Bioquímica I Curso 2010 Proteínas IV

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1 Bioquímica I Curso 2010 Proteínas IV Temario Detección y cuantificación de una proteína específica, actividad biológica. específica. Marcha de la purificación: parámetros. Grado de purificación. Rendimiento. Problema 1. En la purificación de una enzima se obtuvieron los siguientes resultados: Fracción Volumen total total (unidades Proteínas (mg/ml) (ml) enzim.) Extracto acuoso ,2 Fracción 40-50% de ,9 sat. (NH 4) 2SO 4 Eluato Ca 3(PO4) ,2 a. Calcular la actividad específica en cada fracción b. Calcular cuántas veces se ha purificado la proteína. c. Calcular el rendimiento en todo el procedimiento. d. Cómo supone Ud. que puede variar la actividad específica a lo largo del proceso de purificación? (aumenta, disminuye, permanece constante). Por qué? Problema 2. Se desean estudiar las propiedades de una enzima que se encuentra en plantas. Para ello se ha diseñado un método de purificación con el que se pretende obtener esta enzima en condiciones nativas, y se han realizado algunos análisis de sus propiedades. TABLA 1 Fracción Proteina UE/ml mg/ml Extracto crudo Ppdo. de sulfato de amonio Precipitación isoelectrica Cromatografía en 433 1,3 DEAE-celulosa Concentrado de ,5 proteína Específica Factor de Purificación Rendimiento Para la purificación de esta enzima usted partió de hojas de espinaca y obtuvo un extracto crudo de 72 ml. Seguidamente se precipitó con sulfato de amonio por agregado de 117 ml de solución saturada de dicha sal. Luego de separar el precipitado, el mismo se resuspendió en buffer ph 7,0 en un volumen final de 25 ml. A esta fracción se la precipitó isoelectricamente y se separó el precipitado del sobrenadante mediante centrifugación. La fracción conteniendo la enzima (precipitado) se resuspendió en 7.5 ml de buffer ph 7 y se

2 cromatografió en DEAE-celulosa. Se juntaron todas las fracciones correspondientes al pico de actividad (volumen total 7,2 ml). Como último paso se realizó una concentración de la muestra. A todas las fracciones de la purificación se les midió actividad de la enzima y concentración de proteínas por el método de Lowry (0,2 ml de muestra en el tubo de colorimetría de volúmen final 1,3 ml). a- En base a los datos presentados: A qué grado de saturación de sulfato de amonio precipita la enzima? b- Cual es principio de la precipitación isoeléctrica? Cómo procedería para realizarla? c- En cada etapa de la purificación de esta enzima calcule: la actividad específica, el rendimiento respecto de la etapa anterior y del proceso total. Cree que el protocolo aplicado fue adecuado en todas las etapas?. Si no es así, explique por qué y sugiera las modificaciones que crea necesarias. Problema 3. La toxina N20D se purificó a partir de un cultivo de E.coli que contenía el gen en un plásmido. Las células se separaron del medio y luego de su ruptura se obtuvo un extracto crudo que fue sometido a precipitación fraccionada con sulfato de amonio, y sucesivas cromatografías con columnas de intercambio iónico, de interacción hidrofóbica y de afinidad. Parte de los datos de purificación se encuentran en la tabla 1. Tabla 1 Preparación Extracto crudo Precipitación (NH 4) 2SO % DEAE- Sepharosa Fenil- Sepharosa (mu/ml) Total (mu) Proteína Total (mg) Act. especifica (mu/mg) Recuperación (%) Purificación (veces) 22, ,27-33, , , Afinidad ,2 En el laboratorio usted cuenta con un método de detección de la concentración de N20D que emplea de anticuerpos específicos. Además cuenta con los reactivos para la determinación de proteínas mediante Lowry y Biuret, cuyos rangos de sensibilidad son mg/ml y mg/ml respectivamente. Recuerde que para Lowry se emplea 0,2 ml muestra en volumen final de 1,3 ml; y para Biuret, 0,5 ml muestra en volumen final de 2 ml. Dado que se cuenta con cubetas de 0,2 ml los volúmenes de las colorimetrías se pueden reducir. a- Complete la tabla y evalúe la marcha de purificación. Eliminaría alguna etapa? Cúal? Por qué? b- Con qué criterio elige el método para determinar la concentración de proteínas en las muestras correspondientes a la cromatografía de afinidad y la DEAE-Sepharosa. Especifique los volúmesy/o diluciones a emplear en cada caso. c- Indique que volúmenes debe utilizar de (NH4)2SO4 saturado para llevar a cabo la precipitación fraccionada.

3 Problema 4. PARCIAL Problema 1 La enzima aspartato transcarbamoilasa (ATCasa) de la bacteria gram negativa Escherichia coli es una enzima oligomérica formada por 6 subunidades catalíticas idénticas (subunidad C) y 6 subunidades regulatorias (subunidad R). Con el objetivo de caracterizar funcionalmente a la ATCasa, un grupo de investigadores de nuestra facultad realizó como primera etapa de su trabajo la purificación de dicha enzima. Para ello partió de 250 ml de extracto crudo conteniendo ATCasa en su forma soluble. A partir de este extracto realizó una precipitación fraccionada con sulfato de amonio 40-70%. El precipitado obtenido fue resuspendido en 20 ml de buffer fosfato, ph=8 y con esta solución el grupo argentino realizó una cromatografía de afinidad empleando una velocidad de flujo de 4 ml/h. Para analizar la marcha de purificación realizaron medidas de la actividad enzimática y determinaron concentraciones proteicas en muestras obtenidas en los distintos pasos de la purificación. Para la determinación de la concentración proteica emplearon el método de Bradford usando como estándar a la seroalbúmina bovina (BSA). Tanto para las muestras problema como para la curva de calibración emplearon 5 µl de muestra y 250 µl del reactivo de Bradford. Para los eluatos de la columna de afinidad, el grupo tomó 10 µl de cada fracción para llevarlo a un volumen final de 20 µl finales. De esta dilución luego tomaron 10 µl y se llevó a volumen final de 25 µl con agua bidestilada. A una alícuota de esta última dilución se le practicó la reacción de Bradford. La absorbancia medida para la muestra tratada según se indicó con el reactivo de Bradford fue de 0,673. Curva de calibración: Patrón BSA: 1,5 mg/ml BSA Abs (µg/µl) nm 0 0,413 0,422 0,2 0,501 0,503 0,3 0,649 0,74 0,4 0,706 0,721 0,5 0,794 0,812 En el siguiente cuadro se muestra en forma esquemática los resultados de la marcha de purificación: Proteínas(mg/ml) Grado de Rendimiento total (UE)* específica (UE/mg) purificación % Extracto crudo 4, Precipitación 2,1 6,83 Columna de afinidad (UE)* cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 umol de carbamoil fosfato por minuto en condiciones óptimas de reacción El grupo argentino para avanzar en el conocimiento sobre la regulación enzimática de la ATCasa decidió trabajar con subunidades modificadas mediante ingeniería genética. En particular emplearon una subunidad catalítica no activa obtenida por un grupo alemán. La subunidad catalítica no activa de dicho grupo (mutante K105A) presenta un cambio de Lys del sitio activo en la posición 105 por una Ala. Esta sustitución de aminoácidos hace que la proteína pierda casi completamente su actividad pero deja intacta la capacidad de la proteína (proteína mutante) de adoptar la conformación nativa. El grupo argentino obtuvo además una variante activa de la subunidad catalítica C que contiene 6 Asp en el extremo carboxilo terminal, subunidad que denominaron 6D-C. A partir de las distintas subunidades el grupo decide obtener distintas proteínas con distinta relación de subunidades salvajes y mutantes para lo cual debieron realizar y seguir varios protocolos. Así para obtener la proteína (6D-C) 1(K105A) 5(R) 6 siguieron un protocolo de 2 pasos consistente en: Paso I: a. Sabiendo que los monómeros 6D-C y K105A en ausencia de subunidad reguladora (R) forman trímeros, los investigadores mezclaron cantidades equimolares de los trímeros (6D-C) 3 y de (K105A) 3 en una solución de urea 5 M con una incubación de 4hs. Posteriormente se realizó una diálisis de

4 la muestra durante 24hs en presencia del buffer Tris-AcNa ph=8.3. En estas condiciones sólo se forman trímeros. b. La solución resultante de la diálisis se procesó en una columna de intercambio de aniones (Source-Q resin) equilibrada con solución 40 mm de KH 2PO 4 buffer a ph=7,0. La columna se eluye con un gradiente lineal de NaCl entre 0 y 0.5M en 40mM de KH 2PO 4 buffer ph=7,0. El resultado de este proceso se muestra a continuación: Paso II: c. El material obtenido del pico 2 se mezcló con el homotrímero del pico 1 del cromatograma y con cantidades en exceso de subunidad regulatoria salvaje (R) que no se une a la columna. El ph de esta solución fue 7.0. En este caso no se realizó incubación con urea. La mezcla así obtenida fue sometida a otra cromatografía de intercambio aniónico y eluída en forma similar la anterior. El resultado fue el siguiente: Para avanzar en el análisis de lo obtenido, se realizaron corridas electroforéticas. Así, la fracción sembrada en la segunda cromatografía de intercambio aniónico se sometió a una electroforesis empleando geles nativos (calle 0). En dicho gel se incluyeron además las fracciones 5, 6 y 7 (calles 1, 2 y 3 respectivamente). El resultado obtenido se muestra a continuación: Preguntas 1- Complete la tabla de la marcha de purificación. 2- Describa cómo procedió experimentalmente para realizar la precipitación con sulfato de amonio e indique qué volúmenes usó de la solución saturada? 3- Enumere los pasos experimentales que se requieren hacer para llevar a cabo una cromatografía de afinidad. Proponga algún método de elución para la proteína de interés. Determine en qué volumen obtuvo la proteína de interés 4- Considerando que quiere cristalizar a la proteína, analice los resultados de la marcha de purificación e indique si modificaría o agregaría algún paso. Justifique.

5 5- Puede afirmar que la ATCasa luego de la purificación está libre de proteínas contaminantes? Justifique. Si su respuesta es negativa indique cómo investigaría esta cuestión. 6- Describa de modo resumido cómo avanzaría experimentalmente para determinar las características estructurales (PM, subunidades, tipos de uniones/interacciones, etc) más relevantes de la ATCasa. Justifique. 7- Teniendo en cuenta los pasos del protocolo para la preparación de (6D-C) 1(K105A) 5(R) 6 por qué cree que fue necesario modificar el extremo C-terminal de la subunidad catalítica C (6D-C) 8- Explique el fundamento del la cromatografía de intercambio iónico y especifique las metodologías de elución. Los resultados obtenidos en el cromatograma, resultarían iguales si usted en lugar de emplear para la elución un gradiente salino emplea un gradiente de ph? Justifique 9- Indique a qué especie proteica corresponde cada pico en el primer cromatograma. Puede asegurarlo o necesita realizar otro ensayo confirmatorio. Justifique 10- Sabiendo que la forma (6D-C) 1(K105A) 5(R) 6 se corresponde a alguno de los picos del segundo cromatograma, indique cuál de ellos colectaría y por qué. 11- Qué especie química supone que se encuentra en el pico que antecede al pico 5 en el segundo cromatograma? 12- Interprete los resultados obtenidos en la electroforesis Podría explicitar a qué se corresponde cada banda del gel? Esperaría obtener el mismo resultado si en lugar de emplear un gel nativo emplearía un gel desnaturalizante con SDS y betamercaptoetanol? y un gel con urea? 13- Ud. cree que las proteínas de estructura cuaternaria cumplen con el experimento de Anfinsen? Cuáles son las principales conclusiones de este experimento? En particular al caso de la ATCasa y según la información detallada en los Pasos I y II, cumple esta enzima con el experimento de Anfinsen? Problema 5. Parcial. Una herramienta esencial en Biología Molecular es la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR. La misma consiste en varios ciclos de replicación in vitro del ADN, de forma que al final de la misma se obtienen varias copias de una secuencia de ADN empleada como molde. El tamaño de la secuencia de ADN obtenida al final de la reacción depende de las secuencias oligonucleotídicas que se emplean como cebadores. En los comienzos, dicha reacción se llevaba a cabo con ADN polimerasa I de la Escherichia coli (pol I). En particular se preparaba una mezcla de reacción consistente en el ADN molde que se quería replicar, los cebadores que se unen específicamente al ADN molde de forma que la ADN polimerasa pueda catalizar la polimerización a partir del extremo 3 de dichos cebadores, el buffer de reacción y la ADN polimerasa I. Para que ocurra la replicación se requiere primeramente que las hebras de ADN molde se separen (desnaturalización), luego que los cebadores se unan al ADN molde (hibridación o annealing) y finalmente que la polimerasa catalice la polimerización (polimerización o extensión). Estos tres pasos (desnaturalización, annealing y polimerización) que en conjunto se denominan ciclo de la PCR, se logran in vitro mediante cambios de temperatura. Para lograr una cantidad de ADN sintetizado alta lo que se hace es repetir varias veces el ciclo de la PCR, en general de 30 a 40 veces. Como la ADN polimerasa pol I utilizada primeramente es sensible a la temperatura, la misma debía agregarse luego de cada ciclo de replicación ya que los cambios de temperatura alteraban la actividad de la misma. Con el descubrimiento y caracterización de la ADN polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus, también conocida como Taq polimerasa, ha sido posible realizar las repeticiones de los pasos de replicación de la PCR sin necesidad de agregar la enzima en cada síntesis de ADN. Esto se debe a su alta estabilidad térmica (T. aquaticus es un archaea que vive en ambientes con muy altas temperaturas), siendo su temperatura óptima de catálisis de 72oC. Desde su caracterización muchos han sido los intentos en obtener altos rendimientos de esta enzima. En 1990 se ha descripto un método sencillo para purificarla a partir de una bacteria que contiene un plásmido multicopia (muchas copias de plásmido por bacteria) de 7,8 kpb que lleva la secuencia codificante de la Taq polimerasa. Todo el procedimiento de purificación, que requiere de 8 a 10 horas, consiste de la obtención de una suspensión bacteriana con alta cantidad de bacterias, un tratamiento térmico a 65 C por 1 h de dicha suspensión, seguido de una precipitación de la enzima con polietilenimina (PEI), una precipitación salina y una elución de una columna de intercambio iónico Carboxi metil celulosa.

6 En la Tabla 1 se muestra el protocolo de purificación de la Taq polimerasa a partir de la bacteria que contiene al plásmido antes mencionado. En la determinación de la cantidad de proteínas obtenida luego de la precipitación con PEI (segundo paso de purificación) se empleó el método de Lowry utilizando 200 µl de muestra en un volumen final de 1,3 ml. Para llevar a cabo el procedimiento se tomaron 2 µl de los 2,5 ml obtenidos en esa etapa, a los cuales se les agregó 198 µl de agua para completar los 200 µl requerido en la metodología utilizada. Empleando la curva de calibración se pudo determinar que en el tubo de colorimetría conteniendo la muestra problema la concentración de proteínas fue de 10,46 µg/ml. Tabla 1. Etapa de ADN polimerasa* Purificación Proteinas Rendimiento total (veces respecto (mg) (%) (µci 32P específica etapa uno) incorporado min-1) Tratamiento térmico Precipitación con PEI 76,06 Precipitación salina Intercambio iónico 1,8 585 *La actividad se midió a través de la incorporación de 32P en el ADN a partir de una mezcla conteniendo dgtp, dttp datp y dctp, cada uno en una concentración 100 µm, y [α-32p] datp 10 µm con una marca de 0,1 µci/µm. Se realizó un análisis electroforético de distintas muestras de la marcha de purificación, cuyo resultado se muestra en la figura a continuación: Figura 1: Electroforesis en gel de poliacrilamida conteniendo SDS de las distintas muestras obtenidas en la marcha de purificación de la Taq polimerasa. Las muestras proteicas fueron sembradas con buffer de carga Laemmli 4x Referencias del gel Calle 1: marcadores de PM con 95, 55, 43, 36, y 29 kda. Calle 2: extracto crudo. Calle 3: fracción obtenida después del tratamiento térmico. Calle 4: fracción obtenida al precipitar con PEI. Calle 5: fracción obtenida por precipitación salina. Calle 6: fracción obtenida luego de la cromatografía de intercambio iónico. La muestra purificada obtenida luego de la marcha fue cargada en una columna de exclusión molecular Sephadex G-200 (1.0x90 cm) equilibrada con buffer fosfato 0.05 M, ph = 7. La elución enzimática fue realizada con buffer fosfato 100 mm ph = 7 a un flujo de 0.2 ml/min. Se colectaron fracciones de 3 ml sobre las que se midió actividad ADN pol y Abs 280 nm. En la determinación del PM de la enzima se emplearon las

7 siguientes proteínas como calibrantes de peso molecular: sero albúmina bovina (66 kda), alcohol deshidrogenasa (150 kda), β-amilasa (200 kda), apoferritina (443 kda). ADN pol (µci 32 P incorporado min -1 ) Figura I: Cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-200 ADN pol (µci 32 P incorporado min -1 ). Abs 280 nm. Curva de Calibración para determinar PM log PM Ve/Vo 5,6 1,2 5,2 1,6 5,1 1,7 4,9 2 La tabla de la izquierda muestra los valores de la curva de calibración llevada a cabo para la Cromatografía de exclusión molecular. El valor de Ve/Vo determinado para las fracciones 11 y 12 es de 1,46 Pregunta A Complete la tabla de purificación. Eliminaría algún paso de la purificación?. En caso de una respuesta afirmativa indique cuál sería el paso eliminado y el por qué de dicha eliminación Ud. tiene que repetir en el laboratorio toda la marcha de purificación. Afortunadamente cuenta para ello con todos los datos que empleó con anterioridad un compañero suyo. Sin embargo cuando hace la revisión del protocolo está borroneado el volumen que empleó para hacer la cromatografía de Intercambio iónico y no puede distinguir si dice 200 µl o 2000 µl. Qué diferencia observaría en el cromatograma si Ud emplearía uno u otro volumen?. Justifique la respuesta incluyendo los cromatogramas en uno y otro caso. Indique si es necesario realizar algún tratamiento de la muestra antes de sembrar la columna de intercambio íonico. Justifique Cómo realizaría la elución de las proteínas de la columna de Intercambio iónico? Pregunta B Para realizar la siembra de la muestra en el gel de SDS-PAGE usted dispone en el laboratorio de 2 buffers de carga que difieren solamente en la concentración de los componentes, uno está 2 veces más concentrado de lo que se requeriría en la siembra y otro 4 veces más concentrado. En qué situación emplearía uno u otro? Puede indicar algún polipéptido que Ud. piense que corresponde a la Taq polimerasa en la Fig. 1? Indique de ser posible el número de subunidades que constituyen a la Taq polimerasa. Puede establecerlo con seguridad? Explique brevemente qué entiende por estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de una proteína. Puede determinar la estructura cuaternaria de la Taq polimerasa en forma detallada a partir de los datos experimentales presentados? Realizaría algún otro experimento que le permita alcanzar esta información?