Bioquímica I Curso 2010 Seminario 2 Ácidos nucleicos

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1 1 Bioquímica I Curso 2010 Seminario 2 Ácidos nucleicos Clase I: Actividad a desarrollar por los alumnos Temáticas a abordar: Estructura de bases nitrogenadas, nucleósidos y nucleótidos. Tipos de ácidos nucleicos, ocurrencia (dsdna, ssdna, dsrna, ssrna). Reactividad química diferencial de DNA y RNA. Estructura de dsdna (B, A, Z). Estabilidad de la estructura: complementariedad y apilamiento de bases. Estructura secundaria y niveles estructurales superiores: superenrollamiento. Desnaturalización (variables que afectan la ) y cinética de renaturalización de ácidos nucleicos. Efecto hipercrómico. Repaso de la metodología de ultracentrifugación descripta en el seminario que hemos denominado Generalidades Bibliografía BIOQUÍMICA. Quinta/Sexta Edición Stryer / Berg / Tymoczko (Editorial Reverté) LEHNINGER. PRINCIPIOS DE BIOQUÍMICA Cox, M.M. - Nelson, D.L. (Editorial Omega) BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA Bruce Alberts. Voet, Voet: Biochemistry, 3rd Edition - Problema 1 Ud se encuentra en el laboratorio donde normalmente realiza sus tareas de investigación. En este momento en particular Ud recibe una muestra de un laboratorio extranjero con la sola información de que se trataría de una muestra que contiene ácidos nucleicos. Se trata de una muestra translucida y un poco viscosa. 1. Primeramente decide repasar algunas propiedades de los ácidos nucleicos de manera que luego pueda diseñar nuevos experimentos que le permitan avanzar en la caracterización de la muestra. En dicho repaso se contesta las siguientes preguntas: 1.1 Qué fuerzas estabilizan la estructura de los ácidos nucleicos? 1.2 Por qué el DNA pierde estructura a phs bajos y altos? por qué es estable en soluciones salinas diluidas cercanas a la neutralidad? 1.3 Por qué el DNA no es hidrolizado en las condiciones (NaOH 0,3 N a 37 C por 16 horas) que el RNA si? Esquematice el mecanismo de la reacción química. 1.4 Qué entiende por desnaturalización térmica? Qué es el Tm? 1.5 Qué efectos tienen los siguientes reactivos sobre el valor de la Tm de un dsdna y sobre dsdna? a) Agua desionizada b) 1M NaCl c) Urea 7 M d) Formamida 90% 1.6 Describa algún método físico que puedan ser utilizado para estimar la composición nucleotídica del DNA. Como será los resultados en caso de tener dos muestras de ADN de igual concentración pero una de ellas con alto contenido de GC y la otra con alto contenido de AT. 2. Habiendo respondido las preguntas anteriores diseñe al menos un experimento que le permita verificar que realmente la muestra enviada contiene ácidos nucleicos.

2 2 3. Una vez verificado que se trata de una muestra conteniendo ácidos nucleicos usted diseña una serie de experimentos que se describen a continuación con el objetivo de determinar la naturaleza de la muestra enviada y encuentra lo siguiente: a) Una transición abrupta de la absorbancia con el aumento de la temperatura, siendo la hipercromicidad del 30 %. Con un enfriamiento rápido se observa una pequeña disminución de la DO. b) El material no desnaturalizado forma una sola banda en un gradiente de densidad de CsCl a 1,77 g/ml. Al recuperarse el material del sobrenadante del gradiente se determinó que la cantidad del mismo fue aproximadamente 100 µg de ácido nucleico por ml (5 veces más diluído que las muestras originales). c) Luego de desnaturalizarlo por calentamiento y enfriado rápido se ultracentrífuga nuevamente, con lo cual desaparece la banda original y aparece una a 1,72 g/cm3. Dicha banda contiene la mitad del material capaz de absorber UV respecto de la anterior. d) Si el contenido del tubo se mezcla, luego de lo cual se mantiene a una temperatura intermedia (que permitiría la renaturalización) y se vuelve a centrifugar, la banda de 1,72 g/cm3 desaparece, y reaparece la banda original de 1,77 g/cm3, conteniendo todo el material capaz de absorber UV observado la primera vez. e) Se ultracentrifuga el material como se describe en el inciso (b) excepto que antes de la ultracentrifugación el material es tratado durante 1 hora a ph 12, y luego llevado a ph 7. El resultado de la ultracentriugación es igual al de (c), pero al aplicar el procedimiento (d) la banda de densidad 1,72 g/cm3 permanece. En base a los resultados obtenidos prediga la naturaleza de la muestra enviada Clase II: Primera Parte Temario: Desnaturalización y cinética de renaturalización de ácidos nucleicos. Complejidad de genomas (curvas Cot). Hibridación de ácidos nucleicos, aplicaciones. Problema 2 En los últimos cinco años se ha difundido el uso del término genómica para designar el conjunto de procedimientos utilizados por una nueva rama de la ciencia dedicada al secuenciamiento completo, análisis, y estudio comparativo de genomas (virales, procariotas, eucariotas). La genómica abre así perspectivas nuevas y de enorme potencialidad tanto para las ciencias básicas como para las disciplinas aplicadas. Uno de los aspectos de mayor interés estará ligado, por ejemplo, a la identificación precisa y a corto plazo de marcadores genéticos asociados al desarrollo de enfermedades específicas. Sin embargo, no hemos tenido que esperar el nacimiento de la genómica para conseguir los primeros datos que muestren características importantes de la estructura primaria de genomas completos. Con herramientas muy sencillas lo invitamos a que se retrotraiga a los años sesenta y haga uso Ud. mismo de conceptos sencillos que le permitan evaluar tamaños y características importantes de la estructura primaria de secuencias genómicas completas. Lo invitamos a leer y pensar sobre los siguientes experimentos cuya base encontrará en los libros de texto que están a su alcance: A) Conoce cuál es el comportamiento de un ADN de doble hebra ante un proceso de calentamiento gradual? Por qué? Se le ocurre alguna manera sencilla de poner en evidencia que lo que Ud. dice o leyó es correcto? Conoce alguna forma sencilla mediante la cual los cambios del ADN inducidos por la temperatura puedan ser expresados en forma cuantitativa y monitoreados en forma continua?. B) Qué sucede con la estructura del ADN si una solución calentada a 80 es posteriormente enfriada? El resultado es el mismo si el enfriamiento es gradual respecto de un enfriamiento rápido? Por qué? Cómo justifica su respuesta desde el punto de vista mecanístico? Podría dar alguna precisión sobre las etapas

3 3 (cinéticas) mediante las que el ADN cambia su estructura secundaria durante el enfriamiento? Cuál es el orden de reacción de cada una de ellas? Cómo se afecta la cinética de cada etapa ante un enfriamiento rápido, o un enfriamiento lento?. Se corresponden sus predicciones con los datos experimentales disponibles en la literatura? La situación a la que se llega después de un enfriamiento lento es (completamente) equivalente a la inicial? Por qué?. En base a estas consideraciones anteriores, con que ecuación de velocidad podría describir la fracción de ADN que ha modificado su estructura secundaria por acción del enfriamiento? Cuál es la expresión para el tiempo medio ( /2) de reacción del proceso? Depende el /2 de la concentración de ADN inicial? Es eso consistente con la cinética propuesta? C) Sabe que son los experimentos de cinética de reasociación de ADN (y de ácidos nucleicos en general)? Podría describir cuáles son las condiciones que hay que controlar en el experimento y cuáles son las variables del mismo? Cuál es la razón por la que muestras de ADN cuyas secuencias son de copia única presenten valores diferentes de Co /2 en la Figura 1? Puede completar la escala superior del gráfico? Si le resulta complejo contestar esta pregunta considere primero las siguientes cuestiones: Cómo define la complejidad de una secuencia de ADN?. Cómo se compara la complejidad (N) con el número de nucleótidos de la secuencia en cuestión?. Podría calcular las complejidades de las muestras de ADN cuyas curvas de reasociación se muestran en la Figura 1? Qué datos extrae de la gráfica y como relaciona los valores de Co /2 con N? Necesita datos adicionales? D) Por que la curva de reasociación que se presenta en la Figura 2 correspondiente a una solución de ADN humano presenta varias zonas sigmoideas a diferencia de las curvas de la Figura 1? Podría dar algunas características cuantitativas de las fracciones de ADN que corresponden a las diferentes zonas de la curva? Piense con optimismo que lo que Ud. está pensando ya lo pensaron quienes generaron los resultados que se presentan en la Figura 3. Cree que se podría estimar el tamaño de un genoma a partir de estudios de cinéticas de reasociación? Conoce la llamada paradoja-c referida al tamaño relativo de diferentes genomas? Si no la conoce mire la Tabla 1 y nuevamente piense Aunque ni Ud. ni nadie conoce todavía la secuencia completa del genoma humano, a partir de hoy ya sabe algunas de las características que dicha secuencia debe tener.

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5 5 A260 relativa Problema 3. Las curvas a la izquierda corresponden a experimentos de desnaturalización térmica de ácidos nucleicos distintos. Qué información puede obtenerse de la estructura secundaria y composición de bases de estos ácidos nucleicos? Temperatura (º C) Problema 4. La figura muestra las curvas Cot de dos DNAs aislados de dos virus diferentes. La curva de la izquierda (gris) representa la renaturalizaión del DNA del fago λ la de la derecha (negra) muestra la renaturalización del DNA de un virus de la poliedrosis nuclear (AcNPV), un baculovirus que infecta una oruga. a) Cuáles son los valores de /2 de los dos DNAs? b) Qué unidades tienen esos valores y cómo se determinan los valores de las concentraciones que se usan para obtener los valores /2 para cada punto de la curva? c) Por un método independiente (cite algunas alternativas) se determinó que el tamaño del DNA del fago lambda es 50 kb. En función de este dato, estime el tamaño del DNA de NPV DNA. Qué suposiciones deberían ser ciertas para poder usar estas curvas? Clase II: Segunda Parte Temario: Métodos de separación y purificación. Empleo de solventes orgánicos. Columnas. Sílica. Precipitación alcohólica. Repaso Ultracentrifugación, centrifugación en gradientes de densidad (métodos de velocidad y de equilibrio), intercalación de bromuro de etidio y densidad de flotación. Corridas electroforéticas. Geles de agarosa y poliacrilamida. Métodos de detección. Geles nativos y desnaturalizantes. Detección de secuencias específicas. Southern blot. Northern blot. Sondas. Métodos de cuantificación de ácidos nucleicos. Secuenciamiento de DNA, métodos. Escalas de secuenciamiento. PCR Bibliografía BIOQUÍMICA. Quinta/Sexta Edición Stryer / Berg / Tymoczko (Editorial Reverté) LEHNINGER. PRINCIPIOS DE BIOQUÍMICA Cox, M.M. - Nelson, D.L. (Editorial Omega) BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA Bruce Alberts. Voet, Voet: Biochemistry, 3rd Edition -

6 6 Problema 5. El DNA duplex lineal puede unir más bromuro de etidio que una doble cadena circular de igual peso molecular. Explique por qué. Cómo el bromuro de etidio puede ser utilizado para separar estas dos formas de ADN en una ultracentrifugación en gradiente de CsCl? Problema 6. Ud ha realizado un protocolo para purificar un plásmido pk18 mob de 3,7 kb de E. coli. Cómo verificaría que 1- realmente usted ha alcanzado su objetivo de obtener plásmido 2- que el plásmido obtenido se trata realmente de un plásmido cuyo tamaño es 3,7 kb 3- que el plásmido obtenido es el pk18mob Problema 7. En la figura se muestra el resultado de la secuencia de un fragmento de ADN de Escherichia coli. El procedimiento empleado fue el de Sanger. a- Indique cada uno de los pasos seguidos para la determinación de la secuencia. b- Indique las 30 primeras bases de la secuencia de la autoradiografía. Problema 8. En el experimento de Meselson y Stahl una muestra de DNA obtenida de bacterias luego de una marcación in vivo con, seguida por una generación cultivada en un medio con, fue desnaturalizada por calor antes de centrifugar en un gradiente de densidad de CsCl. Qué resultados vieron ver luego de llegar al equilibrio? Para qué sirven estos resultados? Clase III: Actividad a desarrollar por los alumnos Problema 9. En un hospital de esta ciudad se han obtenido 10 aislamientos de Escherichia coli de pacientes que presentaban fuertes dolores abdominales y vómitos. Se ha reportado una sintomatología similar en ciudades de Chile y Brasil. Los investigadores de estos países relacionaron la patogenicidad de los aislamientos con la expresión de una toxina que denominaron Shigatoxina I. Los investigadores observaron que la secuencia codificante de Shigatoxina I puede tener localización tanto cromosomal, como plasmídica. Se determinó la secuencia completa del gen shigatox I que codifica para Shigatoxina I (una proteína monomérica). a. Qué experimentos realizaría para determinar si los nuevos aislamientos argentinos presentan secuencias homólogas a la de la toxina Shigatoxina I? Es necesario incluir controles? cuáles? b1. En aquellos aislamientos provenientes de nuestra ciudad en los que se pudo confirmar la presencia de Shigatoxina I, indique qué procedimientos realizaría para determinar si la secuencia shigatox I se encuentra en el plásmido o en el cromosoma. b2. Con qué material de laboratorio debe contar para llevar acabo la metodología anterior? b3. Cuál es la importancia de esta localización diferencial? c. Puede usar los resultados obtenidos para determinar si se trata de bacterias relacionadas o se originan de brotes diferentes. Finalmente con el objeto de conocer exactamente la secuencia del gen en cuestión se envió a un centro en Korea el material para su secuenciación.

7 7 d. Explique en qué consiste la metodología de secuenciación de Sanger. e. Describa el método de secuenciación automática. Qué ventaja presenta? f. Qué material debe enviar y cómo lo transportaría? g. Indique qué reactivos se utilizan y para qué se sirve cada uno de ellos. h. Qué tipo de información espera recibir cuando le devuelvan los resultados? Una semana más tarde recibe un mail de la empresa en el cual le informan que al aplicar la metodología de Sanger para secuenciar un fragmento de 300 pb del gen shigatoxi se cometió un error en la concentración de ddgtp utilizado. La concentración fue 100 μm en lugar de 1 μm. La autorradiografía resultante mostraría: a- mayor espacio entre las bandas b- menor espacio entre las bandas c- una gran zona blanca en la parte inferior. d- sólo una pocas bandas de bajo PM en la mezcla de reacción. e- mayor cantidad de bandas en todo el rango de PM Problema 10 Recientemente se ha aislado una nueva especie bacteriana de la superficie de los dientes de pacientes que padecen Diabetes Mellitus. La misma podría estar asociada a mayor frecuencia de padecer caries en esas personas. Usted trabaja en el equipo de investigación encargado de la caracterización molecular del microorganismo, desconocido hasta ahora, y su director le encomendó en particular el estudio de los plásmidos que contiene dicho microorganismo. Para esto debe comenzar a trabajar en la obtención de los plásmidos y usted decide realizarla a partir de un crecimiento bacteriano en medio sólido. El 1 2 producto obtenido luego de la preparación lo analiza mediante corridas electroforéticas en geles de agarosa. A continuación se muestra el resultado obtenido Preguntas ,3-2, Indique los pasos que debe realizar en el laboratorio para poder obtener el o los plásmidos. Fundamente cada paso. 2- Describa lo que se observa en el gel Qué puede decir respecto de la preparación de plásmido que acaba de realizar? Puede sacar una única conclusión? Modificaría algún paso de su protocolo? 3- Mediante qué otra metodología distinta a la de una electroforesis podría haber evidenciado la presencia de ADN plasmídico en la preparación? Fundamente. 4- La muestra que obtiene con la segunda metodología que Ud. propone, cuando la corre en un gel como en el de la Figura resulta en una única banda a la altura del marcador de peso molecular de 6 kpb Con los datos experimentales que dispone, puede inferir el tamaño del plásmido? Justifique. Calle 1: patrón de PM en Kpb Calle 2 muestra problema