"Herramientas diagnosticas en el Laboratorio Clínico" Beatriz Livellara

Transcripción

1 "Herramientas diagnosticas en el Laboratorio Clínico" Beatriz Livellara

2 En el diagnostico de la Hepatitis B Es importante establecer: Hepatitis Aguda vs Hepatitis crónica En Hepatitis crónicas: estratificación del estado de replicación viral Respuesta a tratamiento antiretrovirales y desarrollo de resistencia Estado de replicación residual. Marcadores subrogantes del ccc-dna del HBV

3 Organización Genómica del VHB S Codifica las proteínas del AgsHB Core Codifica la proteína core y el AgeHB Polimerasa codifica a la enzima ADN polimerasa con actividad de transcriptasa reversa X proteina involucrada en la génesis de CHC, indispensable para replicación y propagación Dienstag JL. Management of Hepatitis B: A Case-Based Approach. Available at:

4 Marcadores Serológicos HBsAg: Antígeno de Superficie Anti-HBc (total): Anticuerpo anti-core total Anti-HBc (IgM): Anticuerpo anti-core a clase IgM Anti-HBs: Anticuerpo anti-hbs HBeAg: Antígeno e Anti-HBeAg: Anticuerpo anti-e

5 AntiHBs Inmunidad AntiHBc HBsAg HBeAg Anti HBcIgM ADN HBV ADN HBV ADN HBV Exposición Infección Replicación Infección Aguda

6 Inicio del diagnóstico de Hepatitis B Solicitar HBsAg y IgG antihbc Escenario 1 HBsAg (-) IgG antihbc(-) Sin contacto con HBV Vacunar contra VHB

7 Escenario 2 HBsAg (+) IgG antihbc(+) IgM anti HBc No reactivo Reactivo Infección crónica por HBV Infección aguda por HBV

8 Escenario 3 HBsAg (+) IgG antihbc(-) Repetir a los 30 días con una nueva muestra HBsAg (+) IgG antihbc(+) CASO CONFIRMADO HBsAg (+) IgG antihbc(-) Caso poco probable de infección por HBV Resultado NO REACTIVO para ambos marcadores Estudiar HBeAg/AntiHBe y carga viral HBV Vacunar contra HBV

9 Escenario 4 HBsAg (-) IgG antihbc(+) Realizar anti HBs Anti HBs (+) Hepatitis B resuelta Anti HBs (+) Hepatitis B resuelta Anti HBs (-) Iniciar Vacunación. Repetir a los 30 días AntiHBs (-) Estudiar carga viral HBV posible infeccion oculta AntiHBc aislado completar esquema de vacunación Caso confirmado de HBV OCULTA por HBV Falso positivo metodológico

10 Anti-HBc positivo aislado 1. Recuperación de infección aguda 2. Test no sensible para anti-hbs 3. Falso positivo 4. Mutante del HBsAg 5. Niveles no detectables de HBsAg Infección oculta (OBI)

11 Infección por HBV oculta Perdida HBsAg Hepatitis aguda Ac anti HBV nunca + HBcAc + HBV oculta HBcAc - Perdida HBsAg Aňos depues de una portacion cronica HBV DNA + Ac anti HBV Que se pierden con el tiempo Semin Immunopathol (2013) 35:39 52 DOI /s

12 Seropositiva HBsAg negativo antihbc positivo antihbs positivo / negativo antihbe positivo / negativo HBV oculta (OBI) HBV-ADN en hígado Seronegativa HBsAg negativo antihbc negativo antihbs negativo antihbe negativo HBV-ADN en suero <10 3 copias/ml HBsAg 1. No se produce 2. Se produce en concentraciones no detectables 3. Se produce una variante no detectable por los métodos convencionales 1. Virus 2. Hospedador

13 Caracterización de una crónica Hepatitis B HBeAg Anti HBeAg HBV-DNA cuantitativo.

14 Titulo Historia natural de la infección crónica Inmuno Tolerancia HBeAg Inmuno Clearence o Eliminación Portador Inactivo antihbe Reactivación VN Tiempo ALT N N HBV-DNA 2 X 10 ⁸ 2 X 10 9 < X (UI/mL)

15 Curso serológico HBsAg anti HBs HBc IgM HBc total HBeAg anti HBe Título HBV-ADN HBsAg + HBsAg antihbc + IgM anti-hbc Total anti-hbc años Semanas post exposición HBV-ADN + Infección crónica

16 Marcadores Moleculares HBV-DNA cuantitativo - Carga Viral. Mutantes pre-core Mutantes de Resistencia a antivirales Genotipos de HBV NAT en banco de sangre

17 Detección de HBV-DNA cualitativo Aplicaciones: Definición de replicación activa del HBV en pacientes con patrón compatible con infección crónica Definición de infección HBV oculta (HBsAg negativa) Monitoreo de respuesta de tratamiento antiviral Métodos: comerciales, no comerciales Límites de detección: 5-50 copias/ml Aplicación principal: TAN en bancos de sangre con métodos comerciales específicos para este objetivo diagnóstico

18 Detección de HBV-DNA cuantitativo Carga Viral Permite detectar y cuantificar la viremia Sólo se utilizan métodos comerciales Estandardización de las unidades de cuantificación del HBV DNA en UI/ml La alta sensibilidad de métodos como Taqman permiten usarlo como test cualitativos (Sensibilidad analítica de 6 UI/ml)

19 Usos de DNA-HBV cuantitativo Diagnostico de estadío Riesgo de transmisión Riesgo de progresión Selección del paciente a tratar Indica respuesta al tratamiento Diagnostica resistencia del HBV

20 Carga viral y evolución de la infección (REVEAL) Incidencia de HCC (%) (n = 3653) RR de cirrosis (n = 3482) Carga Viral inicial < 300 (No detectable) 300-9,999 10,000-99, , ,999 1 Million Chen CJ, et al. JAMA 2006 Iloeje UH, et al. Gastroenterology 2006

21 Diagnóstico molecular Secuenciación: Gold Standar Genotipos (A-H) Mutaciones: Pre-core/ promotor del precore Superficie: escape a la vacuna Polimerasa: Resistencia a antivirales

22 Patrones de Resistencia Secuenciación : gold-standard INNO-LiPA HBV Drug Resistance Assay PCR-RFLP para búsqueda de mutaciones mas comunes

23 Genotipos HBV Potenciales diferencias biológicas entre los genotipos de HBV * Tasa de replicación del HBV * Eliminación natural del HBeAg. * Expresión y reconocimiento de los epítopes inmunes. * Evolución de la enfermedad Hepática * Patogénesis * Asociación con desarrollo de cirrosis y hepatocarcinoma * Sensibilidad a la terapia antiviral.

24 En el presente : Valores indetectables de HBV-DNA sérico, aún con ensayos de alta sensibilidad, no implican la ausencia o clearence de los virus ni de la infección viral La evaluación de la carga viral en diferentes momentos del tratamiento es utilizada como marcador de efectividad de la actividad antiviral y la persistencia de la respuesta Hasta el momento, no existen marcadores que identifiquen el logro de que el sistema inmune del paciente logra controlar efectivamente la infección viral y el progreso de la enfermedad

25 El Futuro. Detección de variantes minoritarias de escape al tratamiento : impacto de las nuevas tecnologías (Next Generation Sequencing) que permitirán detectar poblaciones en % inferiores al 1% Ensayos biológicos de fenotipos del HBV, permitirán correlacionar los hallazgos genotípicos minoritarios con respuesta biológica y sentido clínico de las mismas. Detección y cuantificación del ccc-hbv-dna HBsAg cuantitativo: Marcador subrogante de ccc- HBV-DNA

26 Hepatitis C

27 Hepatitis C La enfermedad aguda dura aproximadamente 6 meses 25 % de las personas infectadas eliminan el virus 75 % llegan a desarrollar la enfermedad crónica La enfermedad crónica se define como que dura más de 6 meses

28 Hepatitis C y su efecto sobre el hígado 1 de cada 3 pacientes desarrollan cirrosis grave durante un período de 20 años La cirrosis conduce a un daño permanente del hígado Puede conducir a cáncer de hígado Muerte prematura (British Liver Trust 2009)

29 Estructura del virus C Proteínas de la Cápside Bicapa lipídica 2 glicoproteínas de Envoltura E1,E2 RNA viral Envoltura Género: Hepacivirus, Familia: Flaviviridae Tiene 6 genotipos y más de 100 subtipos El HCV no se integra en el genoma del huésped Producción diaria: 1012 viriones Genoma: 9600 nucleótidos

30 Infección Aguda con Recuperación

31 Titulos Infección Aguda con Progresión a la Cronicidad anti- HCV HCV RNA ALT Normal

32 Por qué solicitar el test de HCV? Realizar diagnóstico precoz Derivación precoz para la evaluación del especialista y oportunidad de un tratamiento temprano Se podría tener éxito aclaramiento de la enfermedad (hasta 80 % ) Reducir la transmisión

33 Recomendación del Testeo HCV Basado en el grupo de riesgo Drogadictos IV Aquellos que recibieron factores antes de 1985 Receptores de sangre/organos antes de 1993 Hemodialisados crónicos Enfermedad hepática Basado en la exposición Trabajadores de la salud, emergencias,etc despues de injuria con aguja de un individuo HCV+ Chicos nacidos de portadora HCV+ ( DOH Get Tested Get Treated Campaign 2009)

34 HCV TECNICAS DE DIAGNOSTICO Serologicas: EIA (screening) RIBA (confirmatoria)

35 Solicitar anti -HVC Reactivo No reactivo Estudiar ARN-HVC Caso descartable por HCV Detectable No detectable

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37 DIAGNOSTICO POR BIOLOGIA MOLECULAR Ensayos : Cualitativos Genotipificación Cuantitativos

38 Técnicas Moleculares: Indicaciones en Infección por HCV Diagnóstico Serología indeterminada Primoinfección asintomática Recién nacido de madre HCV positiva Contacto de alto riesgo Pronóstico y seguimiento de tratamiento Evaluación indirecta de resistencia

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44 Utilidad Clínica de la Carga Viral HCV Infección aguda: Altos niveles de RNA antes de la seroconversión Evaluación del estado de la enfermedad, pronóstico (progresión vs estabilidad) Monitoreo de la terapia antiretroviral, iniciación, mantenimiento, falla-resistencia

45 Detección de Genotipos/Tratamiento Genotipos (11): Seis (1,2,3,4,5, 6 ) son generalmente tratados Estos difieren entre un 31-34% en la secuencia de sus nucleótidos en el extremo 5 Subtipos: con letras a,b,c,etc. Aproximadamente son 100: estos difieren entre % en sus bases en toda la longitud de la secuencia genómica Utilidad: de acuerdo al genotipo hallado, se implementara el tratamiento adecuado

46 Métodos de Genotipificacion Secuenciación : gold-standard INNO-LiPA PCR-RFLP para búsqueda de mutaciones mas comunes

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48 Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLP

49 Una Población Difícil Anti-HCV positivo RIBA indeterminado HCV RNA negativo Falso positivo o expuesto no virémico? (infección de larga data) Analizar el patrón de reactividad Verdaderos (+): c22 y c33 Falsos (+): c100 y NS5

50 Avanzando en el Diagnóstico Diferencial Anti-HCV (+) HCV RNA PCR (-) HCV RNA PCR (+) RIBA (-) RIBA (+) ALT Elevada ALT Normal Falso (+) Infectado No Virémico Biopsia Hepática Seguimiento (ALT) Seguimiento (ALT y PCR) Viremia Genotipo

51 Conclusiones Los métodos de detección cualitativos prácticamente están en desuso Solo los métodos con límite de detección > 15 UI/Ml son utilizables en el contexto de los nuevos tratamientos Un resultado detectable no cuantificable, entre el límite de detección (25 UI/mL) y el límite de detección (15 UI/mL) debe considerarse positivo para la toma de decisiones sobre respuesta temprana, suspensión o reactivación post-suspension del tratamiento Existen métodos que presentan límites de cuantificación y detección diferentes

52 Conclusiones Valores superiores al limite máximo de cuantificación no requieren diluciones en función de que los nuevos esquemas plantean requerimientos de disminución de la carga viral que no están relacionados con el valor inicial del tratamiento Se recomienda medir la carga viral con el mismo método y en el mismo laboratorio en lo posible Asimismo, se recomienda a los laboratorios que realicen estos ensayos que estén suscritos a programas de control de calidad o que tengan acreditadas esta técnica ante requisitos internacionales (CAP ISO 15189)

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54 Muchas gracias!!!!