primària del material de calibratge i, per una altra, 43,7 mg, per a la solució primària del material de control. - Es dipositen els 72,8 mg i els 43,7 mg en vasos de precipitats diferents de 100 ml, i es dissolen en aproximadament 40 ml d aigua de qualitat HPLC o HPLC/MS fins a la seva completa dissolució. - S introdueixen els corresponents 40 ml de cada solució en diferents matrassos aforats nets i secs, prèviament retolats, i s enrasen amb aigua de qualitat HPLC o HPLC/MS. - S agiten les solucions un mínim de tres vegades mitjançant inversió. - Es filtren les solucions emprant filtres amb una mida de por de 0,2 µm i un sistema de filtració de buit. - Es realitzen alíquotes diferents, per a cada una de les solucions, i es conserven a -80 ºC, per garantir la seva estabilitat. Càlcul de la incertesa de mesura de les solucions primàries Per al càlcul de la incertesa de mesura associada a la concentració de massa de meropenem en les diferents solucions primàries aquoses és necessari conèixer, com a mínim, les següents fonts d incertesa (95, 96): - Incertesa associada ala puresa del material de referència certificat (u r ref ). Al nostre cas, el proveïdor declara que la puresa del compost és del 97 % amb una incertesa expandida (U ref ) és 0,50 %; k=2,3. La U de la puresa és de 0,50 %. Com que el factor de cobertura és 2,3, la incertesa estàndard de la puresa és 0,217 % (U = k u), que aplicada a la puresa del fàrmac (97 %) correspon a una incertesa relativa estàndard de (u r ref ) de 2, Incertesa associada a la balança analítica (u r bal ). 2

3 Al nostre cas hauríem de tenir en compte els següents components d incertesa: o Calibratge de la balança En el darrer certificat de calibratge de la balança es declara que la U és 0,0194 mg (nivell de confiança del 95 %) per a una pesada de 50 mg. Com que el factor de cobertura és 2 per aquest nivell de confiança, la incertesa de la pesada en la balança és de 9, mg, que aplicada a les masses estudiades, suposant homocedasticitat, (72,8 mg i 43,7 mg), corresponen a unes incerteses relatives estàndards (u r bal ) de 1, i 2, , respectivament. - Incertesa associada al matràs aforat (u r matràs ). Al nostre cas hauríem de tenir en compte, com a mínim, els següents components d incertesa: o Calibratge dels matrassos aforats de 50 ml (u r cal matràs ). El fabricant dels matrassos aforats declara que el volum que mesura cada un dels matrassos és de (50 0,01) ml a una temperatura de 20 ºC sense indicar el nivell de confiança. Atès que en aquests tipus d'instruments volumètrics és més probable que el valor vertader estigui més a prop del valor nominal que dels extrems, per calcular la incertesa estàndard (de tipus B) assumirem que les lectures segueixen una distribució triangular isòsceles d amplitud igual a 50 0,01 ml, per la qual cosa: Aquesta incertesa, aplicada als volums continguts en els matrassos (50 ml), corresponen a una incertesa relativa estàndard (u r cal matràs ) de 2, o Temperatura de la lectura (u r temp ). Hauríem de tenir en compte si la diferència de temperatura a la qual es fan les mesures dels volums (al nostre cas la temperatura del laboratori, 22 ºC 3 ºC) i a la que s ha realitzat el calibratge (20 ºC, segons declara el fabricant) pot conduir a una incertesa deguda a l expansió o contracció del volum que valgui la pena considerar. El coeficient d expansió del líquid (aigua) = 2, ºC -1. La contribució de la temperatura amb el volum es pot considerar com: 50 ml (22 ºC 20 ºC) 2, ºC -1 = 0,021 ml 3

4 Assumint que la variació de la temperatura segueix una distribució rectangular d amplitud 2 0,021 ml: Aquesta incertesa, aplicada als volums continguts en els matrassos (50 ml) corresponen a una incertesa relativa estàndard (u r temp ) de 4, Un cop calculades les incerteses estàndard relatives de cadascun dels components de la incertesa ja es pot calcular la incertesa estàndard combinada relativa (u rc ) al mesurament de la concentració de massa de meropenem en la dissolució aquosa: =3, = 3, Posteriorment, es calcula la incertesa expandida relativa amb un nivell de confiança de 0,95, per la qual cosa multiplicarem la incertesa estàndard relativa combinada per un coeficient de cobertura igual a 2: U r = u rc k = U r calibrador = 3, = 6, U r control = 3, = 6, Finalment, si apliquem aquestes incerteses expandides relatives a la concentració de massa de meropenem de les diferents solucions aquoses primàries (1500 mg/l per a la solució primària del material de calibratge i 900 mg/l per a la del material de control), s obtenen que les corresponents incerteses expandides són 9,21 mg/l i 5,53 mg/l, respectivament. Així doncs, els resultats de la concentració de massa de meropenem en les diferents solucions aquoses, després d arrodonir els valors de les incerteses expandides, seran de (1500 9) mg/l i (900 6) mg/l. 4

5 3) Preparació de solucions secundàries dels materials de calibratge i de control Preparació de solucions secundàries aquoses d 1,5 ml (0, 10, 100, 250, 500, 750, 1000 i 1500 mg/l de meropenem) per als materials de calibratge - Es retola un tub de borosilicat o de polipropilè de 5 ml per cada una de les solucions secundàries dels materials de calibratge a realitzar. - Es pipetegen al seu corresponent tub, amb l ajuda de pipetes mecàniques de volum variable degudament calibrades, els següents volums: Per a la preparació d una solució secundària de concentració 0 mg/l 0 µl de la solució aquosa primària de 1500 mg/l i 1500 µl d aigua Per a la preparació d una solució secundària de concentració 10 mg/l 10 µl de la solució aquosa primària de 1500 mg/l i 1490 µl d aigua Per a la preparació d una solució secundària de concentració 100 mg/l 100µL de la solució aquosa primària de 1500 mg/l i 1400 µl d aigua Per a la preparació d una solució secundària de concentració 250 mg/l 250µL de la solució aquosa primària de 1500 mg/l i 1250 µl d aigua Per a la preparació d una solució secundària de concentració 500 mg/l 500µL de la solució aquosa primària de 1500 mg/l i 1000 µl d aigua 5

6 Per a la preparació d una solució secundària de concentració 750 mg/l 750µL de la solució aquosa primària de 1500 mg/l i 750 µl d aigua Per a la preparació d una solució secundària de concentració 1000 mg/l 1000µL de la solució aquosa primària de 1500 mg/l i 500 µl d aigua Per a la preparació d una solució secundària de concentració 1500 mg/l 1500µL de la solució aquosa primària de 1500 mg/l i 0 µl d aigua - S agiten els tubs durant uns 5 segons amb l ajuda d un agitador tipus vòrtex. Preparació de solucions secundàries aquoses d 1,8 ml (30, 300 i 900 mg/l de meropenem) per als materials de control - Es retola un tub de borosilicat o de polipropilè de 5 ml per cada una de les solucions secundàries dels materials de control a realitzar. - Es pipetegen al seu corresponent tub, amb l ajuda de pipetes mecàniques de volum variable degudament calibrades, els següents volums: Per a la preparació d una solució secundària de concentració 30 mg/l 60 µl de la solució aquosa primària de 900 mg/l i 1740 µl d aigua Per a la preparació d una solució secundària de concentració 300 mg/l 600µL de la solució aquosa primària de 900 mg/l i 1200 µl d aigua 6

7 Per a la preparació d una solució secundària de concentració 900 mg/l 1800µL de la solució aquosa primària de 900 mg/l i 0 µl d aigua - S agiten els tubs durant uns 5 segons amb l ajuda d un agitador tipus vòrtex. Càlcul de la incertesa de mesura de les solucions secundàries Per al càlcul de la incertesa de mesura associada a la concentració de massa de meropenem en les diferents solucions aquoses secundàries és necessari conèixer, com a mínim, les següents fonts d incertesa (95, 96): - Incertesa associada a la preparació de les solucions primàries aquoses (u r sol primàries). Al nostre cas, els valors de les incerteses estàndards relatives per a les dues solucions primàries preparades eren de 0, Incertesa associada a les pipetes mecàniques de volum variable (u r pipetes ). Al nostre cas hauríem de tenir en compte els següents components d incertesa: o Calibratge de les pipetes (u r cal ). En el darrer certificat de calibratge de les diferents pipetes emprades es declara que: Les incerteses expandides relatives (amb un nivell de confiança del 95 %) per a una pipeta mecànica de volum variable de µl són 0,012 (a un volum de 100 µl), 0,014 (a un volum de 500 µl) i 0,025 (a un volum de 1000 µl). Les incerteses expandides relatives (amb un nivell de confiança del 95 %) per a una pipeta mecànica de volum variable de µl són 0,00102 (a un volum de 10 µl), 0,0026 (a un volum de 100 µl) i 0,0053 (a un volum de 200 µl). Les incerteses estàndards relatives per a cada una de les solucions realitzades són: Per a la preparació d una solució secundària de concentració 10 mg/l 10 µl amb la pipeta de µl és de 0,

8 1490 µl amb la pipeta de µl és de 0,007 (1 pipeteig de 490 µl) i de 0,0125 µl (1 pipeteig de 1000 µl). Per a la preparació d una solució secundària de concentració 100 mg/l 100 µl amb la pipeta de µl és de 0, µl amb la pipeta de µl és de 0,007 (1 pipeteig de 400 µl) i de 0,0125 µl (1 pipeteig de 1000 µl). Per a la preparació d una solució secundària de concentració 250 mg/l 250 µl amb la pipeta de µl és de 0, µl amb la pipeta de µl és de 0,006 (1 pipeteig de 250 µl) i de 0,0125 µl (1 pipeteig de 1000 µl). Per a la preparació d una solució secundària de concentració 500 mg/l 500 µl amb la pipeta de µl és de 0, µl amb la pipeta de µl és de 0,0125 µl. 8

9 Per a la preparació d una solució secundària de concentració 750 mg/l 750µL amb la pipeta de µl és de 0, µL amb la pipeta de µl és de 0,007 µl. Per a la preparació d una solució secundària de concentració 1000 mg/l 1000 µl amb la pipeta de µl és de 0, µl amb la pipeta de µl és de 0,007. Per a la preparació d una solució secundària de concentració 1500 mg/l 1000 µl amb la pipeta de µl és de 0, µl amb la pipeta de µl és de 0,007. Per a la preparació d una solució secundària de concentració 30 mg/l (Control) 9

10 60 µl amb la pipeta de µl és de 0, µl amb la pipeta de µl és de 0,0125 (1 pipeteig de 740 µl) i de 0,0125 µl (1 pipeteig de 1000 µl). Per a la preparació d una solució secundària de concentració 300 mg/l (control) 600 µl amb la pipeta de µl és de 0, µl amb la pipeta de µl és de 0,0125 (1 pipeteig de 1000 µl) i de 0,006 µl (1 pipeteig de 200 µl). Per a la preparació d una solució secundària de concentració 900 mg/l (control) 1000 µl amb la pipeta de µl és de 0, µl amb la pipeta de µl és de 0,0125. Un cop calculades les incerteses estàndard relatives de cadascun dels components de la incertesa ja es poden calcular les incerteses estàndard combinades relativa (u rc ) per al mesurament de la concentració de massa de meropenem de cada una de les solucions aquoses, així com les incerteses expandides relatives (U r = u rc k): 10

11 Per a la preparació d una solució secundària de concentració 10 mg/l U rc = 2 u rc = 0,0294 Per a la preparació d una solució secundària de concentració 100 mg/l U rc = 2 u rc = 0,0294 Per a la preparació d una solució secundària de concentració 250 mg/l U rc = 2 u rc = 0,0308 Per a la preparació d una solució secundària de concentració 500 mg/l U rc = 2 u rc = 0,0293 Per a la preparació d una solució secundària de concentració 750 mg/l U rc = 2 u rc = 0,0207 Per a la preparació d una solució secundària de concentració 1000 mg/l U rc = 2 u rc = 0,0294 Per a la preparació d una solució secundària de concentració 1500 mg/l U rc = 2 u rc = 0,

12 Per a la preparació d una solució secundària de concentració 30 mg/l (control) U rc = 2 u rc = 0,0360 Per a la preparació d una solució secundària de concentració 300 mg/l (control) U rc = 2 u rc = 0,0316 Per a la preparació d una solució secundària de concentració 900 mg/l (control) U rc = 2 u rc = 0,0360 Finalment, si apliquem aquestes incerteses expandides relatives a la concentració de massa de meropenem de les diferents solucions aquoses secundàries (10, 100, 250, 500, 750, 1000 i 1500 mg/l per als materials de calibratge i 30, 300 i 900 mg/l per als materials de control), s obtenen que les corresponents incerteses expandides són 0,29, 2,94, 7,7, 14,65, 15,53, 29,4, 44,1, 0,95, 9,48 i 32,4 mg/l, respectivament. Així doncs, els resultats de la concentració de massa de meropenem en les diferents solucions aquoses secundàries, després d arrodonir els valors de les incerteses expandides, seran: Per als materials de calibratge: (10,0 0,3) mg/l (100 3) mg/l (250 8) mg/l (500 15) mg/l (750 16) mg/l ( ) mg/l ( ) mg/l 12

13 Per als materials de control: (30 1) mg/l (300 9) mg/l (900 32) mg/l 4) Preparació de solucions de treball dels materials de calibratge i de control Preparació de 5 ml de solucions de treball per als materials de calibratge (0, 1,0, 10, 25, 50, 75, 100 i 150 mg/l de meropenem) i per als materials de control (3,0, 30 i 90 mg/l de meropenem) - Es retola un tub de polipropilè de 10, 15 o 20 ml per cada una de les solucions de treball dels materials de calibratge o control a realitzar. - S afegeixen a cada tub, amb l ajuda d una pipeta mecànica de volum variable per a xeringues degudament calibrada, 4,5 ml de material de blanc. - Es pipetegen al seu corresponent tub, i amb l ajuda d una pipeta mecànica de volum variable degudament calibrada, 500 µl de les solucions secundàries. - S agiten els tubs durant uns 5 segons amb l ajuda d un agitador tipus vòrtex. - Es realitzen alíquotes diferents, per a cada una de les solucions de treball, i es conserven a -80 ºC, per garantir la seva estabilitat. Càlcul de la incertesa de mesura de les solucions de treball Per al càlcul de la incertesa de mesura associada a la concentració de massa de meropenem en les diferents solucions plasmàtiques de treball és necessari conèixer, com a mínim, les següents fonts d incertesa (95, 96): - Incertesa associada a la preparació de les solucions secundàries aquoses (u r sol secundàries). Al nostre cas, els valors de les incerteses estàndards relatives per a les solucions secundàries preparades eren 0,0144 (solució 10 mg/l), 0,0144 (solució 100 mg/l), 0,0151 (solució 250 mg/l), 0,0293 (solució 500 mg/l), 0,0099 (solució 750 mg/l), 0,0144 (solució 1000 mg/l), 0,0144 (solució 1500 mg/l), 0,0177 (solució 30 mg/l), 0,0155 (solució 300 mg/l) i 0,0177 (solució 900 mg/l). - Incertesa associada a les pipetes mecàniques de volum variable (u r pipetes ). Al nostre cas hauríem de tenir en compte els següents components d incertesa: o Calibratge de les pipetes (u r cal ). 13

14 En el darrer certificat de calibratge de les diferents pipetes emprades es declara que: Les incerteses expandides relatives (amb un nivell de confiança del 95 %) per a una pipeta mecànica de volum variable de µl són 0,012 (a un volum de 100 µl), 0,014 (a un volum de 500 µl) i 0,025 (a un volum de 1000 µl). Les incerteses expandides relatives (amb un nivell de confiança del 95 %) per a una pipeta mecànica de volum variable per a xeringues són 0,00036 (a un volum de 100 µl), 0,0082 (a un volum de 500 µl) i 0,012 (a un volum de 1000 µl). Les incerteses estàndards relatives per a cada una de les solucions realitzades són: L'ocasionada degut al pipeteig de 1000µL amb la pipeta de µl és de 0, µL amb la pipeta per a xeringues és de 0,0041 (1 pipeteig de 500 µl) i de 0,0120 µl (4 pipetejos de 1000 µl). La incertesa estàndard combinada per a cada solució resultant del pipeteig de 5 ml Un cop calculades les incerteses estàndard relatives de cadascun dels components de la incertesa ja es poden calcular les incerteses estàndard combinades relativa (u rc ) per al mesurament de la concentració de massa de meropenem de cada una de les plasmàtiques, així com les incerteses expandides relatives (U r = u rc k): Per a la preparació d una solució de treball de concentració 1 mg/l U rc = 2 u rc = 0,0375 Per a la preparació d una solució de treball de concentració 10 mg/l 14

15 U rc = 2 u rc = 0,0375 Per a la preparació d una solució de treball de concentració 25 mg/l U rc = 2 u rc = 0,0386 Per a la preparació d una solució de treball de concentració 50 mg/l U rc = 2 u rc = 0,0375 Per a la preparació d una solució de treball de concentració 75 mg/l U rc = 2 u rc = 0,0311 Per a la preparació d una solució de treball de concentració 100 mg/l U rc = 2 u rc = 0,0375 Per a la preparació d una solució de treball de concentració 150 mg/l U rc = 2 u rc = 0,0375 Per a la preparació d una solució de treball de concentració 3 mg/l (control) U rc = 2 u rc = 0,0428 Per a la preparació d una solució de treball de concentració 30 mg/l (control) U rc = 2 u rc = 0,0392 Per a la preparació d una solució de treball de concentració 90 mg/l (control) 15

16 U rc = 2 u rc = 0,0428 Finalment, si apliquem aquestes incerteses expandides relatives a la concentració de massa de meropenem de les diferents solucions de treball (1,0, 10, 25, 50, 75, 100 i 150 mg/l per als materials de calibratge i 3,0, 30 i 90 mg/l per a les del material de control), s obtenen que les corresponents incerteses expandides són 0,038, 0,38, 0,97, 1,88, 2,33, 3,75, 5,62, 0,06, 1,18 i 3,85 mg/l, respectivament. Així doncs, els resultats de la concentració de massa de meropenem en les diferents solucions aquoses secundàries, després d arrodonir els valors de les incerteses expandides, seran: Per als materials de calibratge: (1,00 0,04) mg/l (10,0 0,4) mg/l (25 1) mg/l (50 2) mg/l (75 2) mg/l (100 4) mg/l (150 6) mg/l Per als materials de control: (3,00 0,06) mg/l (30 1) mg/l (90 4) mg/l 16