Correlation between ELISA and latex agglutination tests for diagnosis of canine parvovirus.

Transcripción

1 Correlation between ELISA and latex agglutination tests for diagnosis of canine parvovirus. Determinación de la correlacion entre las pruebas de ELISA y aglutinación en latex para el diagnostico de parvovirosis canina. Ariza-Pinzon, S., Fuentes, D. Vera, B., Villamil, L. SUMMARY: Serum samples were collected from 125 dogs presented to 4 clinics in Bogota with signs of hemorrhagic gastroenteritis, or with differential diagnosis of parvovirus. The hemeagglutination and latex agglutination tests seemed to have the highest senstivity and specificity and be most cost-effective. 1.1 MUESTRAS: En el presente estudio se incluyeron caninos que ingresaron con síntomas de gastroenteritis hemorrágica a cuatro clínicas de la ciudad de Bogotá (Clínica para pequeños animales de la universidad nacional de Colombia y tres clínicas veterinarias privadas); en cuya valoración médica previa se observaron signos de gastroenteritis hemorrágica ó se planteó como diagnóstico diferencial parvovirosis canina. La población total de caninos afectados para las cuatro clínicas fue de 125 animales, comprendido en un periodo de 5 meses (octubre de febrero de 2.002), la muestra estudiada correspondió al 56.8% (71/125) de la población total; a cada animal se le tomó una muestra de materia fecal y sangre para su posterior análisis. 1.2 CONSERVACIÓN DEL SUERO: La muestra de sangre se colectó en tubos estériles sin anticoagulante, se centrifugó a rpm durante 5 minutos y el suero obtenido se almacenó a 20 C (Carmichael, 1.980). Para la realización de la prueba de inhibición de hemaglutinación (HI) los sueros fueron inactivados según el método descrito por Carmichael y Gorski, con el fin de realizar la adsorción de inhibidores no específicos, la muestra se mantuvo por 30 minutos a temperatura ambiente, se centrifugó a rpm durante 20 minutos y posterior a esto se adicionó 50 µl de glóbulos rojos de cerdo al 50%, se incubó 1 hora a temperatura ambiente, y como último se centrifugó a rpm por 10 minutos, el sobrenadante fue utilizado para la prueba de HI. 1.3 PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN FECAL (SF): Cada muestra se colectó en un tubo estéril, y se resuspendió en nueve partes v/v de una solución de PBS, posteriormente se centrífugo a 5000 rpm. Durante 30 minutos a 4 C (Benavides, 1.983). El sobrenadante fue filtrado a través de una membrana de 0.2µm y almacenado a 70 C hasta su procesamiento. (Carmichael, 1980). La SF fue utilizada para la realización de HA, AL y ELISA (SNAP ).

2 1.4 PROTOCOLO DE INMUNIZACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE SUERO HIPERINMUNE EN CONEJO. Se produjo un suero hiperinmune en dos conejos de 4 meses, utilizando como inoculo sobrenadante de materia fecal positivo a parvovirosis canina por hemaglutinación y una vacuna monovalente a virus vivo modificado; empleando el siguiente esquema de inmunización, el día 0 se inoculó 0.5ml del antígeno y 0.5 ml de adyuvante completo de Freund por vía subcutánea, para el día 7,14, 21, 28 se emplearon las mismas dosis, pero se utilizó un adyuvante incompleto, previa titulación de los anticuerpos; el sangrado final se realizó para el día 35. La sangre total se colectó de la vena yugular para ser centrifugada a rpm durante 30 minutos de la cual se obtuvo el suero hiperinmune. Los títulos obtenidos por HI fueron de 1:1024 para el conejo inoculado con la vacuna monovalente, así como el inmunizado con la SF. Los sueros fueron dializados junto con el de un conejo no inmunizado negativo por HI a parvovirus canino (control negativo), cuyo fin fue concentrar las inmunoglobulinas, el protocolo fue realizado con ácido octanóico. Los sueros hiperinmunes fueron utilizados para la sensibilización de las partículas de látex. 1.3 PRUEBAS PRUEBA DE HEMAGLUTINACION: Se obtuvo una muestra de sangre de cerdo, la cual se conservó en una proporción 1:1 v/v en una solución de Alsever como anticoagulante. Con base en la técnica descrita por Carmichael 1.980; los títulos de aglutinación mayores o iguales a 1: 64 fueron considerados como específicos para parvovirus canino. (Mathys, 1.983a; Veijalainen, Macartney, 1.988) ELISA: Se utilizó un kit comercial desarrollado para la detección del antígeno en heces, siguiendo las recomendaciones de la casa fabricante SNAP Parvo (IDEXX) AGLUTINACIÓN EN LATEX (AL): Se utilizaron perlas de látex de poliestileno 0.33µ diámetro 10% p/v (SIGMA ) para el test de aglutinación. Las partículas de látex se cubrieron por los anticuerpos de acuerdo a lo descrito por Severin (1.972) y Veijalainen (1.986). Las inmunoglobulinas dializadas se disolvieron, en un buffer de glicina salino 0.054M (ph 8.2) y se obtuvo una concentración de 1:20 unidades hemaglutinantes. Iguales volúmenes de la solución de inmunoglobulinas con la suspensión de la partícula de látex 10% p/v se mezclaron e incubaron a 37 C en baño de María durante 2 horas. Las partículas se lavaron por centrifugación a rpm por 10 minutos, el sobrenadante se reemplazó por un buffer de glicina 0.27M (ph 8.2), y el lavado se repitió dos veces más.los sitios de unión a proteínas remanentes en las partículas de látex fueron bloqueados al suspenderlas al 10% v/v en un buffer de glicina salino 0.27M con albúmina sérica bovina al 0.1%. El test de aglutinación se realizó mezclando 30µl de las partículas sensibilizadas con el anticuerpo anti-parvovirus y 30µl de la SF homogenizada durante 3 minutos, se realizó un control positivo utilizando una vacuna monovalente a parvovirosis canina, y el control negativo, con perlas sensibilizadas con un suero dializado no inmune a parvovirosis canina enfrentada a la misma vacuna; toda aglutinación fue dada como positiva.

3 La recomendación técnica de los fabricantes indica que las perlas pueden ser sensibilizadas por segunda vez al ser lavadas por centrifugación con Tween 20 al 0.05% (Pollack, 1.966; Nathan, 1.981; Hechemy, 1.984) INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACION: El procesamiento de las muestras se basó en la técnica descrita por Carmichael, (1.980). Títulos 1:80 de inhibición de la hemaglutinación, son indicadores de títulos protectivos o de seroconversión activa (Benavides, 1.983; Bruenner, 1.985; Carmichael, 2.001). 1.4 DISCUSIÓN Y RESULTADOS: Se tomaron 66 muestras de materia fecal de caninos con síntomas compatibles de parvovirosis canina en cuatro clínicas de la ciudad de Bogotá, durante los meses de Octubre a Febrero Debido a la eliminación de partículas virales de parvovirus canino en la materia fecal se empleó la prueba de ELISA (SNAP ), como prueba de referencia, que detectó 21 positivos (31.81%) a la prueba y 35/66 (68.19%) negativos. Para la prueba de HA, se encontró el 31.81% de las muestras con títulos 1:64 clasificadas como positivas y con títulos menores el 68.18% negativas. Resultados que pueden ser explicados porque en reportes previos, las coberturas vacunales son más amplias, disminuyendo la infección en cachorros, así como la inmunidad natural adquirida sería mayor, según los datos anamnésicos de la población en estudio solo el 17% tenía una inmunización previa a parvovirosis canina. (Carmichael, 1.980; Carmichael, 1.983; Veijalainen, 1.983; O brien, 1.994; Olson, 1.996, Carmichael; 1.999). A su vez también podría ser atribuido a que la cepa CPV-2b posiblemente, se encuentre presente en la población al mostrar títulos hemaglutinantes más altos de acuerdo con lo reportado por Hoskins, 1.997, Smith-Carr, Algunas de las muestras positivas tuvieron títulos muy altos 1: , lo cual no se encuentra reportado en la literatura por Carmichael, 1.980; Teramoto, 1.984; Mizak, Para la segunda prueba analizada AL, las perlas de látex fueron sensibilizadas con anticuerpos contra el virus de la parvovirosis canina, los que fueron producidos mediante descarga de conejos con vacuna monovalente o con suspensión fecal proveniente de caninos con título positivo a la prueba de ELISA, siendo el de mejor resultado, el desarrollado a partir de la vacuna. La prueba de aglutinación en látex se normalizó con una dilución del anticuerpo 1:50, basados en un título inicial por hemoaglutinación del suero hiperinmune (1:1.024); así mismo se determinó que el 10% v/v (pellet perlas / buffer glicina salino 0.27M 0.1% albúmina bovina) era la dilución óptima final para la realización de la prueba; en este estudio a pesar de seguir el protocolo de Veijalainen, (1.986). Todas las muestras fueron leídas a los tres minutos, tiempo suficiente de observación concordante con lo descrito por Veijalainen (1.986) y Sanekata (1.996). Las soluciones de perlas sensibilizadas y mantenidas a 4 C fueron estables durante los dos meses del presente ensayo, lo que concuerda con lo reportado por Sanekata (1.996), que estableció la preservación de sus cualidades diagnósticas por un periodo de 8 a 12 meses a 4 C posterior a su sensibilización. El resultado obtenido por la prueba de AL a partir de la suspensión de la materia fecal fue de 20/66 (30.3%) positivas, y el 46/66 (69.7%) negativas, que es muy similar al obtenido en las otras evaluaciones (FIGURA 1). Comparando las dos pruebas anteriores (HA y AL), con la

4 de referencia ELISA (SNAP ) en términos de sensibilidad y especificidad (coopositividad y coonegatividad), se estableció que de las 66 muestras de materia fecal, 21 fueron positivas por ELISA a parvovirosis canina, las cuales a su vez fueron positivas para HA; para el caso de la aglutinación en látex, 20 de las 21 muestras aglutinaron y fueron dadas como positivas para AL, demostrando la alta correlación entre estos tres métodos diagnósticos. La sensibilidad y especificidad de HA fue del 100% frente a la prueba de referencia (ELISA); a su vez la sensibilidad de AL fue del 95% y 100% de especificidad con un nivel de confianza del 95%. Para obtener datos de correlación entre estos tres métodos diagnósticos se empleó el test de concordancia kappa (Sackett, 1.985; Petrie, 1.999), diseñado para la correspondencia entre dos pruebas diagnósticas. Los valores mayores a 0.8 con un nivel de confianza del 95% indican una correspondencia buena, siendo 1 la correspondencia perfecta. Para HA el valor de kappa fue de 1 indicando una concordancia total, el valor de kappa para AL fue de considerado como bueno, en ambas pruebas de escrutinio con un nivel de confianza del 95%; lo cual está de acuerdo con lo reportado por Veijalainen (1.983); Sanekata (1.996)(GRÁFICO 1) De un total de 64 sueros sanguíneos el 85.93% 55/64 tenían títulos de seroconversión a parvovirosis canina 1:80 y el 14.07% 9/64 no poseían títulos, dichos fueron discriminados en niveles bajos (1:80 1:512) el 34.37% de la población, el 32.81% (1: :4096) como títulos medios y el 18.75% ( 1:8192) con títulos altos. Los títulos de seroconversión para la población podrían sugerir que en algunos de los caninos el desafío de campo ocurrió antes del tiempo de la toma de la muestra de materia fecal, razón por la cual no se encontró excreción viral para algunos de los caninos. De igual manera los títulos serológicos para este estudio podrían revelar la exposición al antígeno, pero sin la determinación de una serología pareada no se establecería si son títulos infectivos o no (Carmichael, 1.980; Macartney, 1.984a; Macartney, 1.988). Así mismo la manifestación de gastroenteritis hemorrágica pudo involucrar otras etiologías como: virales (coronavirus y rotavirus), parasitarias (Toxascaris y Ancylostoma) y bacterianas (Campilobacter y Salmonella) de acuerdo con lo reportado por Bruenner, 1.985; Hoskins, 1.997; Carmichael, La normalización de la técnica de aglutinación en látex permite recomendar la sensibilización de las perlas en una dilución de 1:20 de unidades de hemoaglutinación del suero hiperinmune en el buffer de glicina salino, ya que se estableció que este es un punto crítico en la sensibilización de las mismas Para este estudio la prueba de hemaglutinación ofrece rangos notables de sensibilidad, especificidad y un nivel de concordancia perfecto frente a la prueba de referencia, ELISA, razón por la cual podría ser útil como prueba de referencia para nuestro medio. Los métodos diagnósticos de hemaglutinación y aglutinación en látex para este estudio demostraron ser métodos más económicos, sensibles y específicos para el diagnóstico de la parvovirosis canina en heces; teniendo ventajas comparativas la AL frente a la HA ya que la estabilidad de los glóbulos rojos de cerdo es muy baja, lo que implica la necesidad de estar tomando sangre de cerdo cada 10 días, mientras que con la AL este proceso se obvia, razón por la cual la técnica de AL podría ser utilizada como prueba de rutina para el diagnóstico en las clínicas para pequeños animales.

5 FIGURA 1. Aglutinación en látex. 1. Negativo. 2, 3,4 Diferentes grados de aglutinación positiva ELISA HA AL POSITIVOS NEGATIVOS Grafico 1.Comparación de los resultados positivos y negativos por ELISA, HA, AL en heces, para el diagnóstico de parvovirosis canina.