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- Vicenta Figueroa Rodríguez
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1 Bioq. María Elina Acevedo Biología Molecular Fundación Hemocentro Buenos Aires
2 Tamizaje de infecciones transmisibles por transfusión en Argentina (Ley Ley Nacional de Sangre ) HVB: Enzimoinmunoensayos HBsAg y anti-hbc total HCV :Enzimoinmunoensayo anti- HCV HIV1/2 : Enzimoinmunoensayo ag-p24 y anti-hiv1/2 HTLV I/II: Enzimoinmunoensayo anti-htlv I/II Chagas : 2 ELISA de alta sensibilidad y especificidad. (1 recombinante y 1 lisado de parásito) anti- Tripanosoma cruzi Sífilis: Test de VDRL anti- Treponema pallidum Brucelosis: Reacción de Huddlesson, anti-brucella abortus
3 TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR TRANSFUSIÓN Métodos indirectos: detección en la sangre (suero o plasma) del donante de la presencia de una respuesta inmune contra un patógeno dado Diagnóstico serológico mediante diferentes técnicas de laboratorio Ej.: análisis en búsqueda de anticuerpos específicos contra HIV en el suero del donante (EIA anti-hiv 1/2) Métodos directos: detección directa de la presencia del patógeno (genoma o antígenos) en la sangre del donante Ej.: EIA para detectar p24 HIV, HBsAg o HCV ag Técnicas de biología molecular: buscan el DNA o RNA viral
4 Factores de riesgo en la transmisión de infecciones por transfusión Errores humanos o de laboratorio Problemas en los sistemas de análisis/equipos Insuficiencias en la calidad de los análisis Entrenamiento deficitario Seroconversiones atípicas Variantes o genotipos del patógeno no detectadas Cambios epidemiológicos Período de ventana serológico
5 Período Ventana tiempo entre el momento de la infección y el desarrollo de marcadores serológicos Período Ventana: NAT Reacción inmune Eclipse Reactivo Serológico Infección Tiempo
6 OBJETIVO DE NAT O DGV: DISMINUCIÓN DEL PERÍODO DE VENTANA NAT positivo Eclipse Virus Infección Período Ventana Reactividad Serológica Reacción inmune Tiempo Detección más temprana
7 Período Ventana Model Testing Data Fuente: Busch et al. Transfusion.2005;45(2): Kleinman and Busch. Transfusion. 2006;36:S23-S29
8 VENTAJAS NAT VIRUS Pruebas serológicas NAT MP (Minipool) NAT ID (Individual) VIH (incluye p24) 16 días 10 días 7 días VHC 70 días 9 días 7 días VHB 59 días 49 días 38 días Acortamiento del período de ventana inmunológico Disminución del riesgo residual
9 RIESGO RESIDUAL Es la probabilidad de que una unidad sea infecciosa y sea donada en el período de ventana antes de la seroconversión. Está directamente relacionado con la incidencia de la infección y la longitud del período de ventana. Schreiber et al. NEJM, vol 334; Jun 1996
10 RIESGO RESIDUAL ASOCIADO A LA LONGITUD DEL PERÍODO DE VENTANA LONG. DE PERÍODO DE VENTANA (días) RIESGO RESIDUAL (por millón de donaciones) HIV 22 (6-38) 2.03 HCV 82 (54-192) 9.70 HBV 59 (37-87) 6.65 Schreiber et al. NEJM, vol 334; Jun 1996
11 TÉCNICAS BASADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR Involucran tres etapas: 1. Extracción o captura del genoma viral 2. Amplificación 3. Detección Ejemplos: PCR(Polymerase Chain Reaction) Q-PCR (Real Time PCR) NASBA (Nucleic Acid Based on Amplification) TMA (Transcriptional Mediated Amplification)
12 PUNTOS IMPORTANTES A CONSIDERAR EN CUANTO AL ORIGEN DEL MÉTODO A ELEGIR: Sensibilidad Especificidad Detección de variantes/subtipos Reproducibilidad Trazabilidad de reactivos y resultados Software adecuado Control Interno Control de Contaminación Ensayos discriminatorios/confirmatorios Identificación de su uso: RUO o IVD Marca CE, FDA, ANMAT
13 COMPARACIÓN DE LA SENSIBILIDAD ANALÍTICA DE LOS TEST NAT 95% Límite de Detección (95% CI) Ensayo HIV (Cop/ml) Procleix TMA* ( ) HCV (IU/ml) 2.78 ( ) HBV (IU/ml) 7.46 ( ) AmpliScreen* Std preparation ( ) ( ) ( ) AmpliScreen* Multiprep Cobas TaqScreen MPX Test - S201 Cobas TaqScreen MPX Test - S201 V ( ) 49 ( ) 50.3 ( ) 28.8 ( ) 11 ( ) 6.8 ( ) 4.41 ( ) 3.8 ( ) 2.3 ( ) * Roche s COBAS AmpliScreen, TaqScreen MPX test S201 and MPX v2.0 US Package Inserts or Procleix Ultrio CE Package Insert
14 DISEÑO, ACONDICIONAMIENTO E INFRAESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Metas principales para la instalación: Proporcionar el espacio suficiente para el flujo de trabajo y mantenimiento de equipos Evitar la contaminación Mantener la correcta temperatura, humedad y presión del ambiente
15 ÁREAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Área de preparación de reactivos y muestras Área pre-amplificación Área post-amplificación y detección Se definen las diversas áreas mediante barreras físicas o protocolo de barreras entre un área de trabajo y otra. Objetivo: evitar la contaminación entre áreas de trabajo diferentes
16 ÁREAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Pre-Amplificación Post-Amplificación
17 PCR Copiar o amplificar millones de veces secuencias de ADN o ARN. Extracción de Ácidos Nucleicos - Amplificación- detección. Amplificación: master mix polimerasa, transcriptasa reversa (ARN), primers, dntps, SO4 Mg2, Buffer. Detección: electroforesis en gel de agarosa
18 PCR punto final (end point) Los datos son recolectados cuando reacción se ha completado. Consumo de reactivos y acumulación de inhibidores. Diferencias en valores de F final. Contaminaciones.
19 REAL TIME PCR - qpcr Mide fluorescencia en cada ciclo Aumento en F es directamente proporcional al nº amplicones generados en fase exponencial
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21 SISTEMAS DE DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA DNA- binding agents: SYBR Green y Eva Green Primers fluorescentes: LUX fluorogenic primers, Amplifluor qpcr primers. Sondas fluorescentes: TaqMan probes, Scorpions, Molecular Beacons.
22 Sondas TaqMan
23 SONDAS TaqMan
24 SISTEMAS DE DETECCIÓN FLUORESCENTE
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27 Cobas TaqScreen MPX v2.0 en cobas TaqMan s201
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29 EXTRACCIÓN AN AMPLIPREP 1) Sc proteinasa: digiere las proteinas, inactiva nucleasas, lisis, liberación ADN y ARN. 2) Rvo de lisis: lisis, inactivación de nucleasas por desnaturalización de proteínas. 3) Sílica magnética: carga neta positiva sílica se une a carga negativa de AN en pres. de sal caotrópica + fuerza iónica. 4) Reactivo de lavado: elimina sustancias no unidas e impurezas: prot. desnat, restos celulares, hemoglobina, exceso sales. 5) Tampón de elución: El AN se libera de la sílica magnética.
30 CONTROLES MPX v 2.0 MPXM MPX O HIV-1 M HBV HCV HIV-1 O MPX 2 MPX (-) HIV- 2 C. NEG
31 NAT Parvovirus B19 Adultos 50% Benigna autolimitada en inmunocompetente Enf severa: -embarazadas -Aplasia de células rojas -Inmunosuprimidos Transfusión concentrados de Factor VIII Disminución con inactivación viral, pero continúa por Resistencia de B19 a inactivación viral
32 NAT Parvovirus B19 Seroconversión en receptor cuando CV> c/ml. B19 no se transmite por albúmina o IVIG => Minipool NAT B19 para asegurar q plasma enviado a planta de hemoderivados < 10 4 c/ml de B19 DNA
33 NAT HAV Viremia = eliminación fecal, precediendo a los síntomas 7-14 dias. Viremias bajas: c/ml Transmisión por factor VII y IX
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